转染Ⅱ类分子反式激活因子基因突变体抑制猪SLA的表达

为观察CⅡTA基因突变体对猪SLA表达的影响，用指质体转染法将pcDNA3及CⅡTA突变体pcDNA3mCⅡTA2、pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4转染入猪血管内皮细胞系PIEC和猪B淋巴细胞系L23。利用流式细胞术/RT-PCR检测各种突变体对猪SLA-DR、-DQ分子/mRNA组成性和诱导性表达的影响。发现两种突变体pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对PIEC/L23细胞SLAⅡ类分子的表达起明显的抑制作用，而空载体pcDNA3和不具有起始密码子突变体pcDNA3mCⅡTA2无此作用。提示pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4能抑制猪SLAⅡ类分子的表达。     

两种抑制MHCⅡ类分子表达方法的比较

目的：评价cⅡTA（MHC classⅡ transactivator，CⅡTA）基因突变体和反义RNA对MHCⅡ类分子的抑制效率和胞内稳定性，为改造MHC分子奠定基础。方法：用PCR、酶切及连接技术，构建不含起始密码子的peDNA3mCⅡTA2，含起始密码子的peDNA3mCⅡTA3突变体及cⅡTA基因的反义RNA-pcDNA3／CⅡTAJ亘。用脂质体转染法，将突变体、反义RNA及空载体pcDNA3转入PIEC细胞和123细胞中。持续四个月，流式细胞术观察它们对PIEC／123细胞株MHCⅡ类（sLA-DR）分子的诱导性和组成性表达的影响。结果：转染pcDNA3、pcDNA3mCⅡTA2后，PIEC／123细胞SLA-DR的表达没有受到抑制，转染peDNA3mCⅡTA3后，9／20（45．0％）的PIEc细胞、10／20（50．O％）的L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制，抑制率高达90％以上；转染pcDNA3mCIITA＆后，7／15（46．7％）PIEC细胞、5／15（33．3％）123细胞sLA-DR的表达受到明显抑制，抑制率高达85％以上。持续检测4个月，转染peDNA3mCⅡTA3的PIEC／123细胞SLA-DR的表达受抑率均在90％以上。转染反义RNA的PIEC／123细胞在第65／45天。SLA-DR表达抑制率降至10％以下。结论：构建成功的CⅡTA突变体和反义RNA均能有效抑制sLA-DR表达，但CⅡTA突变体稳定存在于胞内的时间长，构建突变体是和用CⅡTA抑制MHCⅡ类分子的好方法。     

构建MHCⅡ类分子反式激活因子基因突变体抑制转染细胞HLAⅡ类分子的表达

目的：探讨MHCⅡ类分子反式激活因子（CⅡ\TA）突变体抑制HLAⅡ类分子表达的可能性。方法：构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2、含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3的含起始密码子及NLS（nuclear localization signal)的pcDNA3mCⅡTA4突变体。用脂质体转染法将上述3种突变体及pcDNA3空载体转入HeLa细胞和的Raji细胞。用流式细胞术和RT－PCR法观察它们对HeLa/Raji细胞HLA－DR／DQ分子的诱导性和组成性表达的影响。结果：在细胞和基因水平证实pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对HeLa/Raji细胞HLA－DR／DQ的表达起明显抑制作用，而pcDNA3mCⅡTA2和pcDNA3空载体无此作用。结论：成功构建的pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mⅡTA4能抑制HLAⅡ类分子的表达。     

