人血小板生成素对小鼠巨核细胞生长及血小板产生体内外作用研究

采用血小板计数、巨核细胞形态观察及计数、巨核细胞集落培养技术，观察从人尿中纯化的天然血小板生成素（TPO）对Balb／c，h鼠巨核细胞生成及血小板产生的作用。小鼠随机分四组，Ⅰ组为对照组，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为TPO低剂量组（10U／R）中剂量组（50U／只）和高剂量组（100U／只），结果显示TPO能显著提高外周血液中的血小板数（P＜0.01）和骨髓中的巨核细胞数（P＜0.01），且有巨核细胞的脑体和胞核的显著增大的作用，在体外对巨核细胞集落形成有明显增加作用（P＜0.01）。这些结果表明从人尿中纯化的天然TPO具有促进巨核细胞增殖、分化、成熟及产生血小板的作用为TPO进入临床试验提供了依据。     

脐血巨核祖细胞的体外扩增

目的联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)和肝素用脐血CD34 细胞定向扩增巨核祖细胞.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34 细胞,用TPO、IL-11和肝素定向扩增巨核祖细胞,巨核祖细胞集落分析(CFU-MK)测定巨核祖细胞扩增倍数,流式细胞术检测巨核祖细胞分化过程中不同细胞组群(CD34 、CD41a 、CD61 、CD34 CD41a 和CD41a CD61 )的变化,免疫组织化学染色(CD41a)和透射电镜观察巨核细胞形态及超微结构,血小板体外活化实验及非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞功能.结果单用TPO 7 d时,CD34 CD41a 细胞扩增(4.0±1.7)倍;与IL-11联用后扩增到(10.5±4.8)倍;再加入肝素后扩增达(29.9±6.4)倍,TPO IL-11 肝素组扩增倍数为TPO组、TPO IL-11组的7.5、2.85倍,与两组相比差异均有显著性(P＜0.05).TPO IL-11 肝素组巨核祖细胞中大集落(＞50个细胞/集落)达(106.8±26.9)倍,较TPO、TPO IL-11组均有明显增加(P＜0.05).将扩增第7天的巨核细胞静脉输注于经放射预处理的非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠,可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率.电镜显示扩增的巨核细胞有一定的界膜发育等成熟特征,体外血小板活化实验证实,扩增的巨核细胞在体外可产生血小板,有正常巨核细胞功能.结论TPO、IL-11和肝素组合的培养体系可有效扩增脐血巨核祖细胞.     

白细胞介素33对心肌梗死后巨核细胞增殖、 生成血小板的影响

目的 研究白细胞介素33(interleukin-33,IL-33)对心肌梗死(myocardial infarction,MI)后小鼠骨髓巨核细胞增殖、生成血小板的影响。方法 将20只C57BL6雄性小鼠随机分为两组,即对照组和IL-33处理组。对照组腹腔注射PBS连续14天,然后结扎小鼠冠脉前降支造成MI。IL-33处理组腹腔注射IL-33蛋白(50μg/kg)连续14天,然后如前进行MI造模。MI 3天后,采用全血细胞计数仪检测小鼠循环血液中血小板计数;采用免疫荧光染色与流式细胞术检测小鼠骨髓中成熟巨核细胞、未成熟巨核细胞以及血小板前体数量。结果 经IL-33处理后,小鼠骨髓中巨核细胞与巨核祖细胞的数量增多,然而血小板前体数量与循环血液中血小板水平比较,差异无统计学意义,血清血小板生成素(thrombopoietin,TPO)水平亦无明显变化。结论IL-33促进心肌梗死后骨髓巨核细胞增殖,但不影响血小板生成。     

