可用体外翻译获得的可溶天然型EGFP的表达

目的构建能在体外大量表达可溶性天然型增强绿色荧光蛋白(EGFP)的pET28a-EGFP原核表达载体。方法以质粒pEGFP-N1为模板扩增EGFP基因,EcoR I和Hind III双酶切EGFP基因序列和pET28a载体。T4 DNA连接酶连接,转化大肠埃希菌DH5α,提取载体,酶切和DNA测序鉴定。将pET28a-EGFP转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,观察荧光。体外翻译系统中加入重组pET28a-EGFP载体,孵育后观察荧光。免疫印迹法(Western blott)鉴定EGFP。结果测序证实pET28a-EGFP中的EGFP基因序列与GenBank中序列完全一致,荧光显微镜下观察到大肠埃希菌BL21(DE3)和体外翻译系统中强烈荧光,West-ern blot结果显示相对分子质量约为27 000的EGFP高效表达。结论成功构建了能在体内和体外稳定表达的可溶性天然型EGFP的pET28a-EGFP载体,为进一步体外筛选抑菌药物提供了可靠的报告载体。     

EGFP标记的hVEGF165重组腺病毒构建新方法及其相关特性的体外研究

利用细菌内同源重组法快速构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF165)重组腺病毒载体 ,并对其相关特性进行体外研究。首先将hVEGF165cDNA亚克隆到含EGFP基因的腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV中 ,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1共同电击转化大肠杆菌BJ5183 ,同源重组获得重组腺病毒质粒 pAd EGFP/hVEGF165,鉴定后通过脂质体法转染HEK2 93细胞 ,产生重组腺病毒Ad EGFP/hVEGF165。通过体外试验观察病毒的形态、均一性和安全性 ,靶细胞的感染效率及hVEGF165的表达情况。结果显示 ,通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP/hVEGF165;借助于EGFP的表达 ,直接在荧光显微镜下观测到靶细胞的感染效率和外源基因的表达。经纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 2× 10 12 pfu/ml。病毒感染Hela细胞后经多次传代未见细胞病变。以感染复数 (MOI) =10 0感染hUVEC可获得最大增殖刺激作用。同样浓度感染小鼠骨髓单个核细胞效率达 2 7.3% ,培养上清中hVEGF165蛋白含量达 1385± 332 pg/ 10 6cells。结论 :细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,辅以EGFP为标记基因可以直观检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。利用该     

新等位基因人类白细胞抗原B*15:133的鉴定及其原核表达

背景:国际上至2010-04共报告人类白细胞抗原4 633个等位基因,中国自2000年至少发现200个新的等位基因,由于资金和时间有限,大部分新等位基因未作血清分型、家系研究以及进一步的功能性研究.目的:在健康志愿者人群中发现新等位基因,并对其进行家系研究,同时构建重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,鉴定其在原核细胞中是否表达.方法:利用PCR-SSO和PCR-SBT技术,对人群的人类白细胞抗原进行筛选.使用血清学和SBT技术对拥有新等位基因的供者进行家系分析.用分子克隆的方法构建表达载体转染原核细胞,运用Western-blot鉴定是否表达.结果与结论:发现一个新等位基因与人类白细胞抗原B*15:18:01在第419位相差一个核苷酸,C->T, 即Codon116位 TCC->TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸.最终确定命名为人类白细胞抗原B*15:133.血清学表达B71(70)抗原.发现此供者的新等位基因来自于母亲.表达载体pET30a(+)- B*15:133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别.结果表明,使用分子生物学技术在大样本的筛查下发现了新等位基因人类白细胞抗原B*15:133,利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a(+)- B*15:133,并在原核细胞中有大量高纯度蛋白表达.     

腺苷脱氨酶三种原核表达载体的构建及蛋白表达

目的利用分子克隆技术表达腺苷脱氨酶蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,再以其为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增腺苷脱氨酶基因,然后将目的基因连接到3种原核质粒pET-28b、pET-32a(+)和pHSIE中,再将测序完全正确的克隆质粒用CaCl2法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达,并筛选最优表达条件,经Western-blot和SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。结果 3种质粒载体携带的目的基因DNA测序结果证实其很好地连接入载体质粒,表达的ADA蛋白经Western-blot和SDSPAGE鉴定符合,最优表达条件为诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L,表达温度为16℃,表达时间为24h。结论该实验成功构建了腺苷脱氨酶的3个原核载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA),且3个载体均成功高效表达了腺苷脱氨酶蛋白。     

人泛素-核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达

目的构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体。方法利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白。结果经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白。结论成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

