陕西株庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV )RNA NS3区 cDNA(4248nt～4465nt)的扩增、克隆和序列分析

目的　了解陕西株庚型肝炎病毒 (HGV,RNA/ GBV-C)的核苷酸序列特点 .方法　从陕西省西安市两位非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎患者的血清中 ,应用反转录及套式 PCR技术 ,从血清中提取 RNA,经特异性的反转录引物 P4反转录成c DNA,以此为模板分别用 P3,P4及 P1 ,P2 两对引物进行PCR扩增 ,扩增到 2 18bp的 HGV RNA NS3区部分基因 ,将其克隆入 Pin Point TMXal- T载体 ,挑选阳性克隆并进行了序列分析 .结果　 SG2 与 HGV的核苷酸同源性分别为 85 .6 4%与84.48% ;与 GBV- C的核苷酸同源性为 86 .2 1%与 84.48% ,其二者之间同源性为 97.13% ;二者与 HGV的氨基酸同源性分别为 98.2 8%和 93.10 % ,与 GBV- C的氨基酸同源性也为98.2 8% ,93.10 % ,二者之间的氨基酸同源性达 94.83% .结论　庚型肝炎病毒 NS3区核苷酸同源性较高 ,同义突变率也较高 ,可能是一个对其生存环境较为适应的病毒 .     

庚型肝炎病毒"重庆株"NS3区核苷酸和氨基酸序列分析

目的：研究庚型肝炎病毒(HGV)“重庆株”(CHq)在NS3区与其它一些分离株之间核苷酸和氨基酸序列的同源性。方法：采用RT-套式PCR,从中国重庆市的庚型肝炎患血清中分离出HGV-NS3区基因cDNA并测序,然后经计算机软件对其核苷酸序列及由此推导的氨基酸序列进行分析。结果：HGV“重庆株”NS3区与HGV-l(U44402)、HGV-2(U45966)、GBV-C(U63715)及HGV C964 NS3区之间,核苷酸序列同源性分别为85．96％、83．67％、85．96％和96．28％;氨基酸序列同源性分别为97．4％、97．4％、97．4％和96．6％。结论：在NS3区核苷酸序列方面,“CHq”与HGVC964同源性最高,而在NS3区氨基酸序列方面,“CHq”与其它4株HGV的同源性均在96％以上,无明显差别。提示以NS3蛋白为抗原,对感染不同HGV株的患血清进行免疫学检测,其检出率应无显差异。     

一株急性散发性戊型肝炎病毒基因结构及核苷酸同源性分析

目的：分析一株长春地区散发戊型肝炎病毒（HEV）的基因结构和核苷酸同源性。方法：采用RT-nPCR方法检测HEV RNA，应用全自动测序仪进行序列测定。结果：所获得的HEV-CCC220全长7 193bp，编码2 397个氨基酸，由5′-UTR（nt 1-9）、3′-UTR（nt 7152-7193）和3个开放读码框架（ORF_s）组成。与HEV Ⅳ型核苷酸同源性明显高于HEVⅠ～Ⅲ型，全基因序列核苷酸同源性为83.2 %～85.0%；与ORF₂间300　nt和98　nt部分基因序列核苷酸同源性分别为85.0%～93.9%和80.6%～86.7%。结论：长春地区散发性HEV-CCC220属HEV Ⅳ型，ORF₂间300nt部分核苷酸序列可以代替全基因序列进行HEV基因型分析。     

