人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库的构建

为构建人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,从脑胶质瘤患者外周血淋巴细胞 (PBL)中提取细胞总RNA ,经逆转录后用套式PCR分别扩增抗体轻链Vκ和重链VH基因。先构建Vκ基因库 ,并使连接Vκ和VH基因的linker与Vκ基因连接 ,再将VH基因克隆入Vκ基因库 ,即构建成功单链抗体 (ScFv)库。随机挑取菌落鉴定 ,测序表明从PBL中扩增出人源性Vκ和VH基因 ,并构建了库容量约为 2× 10 6的ScFv噬菌体抗体库。随机挑取克隆的测序表明 ,测定的VH基因与Kabat的抗体基因库中人抗体VH基因有较高的同源性 ,证明所克隆的基因属人抗体可变区基因。结果表明实验构建成人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,为进一步筛选人源性抗脑胶质瘤抗体奠定了基础     

全合成人源性噬菌体抗体库的构建

目的:构建全合成人源性噬菌体抗体库。方法:选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成,同时人工设计合成半随机CDR3,通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因。然后利用限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ分别双酶切抗体基因和噬菌体展示载体。连接后的重组噬粒通过电击转化的方法转入大肠杆菌TG1,构建抗体库。结果与结论:PCR结果显示,通过优化后的方法能在保证抗体库多样性的前提下,高效地获得抗体基因。经过数十次电击转化构建了库容量为2×109的全合成抗体库,菌落PCR、测序及筛选结果表明,抗体库质量优良,为筛选人源性治疗抗体奠定了基础。     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗生存素(survivin)的人源单链抗体(single chainfragment variable,scFv)并进行鉴定。方法以survivin为抗原,固化在抗原管上,通过吸附—洗脱—扩增过程,从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性噬菌体抗体,并转染HB2151菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导制备成可溶性抗体,采用酶联免疫吸附测定法对其抗原结合活性进行检测,指纹图谱分析法分析抗体基因的种类。结果经过4轮筛选,共获得21个与survivin结合的阳性克隆,其中10个特异性结合的克隆,指纹分析有8种不同的抗survivin的scFv基因,在这8种中有5种获得可溶性表达。结论利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗生存素抗体,为其在今后肿瘤治疗中的应用奠定基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术,将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型(抗-Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒,经SfiI／Not I酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,应用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1-Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv进行硫酸铵沉淀,并进行SDS-PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗-Id scFv片段基因由774bp组成。SDS-PAGE电泳表明,大肠杆菌XL1-Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗-Id scFv分子量约28kD。结论 HCV核心蛋白抗-Id scFv与HCV核心蛋白抗-Id scFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗-Id scFv的筛选和表达成功,为今后HCV核心蛋白抗-Id scFv的研究和应用奠定了基础。     

抗地高辛人源小分子抗体的获取

目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛抗体,并构建双体抗体.方法 以固相化的地高辛对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,3～4轮后挑取克隆用酶联免疫吸附测定方法鉴定其特异性,对抗地高辛阳性抗体克隆进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的克隆进行改造,构建双体抗体.结果 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得了4株可与地高辛特异性结合的人源抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同克隆基因,阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第一亚群,重链分别属于第三和第四亚群.选取4号克隆进行基因改造,构建双体抗体表达载体,获得了活性较好的双体抗体.结论 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的双体抗体,可能为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体.     

大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证

目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库.方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染Cre 菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOI<1)感染XL1-Blue,获取次级工作库.分别用5种不同抗原进行筛选,所获阳性克隆送测序以获取抗体基因.结果:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库容1.8×1011,5种不同抗原筛选均得到特异性结合噬菌体抗体;测序结果表明,所获取抗体涵盖了不同的基因亚群,进一步证明抗体库具有良好的多样性.结论:经Cre/Loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体.     

抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展

噬菌体抗体库作为噬菌体展示和抗体库2种技术的集合体,可以不需经过免疫而直接获取各种人源抗体,目前已广泛应用于生物学及医学等领域.在通常使用的噬菌粒系统中,使用野生型辅助噬菌体会导致"噬菌体污染",使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段,这对抗体库的筛选工作非常不利.近年来,研究人员通过对噬菌体衣壳蛋白基因(g3)部分缺失、引入琥珀突变、构建新型辅助噬菌体或辅助质粒等策略,不仅有效避免了辅助噬菌体污染问题,使抗体展示效率提高了5～20倍,进而通过增加单价抗体展示在每个噬菌体表面,使抗原结合能力提高400倍,并且在第二轮筛选中即可得到有效富集(阳性克隆率超过50%).本文综述了近年来应用在噬菌体抗体库的一些新型的辅助感染系统.     

新型pⅨ噬菌体展示系统的建立及初步评价

目的:构建新型噬菌体展示载体,评价其展示效果,为构建scFv库寻找新的展示体系。方法:PCR分离、扩增M13KO7中pⅨ蛋白编码基因,克隆入噬菌体展示载体PHB-gⅢ,替换原载体中的gⅢ-CT段,构建载体PHB-pⅨ,并将相对分子质量约50×103的碱性磷酸酶的编码基因分别克隆入两展示载体,观察其展示碱性磷酸酶能力的差别。结果与结论:成功构建了展示载体PHB-pⅨ,该载体具有与PHB-gⅢ相当的展示碱性磷酸酶的能力,且相同滴度的PHB-gⅢ噬菌体DNA含量略高于PHB-pⅨ噬菌体DNA含量,提示PHB-gⅢ系统展示外源蛋白时存在感染能力下降。PHB-pⅨ系统具有用于展示噬菌体抗体库的良好应用前景。     

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法，制备抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗HCV NS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板，应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选82个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定，获得与HCV NS4A单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS4A特异性抗－Id scFv的编码基因进行序列测定分析。结果：经过筛选82个克隆中有40株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应，确定其中有7株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆。提取质粒，进行DNA序列测定，DNA为789bp。本实验结果提示，用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCV NS4A的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。     

基因工程抗角蛋白人抗体的制备与鉴定

目的　制备亲和力高、性能良好的人源性抗角蛋白抗体。方法　以人表皮角蛋白为抗原从噬菌体抗体库中克隆特异性抗角蛋白抗体 ,采用链替换 (chain shuffling)技术对所获抗体进行亲和力成熟 ,并对其生物学性能进行一系列鉴定。结果　经过筛选半合成噬菌体抗体库 ,成功获得了能与角蛋白特异性结合的人源性抗角蛋白抗体 ;选择其中活性最好的一株抗体 ,通过轻链替换和重链替换使抗体亲和力得到了有效提高 ,达到8× 10 1 0 mol的理想水平。结论　用基因工程的方法可以制备高质量的人源性抗角蛋白抗体 ,为其功能和临床应用的进一步研究打下了基础     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段基因的构建与表达

目的 构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv（dsFv）抗体基因,并在原核系统中实现高效表达,制备有活性的人源抗狂犬病毒dsFv抗体片段。方法采用PCR定点突变的方法,构建抗狂犬病毒dsFv抗体的重、轻链（VH、VL）突变基因,NdeⅠ和NotⅠ双酶切后分别插入pET-22b（＋）表达质粒中,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达。将VL、VH包涵体蛋白经盐酸胍变性,按比例混合在复性折叠缓冲液中,使二者折叠形成dsFv抗体片段。并以其母本抗体scFv作对照,对其抗原特异性和稳定性进行初步评价。结果 在VH的第44位氨基酸和VL的第100位氨基酸引入了半胱氨酸,成功构建了抗狂犬病毒dsFv抗体基因,并在原核系统中实现了对二者的高效表达,VH、VL蛋白在复性缓冲液中正确折叠形成了dsFv抗体片段。结论 对筛选获得的抗狂犬病毒scFv成功进行了稳定性改构,制备了有活性的dsFv抗体片段,改构以后的dsFv保持了对狂犬病毒的特异结合活性,而其在血清中的稳定性有明显改进,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