登革病毒Ⅰ～Ⅳ型外膜基因的表达及重组抗原的血清学应用

目的选取登革病毒Ⅰ～Ⅳ外膜蛋白DⅢ区基因进行克隆、表达和纯化，以获得能应用于血清学诊断的纯化重组蛋白。方法用RT—PCR法扩增登革病毒Ⅰ～Ⅳ毒株外膜蛋白DⅢ区基因，与表达载体pET-30a连接，构建重组表达载体，在大肠杆菌B121（DE3）中表达，重组蛋白用电洗脱法进行纯化。纯化的重组蛋白用间接ELISA法、捕获ELISA法和夹心ELISA应用于血清学检测，检测结果与间接免疫荧光法进行比较。结果重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白，纯化的重组蛋白对登革热病毒感染者具有很高的检出率，与间接免疫荧光法检测结果基本相符。结论登革病毒Ⅰ～Ⅳ外膜蛋白DⅢ区基因在大肠杆菌中成功表达，重组蛋白可应用于血清学检测。     

重组人体干细胞因子的表达、复性、纯化及其对脐带血干细胞体外扩增作用研究

目的对重组人体干细胞因子（rhSCF）蛋白在脐带血干细胞体外扩增中的作用进行研究。方法通过大肠杆菌表达系统,经IPTG诱导表达获取SCF包涵体,经透析复性、纯化后获得蛋白。从脐带血中提取单核细胞（MNC）,分选其中具有CD34＋抗原表位的细胞,使用一定浓度的血小板生成素（TPO）、FLT-3配体（FL）及rhSCF组合对脐带血干细胞进行7 d体外扩增以研究rhSCF的作用。结果成功使用IPTG在大肠杆菌BL21诱导表达rhSCF,包涵体经复性及CM-Sepharose纯化获得高纯度的rhSCF。干细胞体外扩增实验表明rhSCF、FL及TPO联用,具有协同刺激CD34＋细胞体外扩增的作用。结论成功建立rhSCF原核表达、复性和纯化体系,为造血干细胞体外扩增体系的优化研究奠定了基础,同时为干细胞因子的临床应用提供了有价值的参考。     

增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。     

新等位基因人类白细胞抗原B＊15：133的鉴定及其原核表达

背景：国际上至2010-04共报告人类白细胞抗原4633个等位基因,中国自2000年至少发现200个新的等位基因,由于资金和时间有限,大部分新等位基因未作血清分型、家系研究以及进一步的功能性研究。目的：在健康志愿者人群中发现新等位基因,并对其进行家系研究,同时构建重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,鉴定其在原核细胞中是否表达。方法：利用PCR-SSO和PCR-SBT技术,对人群的人类白细胞抗原进行筛选。使用血清学和SBT技术对拥有新等位基因的供者进行家系分析。用分子克隆的方法构建表达载体转染原核细胞,运用Western-blot鉴定是否表达。结果与结论：发现一个新等位基因与人类白细胞抗原B＊15：18：01在第419位相差一个核苷酸,C-〉T,即Codon116位TCC-〉TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸。最终确定命名为人类白细胞抗原B＊15：133。血清学表达B71（70）抗原。发现此供者的新等位基因来自于母亲。表达载体pET30a（＋）-B＊15：133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别。结果表明,使用分子生物学技术在大样本的筛查下发现了新等位基因人类白细胞抗原B＊15：133,利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a（＋）-B＊15：133,并在原核细胞中有大量高纯度蛋白表达。     

利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体

目的：构建携带绿色荧光蛋白标签的重组人血小板因子4基因(plateletfactor4，PF4)的真核表达载体，并在真核细胞中表达，为研究其生物学功能奠定基础。方法：人工合成PF4基因模板，通过PCR方法扩增PF4-cDNA，然后克隆至pUCl9克隆载体，经序列测定后重组入pIRES2-EGFP真核表达载体并进行酶切鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体转染法瞬式转染至COS7细胞中。结果：获得了PF4-cDNA基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已与pIRES2-EGFP真核表达载体正确连接。荧光显微镜示，此载体成功转染至COS7细胞中。并获得有效表达。结论：利用基因工程技术，成功的构建了携带绿色荧光蛋白标签的PF4的真核表达载体，并在真核细胞中获得有效表达，为下一步研究其在真核细胞中的生物学功能奠定基础。     

Reduction in induced pain by ultrasound may be caused by altered expression of spinal neuronal nitric oxide synthase-producing neurons

