A23187联合IFN-γ诱导人外周血单个核细胞生成树突状细胞

目的:研究钙离子载体(calcium ionophore, CI)A23187 联合γ- 干扰素(IFN-γ) 诱导健康人外周血单个核细胞(PBMNC) 生成树突状细胞(DC), 探索DC 扩增的新方法。方法:分离健康人PBMNC, 分别加入GM-CSF +IL-4, A23187, A23187+IFN-γ。体外培养72 h 后, 分别于光镜、电镜下观察细胞的形态, 流式细胞仪检测细胞表面标志, M 比色法检测其对同种异体T 细胞的刺激增殖作用, ELISA 检测IL-12 和IFN-γ 的水平。结果:健康人PBMNC在A23187+IFN-γ 的条件下培养72 h 后, 与GM-CSF +IL-4 组, A23187 组比较, 能迅速获得典型的树突状细胞形态;CD40, CD83, CD86 分子的表达较均明显升高(P<0.01), 但CD1a 分子的表达明显下降(P<0.01);具有明显刺激同种异体T 细胞增殖的能力;IL-12, IFN-γ 的水平比其他组明显增高(P<0.01)。结论:A23187 联合IFN-γ 诱导健康人PBMNC 能更快速、有效地诱导生成成熟的DC。     

钙离子载体联合GM．CSF体外诱导外周血单核细胞生成树突状细胞

目的：利用新型诱导剂钙离子载体A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）体外诱导人外周血单核细胞（PBMC）生成树突状细胞（DCs）。方法：采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,按不同培养方法分成：传统方法组,rhGM-CSF＋重组人白介素-4（rhIL-4）＋重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）;新型诱导剂组,加入rhGM—CSF4＋A23187。光镜观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DC细胞的表面标志,MTT比色法检测各组DCs刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力。结果：与传统方法相比,A23187联合rhGM—CSF诱导培养的DCs更具有典型的树突形态;DC表面分子CD83D1a、CD86、CIM0表达（45．2％、31．5％、40．1％、36．4％）较传统方法组（16．9％、20．4％、26．5％、22．3％）明显上调（P〈0．05）,而CD14表达（5．7％vs19．0％）明显下降（P〈0．05）,刺激同种异体T细胞增殖的能力更强。结论：新型诱导剂钙离子载体A23187联合GM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟的DCs。     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。     

从脐血单个核细胞诱导树突状细胞

探讨了从脐血单个核细胞定向诱导 DC的方法以进一步研究树突状细胞的功能与特性。从脐血中获取单个核细胞 ,在培养液中加入 GM- CSF、TNF- α、IL- 3、IL- 4,培养 1 4d后流式细胞仪分析细胞表面标志 CD1 a;培养末期加入 LPS,流式细胞仪分析细胞表面标志 CD83及 HLA- DR。发现用 GM- CSF+TNF-α+IL - 4可获得 ( 3 6 .79± 3 .1 5 ) % CD1 a+ 细胞 ,LPS可使 CD83及 HLA- DR的比例从 ( 0 .5 7± 0 .5 6 ) %及 ( 40 .2 7± 6 .3 3 ) %分别升至 ( 3 2 .79± 1 2 .90 ) %及 ( 95 .5 2± 3 .45 ) %。实验证明脐血单个核细胞作为另一种主要来源 ,经特定细胞因子诱导可生成大量 DC,并能通过 LPS刺激 DC成熟     

A23187诱导慢性髓性白血病患者外周血单核细胞转化为树突状细胞的实验研究

目的　探讨钙离子载体A2 3187在体外能否诱导慢性髓性白血病 (CML)患者的外周血单核细胞 (pe ripheralbloodmonocytes,PBMC)向树突状细胞 (dendriticcells,DC)分化及细胞分化后的免疫活性研究。方法　分离初诊CML患者的PBMC ,用含rhGM -CSF和 (或 )A2 3187的培养液培养 4 0h ;高倍显微镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测诱导前后细胞表面HLA -DR ,CD80 ,CD86和CD83分子的表达 ,MTT比色法检测其对混合T淋巴细胞的刺激增殖作用 ,ELISA试剂盒检测上述方法培养的细胞刺激T淋巴细胞前后 ,上清液中IL - 2及γ -INF水平的变化。结果　CML患者的PBMC经A2 3187联合rhGM -CSF共同培养 4 0h ,具有典型的树突状突起 ,高表达HLA -DR ,CD80 ,CD86和CD83分子 ,具有较强刺激混合T淋巴细胞增殖的能力 ,刺激前后的T淋巴细胞培养液上清中 ,IL - 2及γ -INF的水平有明显差别。结论　体外利用A2 3187联合rhGM -CSF在 4 0h内 ,可将CML患者的PBMC诱导成成熟的DC。     