血小板生成素和白细胞介素-11对慢性特发性血小板减少性紫癜巨核细胞的影响

目的　探讨重组人血小板生成素 (rh TPO)及联用重组人白细胞介素 - 11(rh IL - 11)对慢性特发性血小板减少性紫瘢 (CITP)患者骨髓巨核祖细胞增殖和成熟的影响。方法　采用血浆凝块法对 2 1例 CITP患者骨髓巨核祖细胞进行体外培养 ,培养体系中加入不同浓度的 rh TPO,或同时加 rh IL - 11两者联用。培养 14天后经 SZ-2 1(GP a)单抗和 ABC试剂盒染色观察集落生长数 ,用 MCDS- 2 0 10型超清晰度骨髓细胞分析系统进行巨核细胞的面积和直径测定。结果　 CITP组骨髓巨核细胞面积及直径明显低于对照组 (P<0 .0 5 )。 rh TPO对 CITP患者的巨核细胞集落形成单位 (CFU - MK)总集落数、巨核细胞直径与面积均有促进作用 ,但无浓度依赖性。体外最适浓度为 10 ng/ ml;rh TPO与 rh IL - 11联用组较单用组的 CFU - MK、总集落数及面积、直径均显著增加。结论　 CITP患者骨髓巨核细胞存在成熟障碍 ,体外 rh TPO单用及与 rh IL - 11联用均可促进 CITP患者巨核祖细胞的增殖与成熟 ,其联用较单用促进作用更强     

特发性血小板减少性紫癜血小板生成素的测定及其临床意义

目的研究特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患者血清血小板生成素(thrombopoientin,TPO)水平改变与疗效的关系。方法选取我院45例ITP患者(ITP组)和25例体检正常者(对照组),应用酶联免疫吸附法定量检测2组患者治疗前后TPO浓度,同时分别采用血细胞分析仪及骨髓涂片法检测治疗前后ITP患者外周血血小板和骨髓巨核细胞的数量,并根据治疗1个月后患者的疗效情况,将ITP患者分为治疗有效组和治疗无效组。结果 ITP组与对照组相比,血小板计数及巨核细胞计数差异显著,具有统计学意义(P<0.05),而TPO浓间差异无显著性,不具有统计学意义(P>0.05);治疗前,ITP组中治疗无效组的TPO浓度明显高于治疗有效组和对照组(P>0.05),而巨核细胞计数明显低于治疗有效组和对照组。结论血清TPO水平在ITP患者预后判断中具有重要意义。     

ITP患者促血小板生成素水平和血清白细胞介素-11水平的检测及意义

目的探讨原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血清促血小板生成素(TPO)和白细胞介素-11(IL-11)水平以及它们与外周血小板计数(PLT)之间的关系.方法应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定30例ITP患者血清TPO水平和IL-11水平,同时用自动血细胞仪测定其PLT,人工记数骨髓涂片上巨核细胞数,以20例健康人为正常对照.结果ITP患者血清TPO较正常对照组略低,差异无显著性(P>0.05),IL-11水平较正常对照组高,差异有显著性(P<0.05).相关分析表明ITP患者血清TPO水平与血小板计数、巨核细胞数无相关性(P>0.05);ITP患者血清IL-11水平与血小板计数呈负相关(r=-0.559,P=0.001<0.05),血清IL-11水平与巨核细胞数无相关性(P>0.05).结论血清TPO及IL-11的检测对ITP有一定的辅助诊断意义,本实验结果也对探讨血小板生成的调节机制有参考价值.     

TPO对体外巨核细胞增殖、分化的影响

目的研究血小板生成素(TPO)对人巨核细胞白血病细胞(DAMI)增殖、分化的影响。方法采用体外培养巨核细胞,将不同浓度TPO加入细胞培养液,CCK-8法检测TPO最佳刺激浓度;培养液中加入TPO,台盼蓝检测细胞增殖活力,巨核细胞乙酰胆碱脂酶染色检测细胞集落。流式细胞仪检测巨核细胞CD4l表达。结果 TPO浓度为250ng/ml时刺激作用明显。培养液中加入TPO后,巨核细胞集落计数、CD4l表达均明显增加。结论 TPO促进体外巨核细胞增殖、分化。     

巨核细胞生长发育因子及其受体研究进展

巨核细胞生长发育因子(megakaryocytes growth development factor,MGDF)有时也被称为血小板生成素(thrombopoietin,TPO),因为他是特异性地作用于巨核细胞-血小板系统的造血调控因子,能够促进巨核细胞前体分化、生长、发育成熟,他不但使巨核细胞倍体数增加;也刺激造血细胞成熟;当他与受体结合后,激酶活化,激活了信号转导传递系统,使CD34 细胞向巨核细胞系统转化,在巨核细胞发育成熟的晚期,促进体积增大和在骨髓及肺部经过变形运动胞质在窦腔脱落分割成血小板或在肺毛细血管挤压后经过碎化作用产生血小板.由于巨核细胞分化、成熟的结果是最终产生血小板;所以,目前许多人也沿用Kelemen 1958年[1]命名的TPO一词.     