单链抗体的研究进展

抗体技术由细胞工程抗体（杂交瘤－单克隆抗体）发展到基因工程抗体，尤其是抗体库技术的出现，将抗体工程发展到了一个新阶段，本从抗体库技术等方面介绍单链抗体（single-chain Fv antibody,scFv)的进展情况。     

抗Sclerostin单链抗体基因的构建、表达及活性分析

目的 构建抗Sclerostin（SOST）单链抗体原核表达载体并对表达蛋白进行活性分析.方法 提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体轻链可变区基因（VL）和重链可变区基因（VH）并通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法,在VL和VH基因之间引入Linker（Gly4Ser）3,连接成单链抗体SOST-scFv（VL-Linker VH）.将scFv基因克隆至表达载体PET-22b（＋）后转入HEK293细胞进行分泌表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA和West-blot检测表达蛋白的反应活性,茜素红结节染色法评估单链抗体对体外培养骨髓间充质干细胞成骨矿化的影响.结果 VL基因序列全长为339个碱基对,VH基因序列全长330个碱基对,均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,而SOST-scFv基因全长包括4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）以及具有抗体特征性的2个半胱氨酸残基;本研究构建的scFv全长687个碱基对,VL-Linker-VH为连接结构,SDS-PAGE分析表明大肠杆菌表达的scFv为可溶性蛋白,ELISA和West-blot检测证实表达scFv具有与SOST特异性结合的活性,细胞实验结果证实scFv能够促进骨髓间充质细胞成骨分化及矿化结节的形成.结论 成功构建抗SOST单链抗体表达载体,而且表达的scFv产物具有确切的免疫结合活性以及体外诱导成骨分化、矿化作用,为该抗体应用于骨质疏松疾病治疗奠定了实验基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗－HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选60个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV核心蛋白特异性抗－Id scFv的编码序列进行测定分析。结果经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，在随机挑选的60个克隆中，有20株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应后，确定了其中有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆，提取质粒，进行DNA序列测定，DNA大小为768bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗－HCV核心蛋白的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治慢性丙型肝炎的研究创造了条件。     

基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立

目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。     

抗平颏海蛇短链神经毒素全人源单克隆抗体的筛选、制备及生物活性研究

目的 重组表达3种平颏海蛇短链神经毒素,利用噬菌体抗体库筛选制备全人源抗毒素单克隆抗体并评估其生物活性.方法 以重组表达纯化的神经毒素蛋白作为抗原,从自主构建的噬菌体抗体库中筛选获得噬菌体抗体,经序列测定确定其抗体类型后构建完整抗体.利用真核表达系统表达纯化抗体后鉴定其抗原结合活性、生化特性及药代动力学特性.在体内验证抗体药物的抗毒素作用.结果 经过4轮筛选,获得2株能同时结合3种神经毒素的噬菌体单链抗体,并将其制备成完整的抗体,进一步证实所获得的抗体可特异性结合3种抗原.2株全人源抗体均可拮抗神经毒素对昆明小鼠的致死作用.结论 利用重组神经毒素和噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗平颏海蛇短链神经毒素的全人源治疗性抗体.     

单克隆抗体人源化技术研究进展

随着分子生物学技术的发展,应用DNA重组技术、抗体库技术及转基因技术对鼠源性单抗进行人源化改造,先后出现了嵌合抗体、互补决定区移植抗体和全人源抗体,它们从不同角度克服了鼠源性单抗临床应用的不足,为单克隆抗体在临床诊断及治疗中的应用带来了新的曙光,该文对单克隆抗体人源化技术的研究进展作一综述。