小剂量γ射线辐照外周血单个核细胞对人前列腺癌LNCaP细胞的杀伤作用

目的 观察小剂量γ射线辐照外周血单个核细胞对培养人前列腺癌细胞系LNCaP细胞的杀伤作用.方法 实验设LNCaP肿瘤细胞对照组、单纯外周血单个核细胞对照组、照射和未照射的外周血单个核细胞与肿瘤细胞共培养组,照射剂量为0.5-3 Gy,剂量率为17Gy/min.利用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法,观察外周血单个核细胞对LNCaP细胞的杀伤情况.结果 外周血单个核细胞在照射后各组培养至144 h均有大量细胞死亡.存活细胞明显少于未照射组,培养至240 h时,照射与非照射组中存活的外周血单个核细胞均减少,但是在照射的各组中减少更为明显.在外周血单个核细胞与LNCaP肿瘤细胞共培养组中,各照射组问在培养72 h内无明显差异,在共培养96～240 b时.0.5～2Gyγ射线照射外周血单个核细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用明显增强,尤其以1Gy照射组更为明显.而2.5与3Gyγ射线辐照组以及未照射外周血单个核细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显低于0.5～2 Gy各组,在培养至240h时,仍有肿瘤细胞存活并出现增生.结论 γ射线辐照对某些外周血单个核细胞有损伤作用,0.5～2Gyγ射线辐照的外周血单个核细胞杀伤肿瘤细胞活性增强,而2.5Gy和3Gyγ射线辐照对分离后的外周血单个核细胞对肿瘤细胞杀伤有抑制作用.     

诱导高纯度树突状细胞的研究

目的：研究树突状细胞（Dendritic cells,DCs）的分离和诱导方法,获得高纯度树突状细胞。方法：优化外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）的分离条件,二次洗脱非贴壁细胞。应用流式细胞技术检测PBMCs中CD14＋细胞纯度,检测CD80＋、CD83＋、CD86＋及HLA-DR的阳性率确定DC纯度。结果：经流式细胞仪检测,实验组PBMCs中CD14＋细胞表达率及成熟DC的CD80＋、CD83＋、CD86＋及HLA-DR的阳性表达率显著高于对照组（P〈0.05）。结论：本研究的诱导方法可得到高纯度的树突状细胞。     

GM—CSF重组腺病毒诱导人外周血树突状细胞

将ＧＭ－ＣＳＦ腺病毒颗粒转入人外周血单核细胞,从而找到了一种诱导,扩增ＤＣ的新途径。进一步的同种混合淋巴细胞反应提示,这种ＤＣ比常培养的人外周血ＤＣ有更强的激发Ｔ细胞的能力。     

再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞T-bet表达及其意义

目的:探讨外周血单个核细胞T-bet表达与再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)发病之间的关系。方法:半定量RT-PCR法检测17例初诊AA患者和20名健康者外周血单个核细胞(PBMC)T-bet的表达,ELISA法检测血浆干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果:初诊AA患者PBMC中T-bet表达和血浆IFN-γ水平均显著高于正常对照组(P<0.01),两者呈正相关关系(P<0.05)。结论:T-bet和IFN-γ表达的增高在AA的免疫病理学中可能起着重要作用。     

脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞向树突状细胞的分化

目的 探讨人脐静脉内皮细胞对人脐血单个核细胞(UBMCs)向树突状细胞(DC)分化的影响,建立更便捷、更经济体外培养DC的方法.方法 胶原酶消化分离出脐静脉内皮细胞(HUVEC),经鉴定和体外培养扩增后,使其平铺生长于Transwell板上室底部,将UBMCs接种到Transwell小室内,同时加入EC9706细胞冻融形成的蛋白质抗原,与HUVEC共培养,使UBMCs与HUVEC紧密接触并从Transwell板上室迁移到下室,收集Transwell板下室细胞,流式细胞术检测下室细胞DC相关表面标志CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC分子;通过MTT法检测肿瘤负载的UBDC诱导CTL对     

慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞诱生树突细胞的体外研究

目的 :体外诱生慢性粒细胞白血病 ( CML)患者外周血单个核细胞 ( PBMNCs)为树突细胞( DCs)。方法 :CML患者 PBMNCs在含 GM- CSF、IL- 4、TNF- α的培养液中培养 1 4d,倒置显微镜、电镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测细胞的表面标志 ,免疫磁珠 ( MACS)富集所诱生的 DCs,用D- FISH、RT- PCR方法检测 DCs的白血病源性。利用 MTT法检测所诱生 DCs刺激 T细胞增殖能力。结果 :所诱生的细胞高表达 CD80 、CD86、CD1a、HLA- DR,电镜下细胞表面有丰富突起 ,细胞浆内有丰富线粒体 ,D- FISH、RT- PCR检测所诱生的 DCs具有 bcr/abl融合基因。CML DCs具有刺激 T细胞增殖能力。结论 :体外利用 CML患者 PBMNCs成功诱导生成了来源于 CML细胞的 DCs( CML DCs)。     

人外周血诱导DC1 DC2方法的初步探讨

目的：探讨人外周血单个核细胞(PBMC)体外诱导DCl、DC2的条件。方法：体外用细胞因子GM-CSF IL-4/ TNF-α及IL-3 G-CSF／ TNF-α来分别诱导DC。结果：用GM-CSF IL-4／ TNF-α诱导出CDl23^ DC2和CDl23^-DCl细胞，而采用G-CSF IL-3／ TNF-α未能诱导出CDl23^ 的DC2细胞。结论：用人的外周血单个核细胞，在体外用细胞因子组合GM-CSF IL-4／ TNF-α可以诱导出CDl23^ DC2和CDl23^-DCl细胞。     

TPA诱导外周血单个核细胞聚集的研究

应用不同浓度ＴＰＡ诱发聚集，光电比色法检测３５名正常人，４３例白血病患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）以及Ｋ５６２和Ｌ１２１０细胞聚集率。５～１０００ｎｇ／ｍｌＴＰＡ可诱导ＰＢＭＣ稳定聚集，但不能使Ｋ５６２白血病细胞株细胞发生聚集，当Ｋ５６２和Ｌ１２１０细胞与１０ｎｇ／ｍｌＴＰＡ共同孵育５天后，其将对ＴＰＡ出现低于正常ＰＢＭＣ聚集反应，ＴＰＡ诱导的白血病患者ＰＢＭＣ聚集率明显低于正常人，且与幼雅细胞     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

慢性乙型肝炎外周血树突状细胞的功能障碍机制的初步探讨

目的:探讨慢性乙型肝炎者树突状细胞(DCs)的功能状态及机制。方法:以直接荧光法进行表型分析、CCK8法测定DCs对同种异体淋巴细胞的刺激作用、AnnexinV/FITC法测定细胞凋亡率进行分析。结果:慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞经诱导分化形成的DCs,与正常人相比,表达协同刺激分子CD80、CD86水平均较低;刺激同种异体淋巴细胞增殖能力也低于正常人;DCs凋亡率明显增高。结论:慢性乙型肝炎患者外周血的DCs免疫功能处于抑制状态,而HBV感染导致的DCs凋亡增多可能是引起DCs功能障碍的原因之一。     

脐血单个核细胞体外诱导树突状细胞联合CTLs抗肿瘤效应的研究

目的探讨从人脐血中定向诱导扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs)的方法及其在抗肿瘤免疫治疗中的作用.方法常规无菌采集新鲜脐血,密度梯度离心分离脐血单个核细胞(cord b lood mononuc learcells,CBMCs),加入细胞因子(GM-CSF IL-4 TNF-α)定向诱导培养并进行相应的表型鉴定.观察肿瘤抗原负载后诱导特异性细胞毒T淋巴细胞生成和对肿瘤细胞杀伤作用.结果从人脐血分离到的CBMCs经GM-CSF IL-4 TNF-α共同培养后,第7天镜下即可见典型形态的DCs,细胞表型检测见CD1 a 细胞比例增加到(20.8±1.62)%.DCs负载肿瘤抗原后能诱导产生肿瘤特异性淋巴细胞,并可特异性抑制YTMLC肿瘤细胞.结论经细胞因子组合可以从脐血中诱导出DCs,并可诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cyto-toxic T-lymphocytes,CTLs)的产生,为进一步开展DCs的实验研究及临床应用奠定了基础.     

