外源核苷酸促进小鼠胸腺细胞受损DNA修复的体外研究

核苷酸作为遗传物质的组成成分,在维持和提高机体细胞免疫和体液免疫功能方面发挥重要作用,研究表明核苷酸对免疫细胞DNA有保护作用,能够减轻毒物、脂肪等对DNA的损伤.在前期实验中我们也观察到核苷酸能够减轻烷化剂对小鼠胸腺细胞DNA的损伤程度,但核苷酸对DNA损伤后的修复有无作用目前尚不清楚,还有待于研究.本试验拟在体外采用烷化剂-N-甲基-N-硝基-N亚硝基胍（N-methyl-N＇nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG）诱导小鼠胸腺细胞DNA损伤,研究不同浓度的核苷酸对损伤后的细胞DNA的修复有无影响,从DNA损伤修复角度探讨核苷酸体调节免疫功能的可能机制.     

Q3衰老小鼠模型的DNA损伤研究

目的 探讨自由基致衰老的小鼠模型DNA氧化损伤的情况。方法 通过给2月龄小鼠吸入一定量的O3,建立O3衰老小鼠模型;然后以单细胞凝胶电泳检测O3衰老小鼠模型、自然衰老小鼠和正常青年小鼠（阴性对照 组）的脾淋巴细胞DNA氧化损伤情况。结果 与阴性对照组相比,O3衰老小鼠模型的脾淋巴细胞DNA受到较显著的氧化损伤（P＜0．05）;其损伤程度与自然衰老小鼠相近（P＞0．05）。结论 O3衰老动物模型与自然衰老近似,在衰老的研究和抗衰老药物的药理实验中具有一定应用价值。     

应用单细胞凝胶电泳技术检测K562细胞 DNA损伤的研究

目的用单细胞凝胶电泳技术来探讨一种能方便检测细胞DNA损伤的方法。方法在Singh等人的方法的基础上，加入过氧化氢作为DNA致突变剂来观察K562细胞的DNA损伤。结果在培养K562细胞的过程中，加入了下同浓度的过氧化氢，我们发现了DNA损伤与过氧化氢剂量之间存在着线性相关关系。结论这种在本实验室建立起来的用于检测细胞DNA损伤的方法易于操作，结果令人满意，并更具实用性。     

MTX致小鼠组织DNA损伤的研究

目的为进一步了解甲氨蝶呤(methotlexate,MTX)的作用机制,探测一次给药后不同时间点小鼠组织DNA损伤的修复情况。方法用单细胞凝胶电泳技术检测MTX腹腔注射染毒1、3、6、12、24h后对小鼠肝、脾、骨髓、胸腺、肾、睾丸、胃和外周血淋巴细胞的DNA损伤作用。结果腹腔注射5mg／kg MTX可诱发小鼠脾细胞、骨髓细胞、胸腺细胞和外周血淋巴细胞的DNA单链断裂。结论MTX可致小鼠体内多脏器细胞的DNA单链断裂,不同细胞对MTX的易感性不同。     

锰对小鼠淋巴细胞DNA损伤的研究

目的:研究不同剂量染锰小鼠淋巴细胞 DNA损伤的情况。 方法:随机分为正常对照组和 3个剂量组(低、中、高剂量组 ) ,给小鼠腹腔注射氯化锰 ,6周后采用单细胞凝胶电泳实验检测染锰小鼠外周血淋巴细胞 DNA链断裂情况 ,并进行对比分析。 结果:低、中、高剂量组小鼠淋巴细胞 DNA损伤率明显高于正常对照组 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1)。结论:氯化锰可引起小鼠淋巴细胞 DNA的损伤     

单细胞凝胶电泳技术检测小鼠骨髓细胞DNA损伤

目的:探索并优化单细胞凝胶电泳技术并评价其在环境有害物致骨髓细胞DNA损伤检测中的应用价值.方法:离体小鼠骨髓细胞分别用0.1 mmol/L、1.0mmol/L、10.0mmol/L氯化镉37℃处理1 h后,制成凝胶,用pH10.0的冷裂解液裂解1 h,稳压25V、电流80 mA电泳1 h,中性化后用荧光染料染色,在波长为450～490nm的荧光显微镜下观察并统计100个细胞,计算彗星细胞的百分率.结果:氯化镉处理的离体小鼠骨髓细胞的彗星细胞率明显高于对照组(P＜0.001).结论:本方法在原有单细胞电泳技术的基础上加以优化,可以灵敏地检测出骨髓细胞的DNA损伤,可广泛用于环境等对骨髓细胞DNA损伤的研究.     

苯胺致小鼠肝细胞和淋巴细胞DNA损伤及其修复效应

【摘要】 目的 为研究苯胺的遗传毒性及其修复动力学效应。 方法 应用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术,检测了100 mg/kg苯胺单次灌胃3 h、8 h、16 h、24 h、32 h后,对KM小鼠肝细胞和淋巴细胞DNA损伤及时效关系。 结果 SCGE实验结果显示肝细胞从8 h开始尾长和尾矩逐渐增大,至16 hDNA损伤程度达到最大,相比对照组差异显著（P<0.01）,随着时间的延长,DNA损伤程度逐渐减轻,在32 h DNA损伤已恢复正常,与对照组没有显著性差异（P>0.05）;而淋巴细胞则在16 h开始尾长和尾矩逐渐增大,24 h时达到最大,32 h时DNA损伤逐渐恢复。 结论 苯胺对肝细胞和淋巴细胞具有潜在的遗传毒性;2个DNA损伤指标的变化存在明显的时间效应关系,说明这两种细胞具有有效DNA修复机制。     

