可用体外翻译获得的可溶天然型EGFP的表达

目的构建能在体外大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的pET28a-EGFP原核表达载体。方法以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,EcoR I和Hind III双酶切EGFP基因序列和pET28a载体。T4 DNA连接酶连接,转化大肠埃希菌DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定。将pET28a-EGFP转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,观察荧光。体外翻译系统中加入重组pET28a-EGFP载体,孵育后观察荧光。免疫印迹法(Western blott)鉴定EGFP。结果测序证实pET28a-EGFP中的EGFP基因序列与GenBank中序列完全一致,荧光显微镜下观察到大肠埃希菌BL21(DE3)和体外翻译系统中强烈荧光,West-ern blot结果显示相对分子质量约为27 000的EGFP高效表达。结论成功构建了能在体内和体外稳定表达的可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步体外筛选抑菌药物提供了可靠的报告载体。     

肺炎链球菌噬菌体裂解酶CPL-1的克隆表达、纯化和抑菌活性鉴定

目的利用基因工程方法制备肺炎链球菌噬菌体裂解酶CPL-1。方法根据大肠埃希菌密码子偏爱性合成一段编码cpl-1的基因序列,克隆到表达载体pET28a中,构建出表达质粒pET28a-cpl-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达。结果重组CPL-1在大肠埃希菌中以可溶形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%。经胆碱类似物DEAE亲和纯化后,重组CPL-1的纯度大于97%。经体外抑菌活性试验证明其对肺炎链球菌具有明显的抑菌效果。结论噬菌体裂解酶CPL-1的开发利用为预防和治疗肺炎链球菌感染提供了新的方法。     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定

摘要：目的：制备有免疫原性的白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶（fructosebisphosphate aldolase, Fba1)重组蛋白。 方法：以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,用PCR法扩增Fba1 DNA序列,与克隆载体pMD18-T连接、测序,再与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组表达质粒pET28a(+)/Fba1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达,亲和层析柱纯化重组蛋白。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊为侵袭性白念珠菌病（ICAI）、且抗白念珠菌烯醇化酶抗体阳性的患者血清进行抗原性鉴定。 结果：Fba1 DNA序列与GenBank中的序列一致。在大肠埃希菌中获得白念珠菌Fab1重组蛋白的高效表达,表达产物以可溶性蛋白为主,最终蛋白质得率为7.6 mg/g湿菌。经免疫印迹鉴定,重组蛋白与抗His标签的单克隆抗体和确诊ICAI患者血清呈特异性反应,显示出良好的抗原反应性。 结论：成功制备了具有良好抗原反应性的重组蛋白,为建立特异性诊断ICAI的新方法打下基础。     

重组人肿瘤坏死因子(hTNF-α)在大肠埃希菌[E.coli BL21(DE3)]中表达条件的优化

目的构建人肿瘤坏死因子(hTNF-α)表达质粒,并对其进行鉴定,优化hTNF-α蛋白表达条件使之在大肠埃希菌中实现高效表达。方法应用PCR扩增技术获得hTNF-α基因片段并进行相应的鉴定,将鉴定后的hTNF-α基因克隆到pET24a载体中,获得pET24a-hTNF-α表达质粒。将此质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,并对其表达条件进行优化。结果成功构建了pET24a-hTNF-α质粒,PCR和酶切技术进行鉴定,结果显示与目的片段一致。将此质粒转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,得到最佳表达条件为:M9+LB培养基,37℃,0.5 mmol/L IPTG,pH值=7.5,诱导时间为5 h。优化后的菌体干重增高了2.56倍,hTNF-α产率增加3.68倍,hTNF-α表达率从9.38%增加到32.74%,增高了3.49倍。结论优化了pET24a-hTNF-α质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达条件,使hTNF-α蛋白得到高效表达。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21中的表达

目的：构建日本血吸虫（Sj）重组质粒 pGEX-Sj32并研究其在大肠埃希菌 BL21中的表达效率。方法从该实验室保存的 BL21（pET28α-Sj32）重组菌中抽提质粒 pET28α-Sj32,PCR 扩增 Sj32抗原编码基因,定向克隆入穿梭载体 pGEX-1λT,构建重组质粒 pGEX-Sj32。将重组质粒转化大肠埃希菌 BL21（DE3）,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达;表达产物用SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定。结果 PCR 成功扩增出 Sj32编码基因,并成功构建了重组质粒 pGEX-Sj32;SDS-PAGE显示相对分子质量约为58×103的重组蛋白,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21％;Western blot 显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论成功构建日本血吸虫重组质粒 pGEX-Sj32,该重组质粒在大肠埃希菌 BL21中得到了高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

藤黄微球菌RPF基因蛋白的克隆、表达与鉴定

目的构建表达藤黄微球菌RPF基因蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达获得基因重组蛋白。方法提取藤黄微球菌基因组DNA,以PCR扩增RPF基因,克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),在30℃用IPTG诱导3 h后进行SDS-PAGE分析。结果测序结果证实获得了藤黄微球菌RPF基因,其序列与GenBank中报道完全一致;SDS-PAGE分析表明,RPF基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达了重组蛋白,表达的蛋白量约占菌体蛋白的33.8%。结论成功克隆了藤黄微球菌RPF基因,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性及其功能奠定基础。     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1-319P的原核表达和鉴定

目的 制备白念珠菌烯醇化酶N端基因重组肤段EN01-319P并检测其抗原性.方法 选择与人烯醉化酶蛋白a-ENO同源性低的白念珠菌烯醇化酶肤段ENOI-319P,将其编码DNA序列克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导带有His标签的重组肽段的表达.用SDS-PAGE电泳分析...     

鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白的鉴定与免疫原性研究

目的 构建鼻疽诺卡菌NFA47650蛋白原核表达载体,诱导表达及纯化NFA47650蛋白,并分析其免疫原性.方法 根据鼻疽诺卡菌nfa-47650基因序列设计并合成引物,通过PCR扩增基因片段并构建pET30a(+)表达载体,导入BL21大肠埃希菌诱导表达并纯化.制备NFA47650小鼠抗血清,通过Western Bl...     

嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β内酰胺酶的序列分析及原核表达

目的对嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β内酰胺酶基因进行测序、原核表达。方法PCR扩增L1酶的编码基因，将其亚克隆入pUCm—T载体后测定核苷酸序列，将u酶基因克隆至表达载体pET-41a( )后在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况，等电聚集电泳测定表达蛋白的等电点。结果本实验中L1的编码基因与国外同类酶的氨基酸同源性为92．44％。此L1酶基因可在大肠埃希菌BL21(DE3)中大量表达，等电点为6．7。结论对L1型金属β内酰胺酶的克隆测序及成功表达为进一步研究该酶的分子生物学特性奠定了基础。