七株急性散发性戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析

比较我国流行性和散发性戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）的部分核苷酸和氨基酸序列及其与戊型肝炎流行的关系。方法应用逆转录套式聚合酶链反应法（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从急性散发性戊型肝炎病人血清中扩增ＨＥＶ开放读码框架２（ＯＲＦ２）ｃＤＮＡ，并用ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡ序列分析试剂盒，经双脱氧核苷酸ＤＮＡ链末端终止直接测序法测定ＲＴ－ｎＰＣＲ扩增产物的核苷酸序列。结果从深圳、长春、杭州、西安、北京５个城市４１份急性散发性戊型肝炎病人血清中获得２８株ＨＥＶＯＲＦ２ｃＤＮＡ，对其中７株进行了核苷酸序列分析，表明它们与ＨＥＶ墨西哥株（Ｍ）的同源性为７８．９％～８０．２％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）流行株（Ｅｐ）的同源性为９３．１％～９５．１％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）散发株（Ｓｐ）的同源性为９２．３％～９４．２％；与ＨＥＶ中国新疆流行株ＣＨ１．１同源性为９６．５％～９８．９％；７株散发性ＨＥＶ间核苷酸序列的同源性为９５．７％～１００％。结论该７株散发性ＨＥＶ与ＨＥＶ（Ｂ）和ＨＥＶＣＨ１．１核苷酸序列的同源性较高，均属同一亚型。     

庚型肝炎临床及实验研究

目的:了解保定市HGV感染情况和本地HGV感染株的临床特点以及本地HGV株与国内外其他HGV株的关系。方法:采用EIA和RT—pcR法对300例健康供血员和141例肝炎患者进行抗HGV及HGV—RNA检测;对4例HGV—RNA阳性患者进行HGV—RNANS区部分序列测定,并将结果与国内外部分发表HGV相应序列比较。结果:健康供血员HGV感染率3％,住院肝炎患者中HGV感染率21.3％,在NA—E肝炎中HGV感染率28.2％。在单纯庚型肝炎中,急性肝炎占54.5％,急性庚型肝炎ALT均值1021±438U,恢复正常39±18.4天。SB均值为7.66±4.15mg％,恢复正常37.2±12.6天。保定4株HGV—RNA NS_s区部分序列核苷酸同源性在90％～97％,与江苏、广东株比较同源性在87％—93％,与日本、美国株比较同源性在84％～90％。结论:首次证实保定市存在HGV感染与流行;供血员HGV感染率接近全国平均水平。HGV可引起无症状感染和各临床型肝炎,有一定的致病作用。单纯HGV感染以急性肝炎较常见,ALT峰值较高,恢复较快。HGV流行株可能存在一定的地理分布差异。     

急性散发性肝炎病人中戊型肝炎病毒Ⅰ型Ⅳ型感染部分核苷酸序列的分析

目的：探讨戊型肝炎Ⅰ型与Ⅳ型病毒感染在急性散发性肝炎病人中的感染情况。方法：应用逆转录聚合酶链反应（PCR）检测急性肝炎病人血清HEV RNA，并对阳性产物进行核苷酸序列分析。结果：RT－PCR检测31例急性散发性戊型肝炎病人血清HEV RNA阳性，序列分析证明：21例与缅甸株（B）、中国株（Ch1.1）的核苷酸序列同源性为94－98.9%，属于同一基因型，其余10例变异较大，其核苷酸序列与株、中国株、墨西哥株、美国株的同源性分别为75.3-79.3%,76.4-81.48%,72.5-77.5%,74.8-77.6%，与中国株HEV Ⅳ型的同源性为95－98％。基因进化树分析表明，此10株HEV与其它3型比较，变异较大，HEV Ⅳ型为同一基因型。结论：急性散发性戊型肝炎病毒在北京地区感染存在不同的病毒基因型别，主要为HEV Ⅰ型感染（67.47%），HEV Ⅳ型感染也存在一定比例（32.25%）。     