OBJECTIVE: To examine the peripheral influence of therapeutic ultrasound (US) on central spinal nociceptive modulation. DESIGN: Controlled, experimental animal trial. SETTING: Neuroscience laboratory of a medical university in Taiwan. ANIMALS: Ten male Wistar rats weighing 250 to 300 g. INTERVENTION: To induce inflammatory arthritis, the rats were injected intracapsularly with complete Freund's adjuvant (CFA) into the right tibiotarsal joint. Eighteen hours later, at the inflammatory phase of arthritis, US or sham-operated treatment was applied to the arthritic limb. MAIN OUTCOME MEASURES: The numbers and distributional proportions of immunoreactive spinal neuronal nitric oxide synthase-like (nNOS-LI) neurons were assessed. RESULTS: The nNOS-LI neurons were abundant bilaterally in the L1 and L2 regions of the spinal cord areas after CFA-induced arthritis with sham-operated treatment. US treatment significantly suppressed this increase in the numbers of nNOS-LI neurons bilaterally in the superficial laminae (laminae I-II, P < .001), nucleus proprius (laminae III-IV, P < .01), deep laminae (laminae V-VI, P < .001), and ventral horn (laminae VII-X, P < .001) of the spinal cord. When expressed as a percentage of the total labeled cells, the proportions of nNOS-LI neurons showed significant differences in laminae III-IV (P < .001) and laminae V-VI (P < .01) between sham-treated rats and those treated with US. CONCLUSIONS: US treatment may modulate the CFA insult-induced increase in total and regional nNOS-LI neurons. I propose that the peripheral influences of US on central modulation of the spinal nociceptive processing system is important and may reflect the neuroplasticity of the spinal cord in response to peripheral input.     

梅毒螺旋体TpN15-47融合基因原核表达系统的构建

目的构建梅毒螺旋体TpN15-47融合基因及其原核表达系统。方法分别克隆TpN15和TpN47基因,利用T4连接酶构建TpN15-47融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白TpN15-47表达情况。结果连接的TpN15-47基因测序分析表明,插入的基因片段为TpN15-47融合基因,与GenBank报道相同。目的重组蛋白TpN15-47表达产量约为细菌总蛋白85.79%,主要以包涵体形式存在。结论所构建的原核表达系统能高效地表达TpN15-47融合蛋白,为后期梅毒螺旋体基因疫苗和临床检测试剂盒的研制奠定了基础。     

The presence of anticardiolipin antibodies in adults may be influenced by infections in infancy

OBJECTIVES: There has been limited success defining environmental factors important in the development of antiphospholipid (Hughes) syndrome (APS). Recent work suggests that the perinatal environment may be important in the development of other autoimmune diseases. We measured anticardiolipin antibodies (aCL) in a general population with well-defined early lives to see whether fetal and infant growth and infections were associated with aCL positivity in adult life. METHODS: aCLs were measured using an ELISA in 1384 individuals from the Hertfordshire cohort study. We investigated associations between the presence of aCL and early growth and infectious exposure in infancy in men and women. RESULTS: ELISA positive aCL (IgM and IgG) was present in 22 (3%) men and 15 (2%) women. Using the highest octile of aCL results, in men higher birth weight (per lb of birth weight: OR 1.18, 95% CI 1.02-1.36, P = 0.02) and diarrhoeal infection in the first year of life (OR 2.55, 95% CI 1.10, 5.92, P = 0.03) were associated with an increased likelihood of being aCL positive. In women, diarrhoeal infection in the first year of life was also associated with an increased likelihood of aCL positivity (OR 2.23, 95% CI 1.01, 4.91, P = 0.05). For IgG titre in men, significant relationships were found with sharing a bedroom (regression coefficient 1.13; 95% CI 1.05, 1.22; P = 0.02) and diarrhoea in the first year (coefficient 1.25; 95% CI 1.00, 1.56; P = 0.05). CONCLUSION: A developing immune system when exposed to the infectious environment may influence the likelihood of producing aCL in adult life.     

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白（rltB-TpN47）表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。     

Blockade of ganglionic afterdischarges by tyramine may be mediated by endogenous catecholamines

Tyramine reduced the compound postganglionic action potential from preganglionic stimulation of the golden hamster isolated stellate ganglion at 0.2 Hz. This action of tyramine was only slightly reduced by phentolamine (10(-5)M), an alpha adrenoceptor antagonist. Tyramine also reduced the postganglionic discharges after preganglionic stimulation at 30 Hz for 2 sec in the presence of hexamethonium. The blockade of afterdischarges by tyramine was markedly reduced by phentolamine. Furthermore, tyramine was much less effective in blocking ganglia from reserpine-pretreated hamsters (6 mg/kg, 4 hr before isolation). Blockade of afterdischarges by norepinephrine was reduced by phentolamine, but not by reserpine. These results indicate that the blockade of afterdischarges with tyramine is mediated by endogenous catecholamines. The blocking action of tyramine was not reduced by cocaine (10(-5)M). Cocaine did reduce the afterdischarges, and this action of cocaine was partially antagonized by phentolamine and reserpine. These results suggest that the blockade of afterdischarges by tyramine and cocaine is due to inhibition of catecholamine uptake which potentiates the actions of endogenous catecholamines.     

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白（rltB-TpN47）表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。