人外周血树突状细胞的体外培养及鉴定

目的在体外从人外周血中培养、鉴定树突状细胞。方法取正常健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,取贴壁细胞加入重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4,体外培养第7天,加入肿瘤坏死因子-α促进其分化成熟。用倒置显微镜观察其形态,用流式细胞仪进行表型测定。结果从正常人外周血分离获得的单个核细胞经rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养,获得大量树突状细胞。具有典型的树突状细胞形态和免疫表型,高表达HLA-DR,CD83,CD80,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。结论用rhGM-CSF,rhIL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞且高表达HLA-DR,CD80,CD83,CD86、HLA-DR CD83 及CD80 CD86 。     

人外周血树突状细胞体外诱导培养及表型鉴定

目的从健康人外周血中分离单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell,PBMC）,经体外诱导培养获取成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）.方法取健康人新鲜外周血,经密度梯度离心法分离,获得单个核细胞,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养.置37℃、5%CO2培养箱内静置培养2 h后除去悬浮细胞.培养液中加入rhGM-CSF和rhIL-4继续培养贴壁细胞5 d,然后加入TNF-α促进其分化成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪（flowcytometer,FCM）对其进行表型鉴定.结果显微镜下观察DC细胞形态不规则,表面有大量的毛刺状突起;成熟DC细胞表面CD83、CD80分子表达明显增高.结论用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α联合培养可以从健康人外周血诱导培养出成熟的树突状细胞.     

高三酰甘油血症与健康个体外周血单核细胞分化为泡沫细胞的比较

目的:建立人单核细胞源性泡沫细胞模型;比较高三酰甘油血症个体单核细胞与健康个体单核细胞发生泡沫化的程度.方法:采用密度离心法和玻璃粘附法分离纯化来源于高三酰甘油血症个体和健康个体外周血单核细胞,置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中培养,加入PMA(100 nmol/L)诱导3 d以分化为巨噬细胞;对照组加培养基,实验组(高三酰甘油血症个体组、健康个体组)加ox-LDL(100 mg/L)诱导2 d以分化为泡沫细胞.油红O染色鉴定泡沫细胞形态学特征,镜下计算脂滴占胞浆超过1/3以上的细胞占总细胞数的百分比.结果:油红O染色显示,与ox-LDL共孵育2 d后,细胞中出现大量的红染脂滴颗粒,形成泡沫细胞.高三酰甘油血症个体组红染脂滴占胞浆超过1/3以上的细胞占总细胞数的百分比与健康个体组相比,P＜0.05.结论:本实验方法可成功建立泡沫细胞模型;来自高三酰甘油血症个体单核细胞较健康个体单核细胞更容易被诱导形成泡沫细胞,且其泡沫化程度更高.     

宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞的生物学特性观察

【目的】探讨宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞(DC)的生物学特性。【方法】14例Ib期及以上的宫颈癌患者为研究组,24例健康女性为对照组。外周血经密度梯度离心得到单个核细胞,其中附壁成分在含GM-CSF/IL-4的完全淋巴细胞培养液培养。光镜和电镜观察培养细胞的形态变化。培养7d后,计算树突状细胞的产量,流式细胞术分析HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD1a和CD14的表达,同种异体淋巴细胞的混合淋巴反应(MLR)检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力。【结果】经过7d培养,两组均诱导出典型形态和表型的DC。宫颈癌患者单位体积外周血的未成熟DC(ImDC)的产量为67.3×106±33.8×106,较对照组低(P<0.05)。研究组的CD40、CD80和CD1a的平均荧光强度(MFI)分别为18±9,15±6和71±11,均较对照组低(P<0.05);而两组ImDC的HLA-ABC、HLA-DR表达强度相似(P>0.05)。相同PBL/DC比值,研究组ImDC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力下降(P<0.05)。【结论】宫颈癌患者的外周血单个核细胞培养的树突状细胞(ImDC)和健康对照组的ImDC具有免疫学差异,提示在应用树突状细胞进行免疫治疗时应考虑这种差异。