武汉地区戊型肝炎病毒基因型及ORF3基因序列准种特点

目的 研究武汉地区戊型肝炎病毒（HEV）基因型及HEV开放读码框架3（ORF3）基因序列的准种特点。方法 应用逆转录-巢式聚合酶链反应法（RT-nested-PCR）扩增HEV开放读码框架2（ORF2）的部分序列，选取其中25份进行测序，用Clustal X和Mega软件比较武汉地区HEV序列与4个HEV主要代表株序列；并扩增其中2份HEV开放读码框架3（ORF3）的全部序列，克隆入pMD18-TVector，其中1例挑选30个克隆进行DNA测序。结果 25例HEV-ORF2核苷酸同源性为82．61％～98．55％，与Ⅰ型（缅甸株）、Ⅱ型（墨西哥株）、Ⅲ型（美国株）、Ⅳ型（中国／台湾株）核苷酸同源性分别为76．52％～81．74％、70．43％～73．04％、76．52％～81．16％和84．35％～88．70％。来源于同一患者ORF3区全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性为97．97％～99．71％，与Ⅳ型（中国／台湾株）核苷酸同源性为89．86％～99．71％。ORF3区可检出点突变、缺失突变、短序列的插入突变。结论 武汉地区散发性戊型肝炎患者以HEV Ⅳ型感染为主。多克隆测序结果提示患者体内HEV呈现准种群共存，HEV-ORF3C末端第2个富含脯氨酸区多有点突变，点突变不影响脯氨酸表达，这些变异的临床意义值得进一步研究。     

庚型肝炎病毒非结构基因（NS）5区部分序列的一级结构及其变异

测定庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构基因５（ＮＳ５）区部分基因序列。方法从３例献血员，２例肝硬化患者及１例非甲－戊型肝炎患者血清中通过逆转录－套式－聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长９９４ｂｐ的ｃＤＮＡ序列，ＰＣＲ产物纯化后以双脱氧末端终止法测定其序列。结果所分离的６株ＨＧＶＮＳ５区部分核苷酸序列与国外报道的３株（ＧＢＶ－Ｃ、ＰＮＦ２１６１、Ｒ１０２９１）比较，同源性为８７．２％～９３．９％；６株间同源性为９０．１％～９３．８％。根据所测得的６株ｃＤＮＡ序列推导出其编码的氨基酸序列，与国外发表的３株序列相比，同源性在９３．６％～９８．７％，６株之间为９３．６％～９８．４％。在此区内发现有１６个保守的脯氨酸残基及８个保守的半胱氨酸残基。结论从不同慢性肝脏疾病患者及献血员血清中分离出６株ＨＧＶ，其ＮＳ５区部分序列在核苷酸水平及氨基酸水平均较保守。可依赖此区序列设计诊断试剂     

长沙市2014—2019年31株风疹病毒基因型流行特征

目的 对2014—2019年长沙市风疹病毒进行分子流行病学、基因特征及溯源研究。方法 风疹疑似患者鼻咽拭子先通过荧光逆转录聚合酶链反应（real time-PCR, RT-PCR）进行风疹病毒核酸检测,风疹病毒阳性标本再进行RT-PCR扩增E1基因片段,序列拼接后构建进化树及氨基酸同源性分析。结果 截至2019年10月31日,收集到市区上送风疹疑似病例标本1 726份,其中阳性87份（5.04%）,2014年至2019年风疹阳性率分别为1.27%（6/471）、1.70%（4/235）、1.83%（4/218）、0%（0/133）、11.18%（18/161）和10.83%（55/508）。2018年开始风疹病例显著增多。感染人群中62.07%（54/87）分布于10~20岁。本研究共获得31株风疹病毒序列,2014年3株2B型,1株1E型;2016年1株2B型;2018年10株1E型;2019年16株1E型。GenBank序列号为MN251800-MN251830。进化树分析显示2018—2019年毒株与香港地区本土循环流行的1E基因型毒株位于同一分支,区别于2018年以前长沙市地区流行的毒株。毒株之间的核苷酸同源性为99.5%~100.0%,与WHO参考株核苷酸同源性为96.0%~96.4%。E1基因第324位A突变为T,第329位F突变为L,关键位点未发生变化。结论 2018—2019年长沙地区风疹流行毒株为不同地区同一1E基因型毒株感染造成,应加强本地学生及成年人中风疹疫苗接种计划及风疹病毒学的监测。     