构建可抑制HLA-DR/DQ表达的MHC-Ⅱ类分子反式激活因子基因的突变体及其机制

目的：构建能抑制MHC—Ⅱ类分子表达的MHC—Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator，CⅡTA)基因的突变体．并探讨其抑制MHC—Ⅱ类分子表达的机制。方法：用PCR、酶切及连接技术，构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2，含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3以及含起始密码子及NLS(nuclear localization signal)的pcDNA3mCⅡTA4突变体。用脂质体转染法，将上述3种突变体及空载体pcDNA3转入Hela细胞和Raji细胞中。用流式细胞术和RT-PCR法，观察他们对Hela／Raji细胞HLA—DR／DQ分子的诱导性和组成性表达的影响。将mCⅡTA4转移到对四环素浓度依赖的质粒pU-HD10-3上，通过改变培养环境中四环素的浓度，调节外源CⅡTA突变体的表达量，观察突变体的表达量与MHC-Ⅱ类分子受抑率的关系。结果：细胞和基因水平证实，pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对Hela／Raji细胞HLA-DR／DQ的表达均有明显的抑制作用；而pcDNA3mCⅡTA2和空载体pcD-NA3无此作用。MHC-Ⅱ类分子被抑制的程度与外源转入CⅡTA突变体(pUHD10-3mCⅡTA4)的量明显相关。结论：成功地构建pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4，并能抑制HLA-Ⅱ类分子的表达。初步证实CⅡTA突变体是通过与胞内的野生型CⅡTA竞争性结合反式激活蛋白，来抑制MHC-Ⅱ类分子的转录和表达。     

转染II类分子反式激活因子基因突变体抑制猪SLA的表达

为观察CIITA基因突变体对猪SLA表达的影响 ,用脂质体转染法将pcDNA3及CIITA突变体pcDNA3mCIITA2、pcDNA3mCIITA3和pcDNA3mCIITA4转染入猪血管内皮细胞系PIEC和猪B淋巴细胞系L2 3。利用流式细胞术 /RT PCR检测各种突变体对猪SLA DR、 DQ分子 /mRNA组成性和诱导性表达的影响。发现两种突变体pcDNA3mCIITA3和pcDNA3mCIITA4对PIEC/L2 3细胞SLAII类分子的表达起明显的抑制作用 ,而空载体pcDNA3和不具有起始密码子的突变体pcDNA3mCIITA2无此作用。提示pcDNA3mCIITA3和pcDNA3mCIITA4能抑制猪SLAII类分子的表达。     

CIITA反义RNA抑制MHC Ⅱ类分子表达

为探索利用CIITA(MHC eclass Ⅱ transactivator)基因反义RNA抑制MHC Ⅱ类分子表达的可能性，为CIITA的应用研究奠定基础。利用RT-PCR扩增能与CIITA cDNA第95至500bP互补的片段，并构建成pcDNA3/CIITA，重组质粒，脂质体转染法将其转入人HeLa／Raji细胞和猪PIEC／L23细胞，流式细胞术动态检测反义RNA对人／猪MHCⅡ类分子的抑制率和抑制程度。结果显示HeLa、Raji、PIEC和L23四种细胞MHC Ⅱ类分子受抑制率分别为46．7％(7／15)，40％(6／15)，46．7％(7／15)和33．3％(5／15)。典型受抑克隆细胞MHC Ⅱ类分子受抑程度高达85％，反义RNA对MHC Ⅱ类分子的抑制时间持续35-50d。CIITA反义RNA能有效抑制人／猪MHC Ⅱ类分子的表达，它在自身免疫和移植免疫中有一定的应用前景。     

一种新的CIITA显性负向突变体的构建和功能研究

II类反式激活因子(CIITA)参与MHC II类基因转录表达的调控,本研究采用RT-PCR等分子克隆技术构建含起始密码子和NLS序列,但是删除N和P/S/T结构域的CIITA突变体质粒pCDNA3.1(+)mCIITA,用脂质体转染法将上述突变体及pCDNA3.1(+)空载体转入来源于BALB/c小鼠的1B4.B6细胞株,用流式细胞术和RT-PCR观察I-A分子表达的影响,并通过混合淋巴细胞反应观察C3H小鼠CD4+T细胞对转入突变体及空载体的1B4.B6细胞的免疫应答强度。结果在细胞和分子水平证实pCDNA3.1(+)mCIITA对1B4.B6细胞I-A的表达起明显抑制作用,强阳性克隆抑制率为90%以上。细胞已基本丧失了对受者CD4+T细胞的刺激能力。以上结果为减低同种异体/异种器官细胞性排斥提供了新的思路和手段。     