TPO和TGF-β_1在特发性血小板减少性紫癜发病机理中的作用探析

特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocy-topenicpurpura,ITP)是临床常见的出血性疾病,该病确切的发病机制还不清楚。目前,很多研究证实,ITP的发生与骨髓巨核细胞有着密切的关系,巨核细胞的成熟到血小板的产生过程受细胞、分子等多层面共同调控,其中细胞因子网络发挥着重要作用,它包括正性、负性作用因子两大类,正性作用因子包括TPO、IL-3、IL-6、IL-11和干细胞因子(SCF),负性作用因子主要是巨核细胞和血小板的α-颗粒蛋白,α-颗粒蛋白包括转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板反应素-1(TSP-1)、血小板4因子(PF4)等。其中,TPO是公认的首要调节巨核细胞增殖、分化、成熟的因子,TGF-β1是一种很重要的α-颗粒蛋白,在影响巨核细胞成熟的细胞因子网络中,TPO和TGF-β1起到重要的调节作用。     

血小板生成素通过修复化疗后骨髓内皮祖细胞促进巨核细胞造血

目的 探索血小板生成素（TPO）能否通过修复大剂量化疗后患者的骨髓内皮祖细胞（BM-EPC）恢复其对巨核细胞的造血支持作用。方法 选取23例血液系统恶性肿瘤患者化疗后30 d的骨髓以及10例健康人骨髓作为实验标本。采用表面特异性抗原CD34，CD309，CD133对BM-EPC进行鉴定；使用CCK8分析TPO是否可促进血液肿瘤患者化疗后BM-EPC增殖及其最佳作用浓度。设置TPO处理组为实验组，无TPO为对照组，健康人BM-EPC为健康对照组；通过DiL-Ac-LDL摄取及FITC-UEA-I结合实验检测实验组、对照组和健康对照组的BM-EPC数量。利用成管及迁移实验评估3组的BM-EPC功能；分别将实验组和对照组BM-EPC与巨核细胞共培养，利用流式细胞术检测巨核细胞增殖情况。结果 实验组BM-EPC高表达CD34/CD133/CD309；TPO可促进BM-EPC增殖，最佳作用浓度为100 μg/L。免疫荧光双标实验显示，实验组BM-EPC数量较对照组明显增加（P<0.05）。实验组成管能力及迁移能力较对照组增强（P<0.05）。共培养后，实验组巨核细胞数多于对照组（P=0.013）。结论 大剂量化疗后患者BM-EPC受损，TPO具有直接刺激巨核系统造血作用，还可能通过促进BM-EPC增殖，修复其功能，从而恢复BM-EPC对巨核细胞的造血支持作用。     

参仙合剂对环磷酰胺小鼠骨髓抑制和血小板生成素影响的实验研究

目的研究中药参仙合剂对环磷酰胺模型小鼠骨髓抑制和血小板生成素的影响。方法将昆明种小鼠随机分为六组,每组8只,即空白组、模型组、阳性对照组、参仙合剂低剂量、中剂量、高剂量组。参仙合剂各组先予灌胃给药5 d,第6天开始除空白组外各组均予环磷酰胺100 mg.kg-1腹腔注射,连续3 d造模,阳性对照组皮下注射重组白细胞介素-11（rh LI-11）200μg.kg-1,连续6 d,参仙合剂各组继续灌胃给药6 d。定期检测各组小鼠白细胞（WBC）和血小板计数（PLT）,并于实验第12天检测小鼠骨髓巨核细胞数和血清及骨髓上清液中血小板生成素（TPO）。结果参仙合剂各组WBC、PLT和巨核细胞数显著高于模型组（P〈0.05或P〈0.01）;阳性对照组巨核细胞数显著高于模型组（P〈0.01）。参仙合剂各组与阳性对照组血清及骨髓上清中TPO浓度显著高于模型组（P〈0.01）,TPO与参仙合剂剂量正相关,具有显著的量效关系。结论参仙合剂可提高骨髓与血液中TPO水平,从而促进巨核细胞和血小板等生成,防治骨髓抑制。     

抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化和成熟过程中的作用

目的 研究抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化和成熟过程中的作用。方法采用PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化,RNA干扰阻断Bcl-xL在K562细胞向巨核细胞诱导分化中的表达,RT-PCR和流式细胞仪技术检测其改变。采用免疫磁珠从正常骨髓中富集CD34＋细胞,在无血清培养下用TPO诱导其向巨核细胞分化,免疫组织化学和流式细胞仪技术观察分化过程中Bcl-xL的表达改变。结果 PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化24h后,CD61＋细胞百分比迅速增加,并且在72h内维持较高的阳性率;用siBcl-xL干扰后72h内,CD61＋细胞百分比只有轻度增加,同时RT-PCR检测显示24h后Bcl-xLmRNA表达显著减少,流式细胞检测显示Bcl-xL蛋白的表达也相应降低。正常骨髓中CD34＋细胞经TPO诱导后,在培养5—20d间Bcl-xL蛋白表达阴性的巨核细胞随着培养时间延长逐渐增多,免疫组织化学检测显示未成熟的巨核细胞Bcl-xL蛋白表达呈强阳性,而在成熟的巨核细胞中表达为阴性。结论抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化过程中发挥重要作用,而在巨核细胞发育晚期Bcl-xL蛋白的表达下调可能是巨核细胞成熟的关键,并与成熟巨核细胞的特殊凋亡发生密切相关。     

重组人瘦素对慢性特发性血小板减少性紫癜患者骨髓巨核细胞的影响

目的：探讨瘦素对 CITP 骨髓巨核细胞的影响。方法以急性巨核细胞白血病细胞株 M07e 和 CITP 骨髓 CD34＋细胞经诱导分化的巨核细胞为研究对象。运用 RT-PCR 检测 M07e 细胞瘦素受体 mRNA 表达,运用 Brdu-ELISA 法检测瘦素对 M07e 细胞的增殖作用,运用 Annexin V/ PI 双标流式检测瘦素对 M07e 细胞的凋亡作用。经TPO、SCF 诱导磁珠分选后获得的 CITP 骨髓 CD34＋细胞分化为巨核细胞,运用流式测定瘦素对其分化过程中CD41a ＋、CD61＋的表达以及 CD41a ＋细胞的凋亡是否有影响。结果瘦素受体长型 Ob-RL 和短型 Ob-RS 在 M07e细胞均有 mRNA 表达。瘦素对 M07e 细胞的增殖有促进作用,并呈现一定的剂量依赖性,浓度为5 ng/ ml 即显示出促增殖效应（P =0.037）,但浓度在5、10、25 ng/ ml 之间无明显统计学差异,浓度为100 ng/ ml 时其增殖效应最大。在时间依赖效应上,瘦素作用48 h,其细胞增殖明显高于24 h,而作用72 h 其细胞增殖介于两者之间（P =0.000）。瘦素对 M07e 细胞具有抑制凋亡作用（P =0.001）,而且在作用72小时后凋亡率最高。瘦素对骨髓 CD34＋细胞分化为巨核细胞过程中 CD41a ＋、CD61＋表达的影响,与不加瘦素组相比无明显统计学差异（P ＞0.05）。对 CD41a ＋细胞凋亡的影响与不加瘦素组相比亦无明显统计学差异（P ＞0.05）。结论瘦素通过促进 M07e 细胞的增殖,抑制其凋亡来参与巨核细胞白血病的发生、发展。瘦素在 TPO ＋ SCF 诱导 CITP 骨髓巨核细胞分化中无明显协同作用,对分化产生 CD41a ＋巨核细胞的凋亡亦无明显作用。     

重组人血小板生成素治疗原发免疫性血小板减少症的临床观察

目的观察重组人血小板生成素（rhTPO）治疗原发免疫性血小板减少症（ITP）的临床疗效及不良反应,并观察骨髓巨核细胞数与疗效的关系。方法 18例慢性难治性ITP患者皮下注射rhTPO 300 u/kg.d^-1,疗程14 d或血小板〉100×109/L后停药,动态观察患者血常规,定期监测肝、肾功能及凝血功能,并分析治疗有效患者骨髓巨核细胞数与血小板上升数值之间的相关性。结果 18例患者rhTPO治疗后,完全反应（CR）7例,有效（R）8例,无效（NR）3例。用药前血小板平均值为10±5.4×10^9/L,治疗后血小板计数平均最高值为116.4±82×10^9/L,与用药前比较差异有统计学意义（t=4.82,P〈0.01）。多数患者对药物耐受良好。rhTPO治疗有效患者骨髓巨核细胞数与血小板上升数值呈正相关（r=0.582,P=0.003）。结论 rhTPO治疗慢性难治性ITP具有良好的疗效,不良反应轻微,骨髓巨核细胞数越多的患者疗效越显著。     