RT—套式PCR法检测病毒性肝炎患者血清中HGV—RNA

目的：为了解四川泸州地区庚型肝炎病毒（HGV）流行情况，方法：根据发表的HGV序列非编码区（NCR）设计两对引物，用RT-套式PCR方法，结果：对102例各型肝炎病人血清进行检测，发现39例HGV-RNA阳性，阳性率为38.23％。其中3例（7.69％）HGV-RNA阳性者为非A-E型肝炎，33例（84.61％）为HBV与HGV共同感染，另外3例（7.69％）为HCV和HGV共同感染。结论：提示泸州地区是HGV高流行区。PCR所得产物进行序列测序，结果表明，“泸州株”HGV非编码区与“中国株”同源性达89.4％，与“重庆株”同源性达94.3％，提示“泸州株”和“重庆株”可能为相同亚型。     

浙江地区幽门螺杆菌临床菌株vacA优势基因型及其核苷酸序列分析

目的 :了解浙江地区消化性溃疡和慢性胃炎患者感染的幽门螺杆菌 (Hp) vac A优势基因型及其序列特点。方法 :分别从 2 9例消化性溃疡和 34例慢性胃炎患者的胃窦、胃体粘膜组织中分离出 12 6株 Hp。采用聚合酶链反应检测 vac A基因的信号区 (s)和中间区 (m)亚型 ,部分优势基因型的扩增产物 T- A克隆后进行核苷酸序列测定。结果 :所有菌株均扩增出 vac A s区和 m区基因片段 ,发现 s1a/ m1、s1a/ m2、s1a/ m1b、s1a/ m1b- m2 4种基因型 ,其比例分别为 7.1% (9/ 12 6)、61.9% (78/ 12 6)、2 9.4 % (37/ 12 6)、1.6% (2 / 12 6)。 17.5 %患者 (11/ 63)存在不同 vac A基因型Hp菌株混合感染 ,但在胃炎组和溃疡组中的分布差异无显著性 (P>0 .0 5 )。 6株 s1a型 Hp菌株的 s区扩增产物与报道的 s1a型 60 190株核苷酸序列同源性为 93.15～ 94 .86% ,4株 m2型 Hp菌株的 m区扩增产物与报道的 m2型 87-2 0 3株核苷酸序列之间同源性为 93.63～ 97.61%。结论 :s1a/ m2和 s1a/ m1b均是浙江地区消化性溃疡或慢性胃炎患者感染的 Hp菌株的 vac A优势基因型 ,部分优势 vac A基因型菌株的核苷酸序列与国外报道的参考菌株有较高的同源性 ;部分患者同时感染多株不同 vac A基因型 Hp。     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

原发性肝癌和职业献血员中庚肝病毒感染和核酸序列测定

目的为了解本地区原发性肝癌(PHC)中HGV感染状况和与输血的关系。方法采用逆转录-套式聚合酸链反应法(RT-nPCR)对20例PHC和44例职业献血员进行了HGV-RNA检测，并对3例阳性产物纯化克隆后，采用ABI Pism 377 DNA自动测序仪，对其5＇非编码区基因序列(115～467nt)进行了测定。结果20例PHC中，2例(10.0％)HGV-RNA阳性，该2例分别为HBV、HCV三重感染和HBV三重感染和HBV、HGV重叠感染，且均有输血史；44例职业献血员中，1例(2.3％)HGV-RNA阳性。该3株HGV核苷酸序列同源性为97.3％～98.8％，与GBV-C(U36380)、HGV(U44402)和HGV3型(D90601)的核苷酸同源性分别为88.3％～89.4％、88.4％～89.7％和95.2％～96.3％。结论PHC中HGV感染与输血有关；HGV可能与PHC的发生无关。本地区HGV感染株属基因3型。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