小鼠pIV启动子调控CⅡTA突变体重组腺病毒表达选择性抑制MHC Ⅱ类分子的表达

目的：观察受CⅡTA-pIV启动子驱动的MHCⅡ类分子反式激活因子突变体（CⅡTAm）重组腺病毒对MHCⅡ类分子表达的选择性抑制作用，并探讨其相关机制。方法：构建了N-端酸性氨基酸区缺失了118aa的CⅡTA突变体及其CⅡTA-pIV启动子驱动的重组腺病毒Ad-pⅣ-CⅡTAm，将Ad-pIV-CⅡTAm或对照腺病毒Ad-GFP感染小鼠内皮细胞株SVEC细胞和转染巨噬细胞株J774细胞，并以IFN-γ刺激。用RT-PCR检测野生型和突变型CⅡTA mRNA的表达，用流式细胞术检测MHCⅡ类分子在细胞表面的表达。结果：成功构建CⅡTA-pIV启动子调控下的CⅡTA突变体基因重组腺病毒表达载体Ad-pIV-CⅡTAm；该腺病毒介导的CⅡTA突变体mRNA在SVEC和J774细胞内的表达受到IFN-7的上调，同时抑制这些细胞上诱导型和组成型MHCⅡ类分子的表达。结论：Ad-pIV-CⅡTAm重组腺病毒是一种WN-γ调控型表达载体，可有效地抑制受感染细胞上MHCⅡ类分子的表达。     

MHCⅡ类反式激活因子基因的克隆、鉴定及初步功能测定

目的 克隆MHCⅡ类反式激活因子（class Ⅱ rtansactivator,CⅡTA）基因并进行初步功能测试，为CⅡTA的应用研究奠定基础。方法 RT－PCR扩增CⅡTA基因，将其克隆到pGEM-T载体上并进行酶切和测序鉴定，用EcoRⅡ、XhoⅠ将CⅡTA定向克隆到表达载体pcDNA3上，用脂质体转染法将pcDNA3/CⅡTA转入HeLa细胞；流式细胞术观察细胞表面HLA－DR／DQ的表达变化。结果 成功克隆CⅡTA基因，CⅡTA的转入使HeLa细胞表面表达HLA－DR／DQ分子。结论 转入CⅡTA能使HeLa细胞表面表达MHCⅡ类分子表达，CⅡTA参与调控MHCⅡ类基因的转录和表达。     

恒河猴(Macaca mulatta)主要组织相容性复合体及其与SIV/SAIDS疾病进程关系的研究进展

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）是脊椎动物染色体上一组紧密连锁的基因群，人MHC位于6p21．3上，恒河猴MHC定位在6q24上。MHC可分为三大基因群，分别称为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。MHC编码的糖蛋白称MHC分子，典型的MHCI类分子几乎表达于所有类型的细胞，主要与内源性抗原肽结合并递呈给CD8^＋杀伤性T细胞，导致靶细胞死亡；MHCⅡ类分子主要表达于免疫系统细胞，能够结合外源抗原肽并呈递给CD4^＋辅助性T细胞。它们在针对病原生物的免疫应答中发挥着重要的作用。     

人外周血T细胞系间接识别SLAⅠ类分子引起的异种细胞增殖反应

目的 确认猪→人异种移植中存在针对猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)Ⅰ类分子的间接识别而引起的急性细胞性排斥。方法 用纯化的中国版纳猪SLA Ⅰ类P1基因工程蛋白为抗原，体外反复刺激健康人外周血T细胞，建立P1特异性T细胞系。观察抗原特异性CD4 T细胞系在自身APC存在下对版纳猪外周血单个核细胞与软骨细胞的反应性，以及HLA-DR单抗与氯喹的阻断作用。结果 建立10株SLA Ⅰ类P1抗原特异性T细胞系，其中8株以TCRαβ CD4 为主要表型，将其合并使用。该CD4 P1特异性T细胞系在自身APC存在下对相同品系版纳猪PBMC与软骨细胞均产生显著增殖反应。经抗人HLA-DR单抗与氯喹处理均能明显阻断其增殖反应。结论 健康人外周血T细胞可通过间接识别SLAⅠ类抗原对版纳猪细胞产生明显应答。     