重组人血小板生成素与重组人白介素-11促进白血病患者异基因造血干细胞移植后血小板恢复的疗效比较

目的比较重组人血小板生成素(rhTPO)与重组人白介素-11(rhIL-11)对促进白血病患者异基因造血干细胞移植术后血小板恢复的临床疗效及安全性。方法将114例行异基因造血干细胞移植的白血病患者分为IL-11组、TPO组和空白组,分别为36例、56例和22例,IL-11组及TPO组从移植后第6天开始分别给予rhIL-11 1.5 mg/d及rhTPO 15 000 u/d皮下注射,至血小板上升至100×109/L停药,如使用14 d未达正常亦停用。空白组患者不应用任何升血小板药物,血小板自然恢复。监测血常规并观察记录患者用药后的不良反应及30 d内血小板悬液输注量。结果IL-11组、TPO组和空白组血小板由最低恢复至≥20×109/L的中位时间分别为+13(8～20)d、+12(6～25)d和+19.5(12～32)d,IL-11组、TPO组的恢复时间均快于空白组(P值分别为0.003,0.001),但IL-11组和TPO组两组没有统计学差别(P=0.640);IL-11组、TPO组和空白组血小板由最低恢复至≥50×109/L的中位时间分别为+16.5(10～39)d、+15(11～48)d和+29(15～49)d,IL-11组、TPO组的恢复时间均快于空白组(P值分别为0.002,0.001),IL-11组和TPO组两组亦没有统计学差别(P=0.357);IL-11组、TPO组和空白组血小板由最低恢复至≥100×109/L的中位时间分别为+25(13～69)d、+18(14～48)d和+43(19～64)d,IL-11组、TPO组的恢复时间均快于空白组(P值分别为0.001,0.004),TPO组较IL-11组缩短7 d,两组差异有统计学意义(P=0.033)。+30 d内IL-11组、TPO组及空白组输注血小板悬液的中位数量分别为2(0～6)个治疗量、2(0～4)个治疗量和4(1～4)个治疗量,IL-11组和TPO组的血小板悬液输注量均少于空白组(P值分别为0.005,0.003),但该两组之间差异无统计学意义(P=0.499)。TPO组的不良反应发生率3.6%明显低于IL-11组的77.8%(P<0.001)。结论 rhTPO及rhIL-11均能够促进白血病患者异基因造血干细胞移植术后血小板计数的恢复,有效减少血小板悬液的输注量,降低移植出血相关风险;rhTPO较rhIL-11能缩短血小板升至正常的时间,从而提高患者对移植并发症的耐受性;rhTPO较rhIL-11的不良反应更少,具有良好的安全性,值得临床进一步推广应用。     

血小板生成素的研究新进展

血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是血小板产生过程中关键性的调节因子，又称巨核细胞生长衍生因子。TPO可与巨核细胞上的表面受体c-Mpl结合，然后再通过多种信号通路来活化巨核细胞，促使巨核细胞发生增殖和分化从而产生血小板，继而达到提高循环中血小板水平的目的。目前，国内外已经对TPO进行了分离和克隆，并对它的蛋白结构、表达调控、生物学活性及其在临床疾病中的治疗效果进行了大量研究。这些研究揭示了TPO的新来源及其与红细胞生成素(erythropoietin，EPO)结构的异同点、TPO在体内浓度的维持机制、各代TPO药物的优缺点；同时也报道了TPO不仅在常见的血小板减少性疾病中具有良好治疗效果，对除外血液系统的其他器官或细胞也有积极的保护作用，如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、肝硬化等疾病。这一系列的研究进展发对于TPO的临床应用具有重要的指导意义，本文就上述最新进展作一综述。