丙型肝炎病毒1b型NS3区与原发性肝癌的关系

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）1b型的非结构蛋白3（NS3）区与原发性肝癌（HCC）的关系。方法：将患者分为丙型肝炎病毒携带者组、非HCC组及HCC组,从患者血清中提取HCV-RNA,采用巢式聚合酶链法（nested -PCR）进行HCV基因分型并扩增HCV-NS3片段,分析HCV-NS3区片段的核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白质二级结构。结果：3组均以1b型为主,3组间1b型所占百分率比较差异无显著性(P>0.05）;3组核苷酸序列同源性95%,3组氨基酸序列的同源性为95%,且3组在NS3_1227-1206区间都无特殊的氨基酸突变;NS3_1227-1206区的蛋白质二级结构分为A、B 2型,携带组及非HCC组以A型为主,而HCC组以B型为主;携带组与非HCC组蛋白质二级结构分型差异无显著性（P>0.05）,而HCC组与携带组、非HCC组之间差异有显著性（P<0.01）。结论：1b型HCV携带者及非HCC患者与HCC患者在蛋白质二级结构上有差异,HCV-NS3与HCC的发生有关联。     

2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒基因组非结构4区全长序列的扩增、克隆及分析

目的 获得2a／Ⅲ型丙型肝炎病毒（HCV）基因组全长非结构（NS）4区克隆并作序列分析。方法 用限制性长段长度多态性分析（RFLP）基因分型方法筛选出2a／Ⅲ型HCV一株。为了获得该毒株全长NS4区基因序列，依据代表株序列的NS3区之′末端及NS5区之5′末端相对保守区域合成引物，以RT－nseted-PCR方法扩增一段1.3kb的片段cDNA；将此片段插入pUC19质粒载体。结果 克隆了丙型肝炎基因组非结构NS4区全长基因，构建了pUC-NS4重组体，对重组体进行酶切鉴定，克隆的cDNA与预计的片段大小相符，并作序列测定。结论 获得全长NS4区基因克隆，经序列分析表明，与日本HC－J6有较高的同源性（92.1%）。     

珠海市2013年肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型基因特征

目的分析2013年珠海市手足口病（Hand-foot-mouth disease,HFMD）患者中,肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的分子流行病学特征。方法采集珠海市2013年HFMD临床诊断病例粪便标本215份,选取其中Real time RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性的18份和Cox A16病毒核酸阳性的8份标本,进行VP4区基因扩增,并进行核苷酸序列和遗传进化关系分析。结果 16份EV71扩增测序成功,与C4a基因亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（95.2%-99.5%）和氨基酸同源性（91.3%-100%）;5份Cox A16扩增测序成功,有2份与B2a亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（98.6%-99.0%）和氨基酸同源性（97.1%-98.5%）,3份与B2b亚型代表株具有最高的核苷酸序列同源性（96.6%-97.1%）和氨基酸同源性（100%）。结论 2013年珠海市流行的EV71属于C4a基因亚型,Cox A16为B2a和B2b两种基因亚型。     

PCR技术在丙型肝炎病毒RNA聚合酶基因分析中的应用

目的研究本地区HCV病毒分离株的分型,为临床治疗提供依据。方法利用PCR技术克隆并测定NS5B基因片段的核苷酸序列,并对其核苷酸和氨基酸序列进行比较分析。结果克隆的NS5B片段的核苷酸和氨基酸序列与HCV-Ⅱ型代表株相应部分序列的同源性最高,而且氨基酸序列比较结果显示,37个分离株中RNA聚合酶结构及其相关序列无任何变异。结论该分离株应属HCV—Ⅱ型。NS5B基因片段可能在病毒复制中起重要作用。     

戊型肝炎病毒分子生物学、血清学、诊断方法及流行病学研究

本课题由北京医科大学牵头,中国预防医学科学院病毒学研究所和新疆维吾尔自治区卫生防疫站等单位协作完成,其主要成果如下: 病原学 1.对我国2株流行性戊型肝炎病毒(HEV)基因组全序列进行了测定和分析,其与缅甸株HEV的核苷酸序列同源性分别为93.9％和94.0％,提示我国流行性HEV与缅甸株属同一亚型。 2.对从北京、西安、长春、杭州、深圳等地分离的7株散发性HEV的部分基因序列进行