建立猪MHCⅠ类抗原特异性人T细胞系的探讨

目的　建立间接识别中国版纳猪SLAⅠ类P1分子的特异性人T细胞系的方法 ,以进一步研究SLAⅠ类分子的间接识别在猪→人异种细胞性排斥中的作用。方法　以E·coli中表达并纯化的SLAⅠ类分子P1为抗原 ,体外反复刺激健康人PBMC ,3H TdR掺入法筛选特异性增殖的T细胞 ,FACS作表型初步分析。结果　初步测定健康人外周血版纳猪SLAⅠ类P1分子特异性T细胞反应频率约 6 .67× 1 0 - 7,所建 4个T细胞系表型均为TCRαβ+ ,其中 3株以CD4+ 为主 ,1株以CD8+ 为主。结论　利用E .coli表达的纯蛋白抗原可建立间接识别版纳猪SLAⅠ类P1分子的特异性人T细胞系。     

CⅡTA M1-RNA对MHCⅡ类分子表达的抑制作用

目的探讨MHCⅡ类分子转录激活因子（CⅡTA）的M1-RNA对细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制。方法M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位，设计并克隆针对CⅡTA第452、629位点的M1-RNA（分别为M1-452-GS、M1-629-GS）及其相应的CⅡTA靶基因，分别插入pUC19、pGEM-7zf（＋）载体，进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作甩明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体（psNAV-M1-629-GS，pA629）并稳定转染ECV304细胞株，流式细胞术检测经典的MHCⅡ（HLA-DR、-DP、-DQ）类抗原表达，RT-PCR检测CⅡTA的mRNA水平。结果pA629阳性ECV304细胞株与对照组比较，HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了89．21％及92．31％；同时CⅡTA的mRNA含量降低（P〈0．05）。结论CⅡTA的M1-RNA（M1-629-GS）降低了自身mRNA含量，从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。     

CHTA调控MHC-Ⅱ类分子表达分子机制的研究进展

MHC—Ⅱ类分子抗原处理、提呈通路在调控CD4＋T细胞激活及特异性应答的过程中发挥重要的作用，T细胞的功能在很大程度上取决于MHC—Ⅱ类分子的表达水平。因此，精细调节MHC—Ⅱ类分子的表达对于免疫应答的控制是至关重要的。MHC—Ⅱ类分子的组成性表达仅限于特化的抗原提呈细胞，如树突状细胞（dendritic cell，DC）及B淋巴细胞。但是，在不表达MHC-Ⅱ类分子的细胞中，多种刺激特别是干扰素1（IFN-γ）可诱导该分子的表达。     

腺病毒介导CⅡTA突变体基因转移抑制MHCⅡ类分子表达的体外研究

目的:构建携带小鼠MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ molecule transactivator,CⅡTA)突变体基因的腺病毒,并观察腺病毒介导该基因的表达情况以及表达产物的体外功能.方法:采用常规分子生物学方法从IFN-γ诱导后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中获得Ⅳ型CIITAcDNA;利用重叠延伸PCR法构建CIITA突变体基因,并克隆入表达载体pIRES;采用pAdEasy-1系统获得具有感染能力的、携带CIITA突变体基因的缺陷型重组腺病毒(Ad-CIITAm)和空载对照病毒(Ad-GFP),并经大量扩增、纯化及滴度测定;将Ad-CⅡTAm和Ad-GFP分别感染HeLa细胞和Raji细胞,流式细胞术观察对诱导型和组成型HLA-DR分子表达的影响.结果:成功克隆了小鼠CⅡTA突变体基因,并构建了携带小鼠CⅡTA突变体基因的重组腺病毒Ad-CⅡTAm;经流式细胞术证实感染Ad-CⅡTAm的Hela和Raji细胞较感染Ad-GFP的细胞,其表面HLA-DR分子的表达均受到明显的抑制.结论:本实验证实了重组腺病毒介导表达的小鼠CⅡTA突变体在体外能够有效地抑制MHCⅡ类分子的表达.     

MHCⅡ类分子转录激活因子锤头状核酶的生物学活性

目的 探讨MHCⅡ类分子转录激活因子（CⅡTA）锤头状核酶抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。方法设计并克隆针对CⅡTA第464位点的锤头状核酶（Rz464）及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性鉴定,进一步将Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP（pIRES2-EGFP-Rz464,pRz464）,并稳定转染Raji细胞株,流式细胞术检测经典的MHCⅡ（HLA-DR、-DP、-DQ）类抗原表达,RT-PCR分析CⅡTA mRNA水平。结果细胞外活性鉴定表明,Rz464具有明显的切割活性。细胞内切割实验显示：pRz464阳性Raji细胞表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低了75．93％、64．14％、78．32％;同时CⅡTA的mRNA含量降低（P〈0．05）。结论抗CⅡTA锤头状核酶Rz464可有效抑制MHCⅡ类抗原的表达。     

人T细胞对猪白细胞抗原的直接识别

猪已被认为是异种移植的最理想供体。有关人 猪器官间超急性排斥研究已有所突破 ,而细胞性排斥报道尚少。本文用混合淋巴细胞反应体系研究异种移植细胞性排斥机制 ,发现异种反应明显弱于同种反应 ,而且以直接识别为主 ,这和同种移植细胞性排斥机制一致。抗人CD4单抗和抗猪白细胞抗原SLA DR、DQ单抗都能明显地抑制 (XMLR) ,而抗人CD8单抗无抑制功能 ,表明CD4+T细胞对SLA的识别在异种排斥应答中起重要作用     

阿托伐他汀对实验性自身免疫性心肌炎MHCⅡ类分子表达的调节作用

目的探讨阿托伐他汀对实验性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis,EAM）的作用及对心肌MHCⅡ类分子表达的影响.方法以纯化猪心肌肌球蛋白免疫Lewis大鼠诱导EAM模型.随机分为阿托伐他汀治疗组和未治疗组.治疗组给予阿托伐他汀每天10 mg/kg,未治疗组给予等体积饮用水,分别以灌胃器给药,连续用药3周.以未免疫的同周龄Lewis大鼠为正常对照组.用药21 d后,检测超声心动图,脾T淋巴细胞增殖试验、HE染色观察心肌组织炎症浸润程度,免疫组化检测心肌内CD4＋或CD8＋T细胞的浸润及心肌组织MHCⅡ类分子的表达.RT-PCR检测心肌Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅳ型MHCⅡ类分子转录活化因子（classⅡ transactivator,CⅡTA）启动子转录.结果阿托伐他汀显著改善EAM大鼠心功能,治疗组心肌组织炎症浸润减轻,MHCⅡ类分子表达减少,抗原诱导的T淋巴细胞增殖显著受抑制.Ⅳ型CⅡTA启动子表达下调,而Ⅰ、Ⅲ型CⅡTA启动子表达与未治疗组比较差异无统计学意义.结论阿托伐他汀显著改善EAM大鼠心功能及组织病理学表现,其机制可能通过下调Ⅳ型CⅡTA启动子转录,抑制心肌非专职性APC MHCⅡ类分子表达.表明他汀类对EAM具有免疫调节效应,从而在器官特异性自身免疫性心肌损伤的治疗中具有应用前景.     

MHCⅡ类反式激活因子与病毒感染的关系

MHCⅡ类反式激活因子（ClassⅡ transactivator，CⅡTA）通过调控细胞是否表达MHCⅡ类分子及其水平而决定宿主是否对外来病毒感染产生免疫应答及其程度，从而影响病毒感染的发生、发展与转归。本文介绍了CⅡTA的结构与功能、IFNγ诱导MHCⅡ类基因表达的机制及CⅡTA分子与病毒间的相互作用。     

CⅡTA锤头状核酶的克隆及其体外活性

通过CⅡTA核酶抑制HeLa细胞表面MHC Ⅱ类分子的表达.设计并合成针对人类CⅡTA的核酶Rz464,通过体外转录和切割实验鉴定其活性.将Rz464亚克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP(pRz464),并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测MHC Ⅱ类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA mRNA水平.结果表明,Rz464与CⅡTA靶序列体外切割产物电泳见预期切割条带.pRz464+HeLa细胞与对照组比较,HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79.21%、90.31%及48.30%;同时CⅡTA的诱导型mRNA含量明显减少.Rz464通过切割CⅡTA mRNA,进而阻止了后者调控的MHC Ⅱ类分子的表达.