MNNG诱导GES-1细胞恶性转化细胞模型的建立

目的建立胃癌癌前病变细胞模型。方法使用与胃癌相关的亚硝胺类化合物N-甲基-N′-硝基N-亚硝基胍(MNNG)对永生化的人胃黏膜上皮细胞系GES-1进行恶性转化实验,得到转化后的MC细胞。比较观察GES-1细胞和MC细胞的形态,同时检测两种细胞中神经钙黏附素(N-cadherin)与磷酸化信号传导和转录激活因子3(P-STAT3)的表达。结果与GES-1细胞比较,MC细胞形态以及生长特性均发生了改变。随传代的延续,细胞呈现典型的"岛样"克隆生长。胃癌组织相关蛋白N-cadherin、P-STAT3的表达量增加。结论本研究成功构建了胃癌癌前病变细胞模型。     

番茄红素对CHL细胞DNA氧化损伤的影响

目的研究番茄红素对CHL细胞氧化损伤的影响。方法在CHL细胞培养液中分别加入0.5、1、5及10μmol/L番茄红素,给予H2O2作用30min,用单细胞凝胶电泳方法测定细胞DNA损伤情况。结果加入不同剂量番茄红素的CHL细胞经过24h培养后自发性DNA损伤(拖尾率和DNA迁移长度)与溶剂对照组相比没有明显差异。而加入0.5、1、5μmol/L番茄红素后H2O2诱导的CHL细胞DNA损伤率明显低于H2O2组(P<0.05);但10μmol/L番茄红素对H2O2诱导的DNA损伤的保护作用丧失。结论0.5、1、5μmol/L番茄红素对H2O2诱导的细胞DNA损伤有保护作用,10μmol/L番茄红素的抗氧化能力丧失。     

O3衰老小鼠模型的DNA损伤研究

目的探讨自由基致衰老的小鼠模型DNA氧化损伤的情况。方法通过给2月龄小鼠吸入一定量的O3,建立O3衰老小鼠模型;然后以单细胞凝胶电泳试验检测O3衰老小鼠模型、自然衰老小鼠和正常青年小鼠(阴性对照组)的脾淋巴细胞DNA氧化损伤情况。结果与阴性对照组相比,O3衰老小鼠模型的脾淋巴细胞DNA受到较显著的氧化损伤(P<0.05);其损伤程度与自然衰老小鼠相近(P>0.05)。结论O3衰老动物模型与自然衰老近似,在衰老的研究和抗衰老药物的药理实验中具有一定应用价值。     

苯引起鼠胸腺细胞DNA的损伤及其机制的研究

目的研究苯对小鼠胸腺细胞DNA的损伤及其机制. 方法运用单细胞凝胶电泳技术,将苯分为3个浓度组染毒胸腺细胞,测定胸腺细胞DNA的彗星尾长.结果在有代谢活化系统存在下,苯对小鼠胸腺细胞DNA产生损伤,且呈浓度依赖.但加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸后,可抑制苯对胸腺细胞DNA的损伤.结论苯能引起胸腺细胞DNA损伤,可能与其代谢物有关.     

过氧化氢诱导肠上皮干细胞DNA氧化损伤模型的建立

目的：探索建立过氧化氢诱导肠上皮细胞DNA氧化损伤模型，以便在体外进一步研究DNA氧化损伤在大肠癌发生发展中的作用。方法：过氧化氢以RPM11640培养基稀释成100、50、10、5、μmol／L5个浓度，以RPMI1640培养荆作空白对照。作用人胎肠上皮干细胞不同时间（10min、30min、1h、1．5h、12h、24h）后，以MTT法检测细胞生存状况，以免疫组织化学方法检测DNA特异性氧化损伤产物8-羟-2-脱氧鸟苷（8-OhdG），用SPSS10．0软件以线性回归方法检验肠上皮干细胞在不同时间的生存率变化趋势。结果：MTT活性检测结果表明，在10～30min时，各浓度过氧化氢作用后的细胞活性较高，为60％～80％，但随时间推移，细胞活性下降，至24h，降至30％左右，时间趋势检验表明，除100、50μmol／L过氧化氢组和空白对照组外，其余各组的生存率随过氧化氢作用时间的延长，生存率下降，时间趋势差异具统计学意义。过氧化氢作用时间在10～30min内，100、50μmol／L组的细胞活性明显低于1～10μmol／L组20％左右，但在1．0h以上各组，虽然过氧化氢浓度不同，但在同一作用时间内细胞活性无明显差别。过氧化氢处理肠上皮细胞15min后进行8-OhdG免疫组织化学检测，结果除对照组阴性外，其余各组肠上皮细胞在不同浓度过氧化氢作用后的胞核及胞浆染色均呈棕褐色，为阳性。结论：过氧化氢能诱导肠上皮细胞发生DNA氧化损伤，肠上皮细胞DNA氧化损伤模型的条件以1～10μmol／L过氧化氢作用10～30min为宜。     

外源核苷酸对受损小鼠胸腺细胞DNA修复的影响

目的:探讨外源核苷酸对受损小鼠胸腺细胞DNA修复的影响.方法:采用10 μmol/L的N-甲基-N-硝基-N亚硝基胍(MNNG)诱导小鼠胸腺细胞DNA损伤后,在终浓度分别为0,0.1,1和10 mmol/L核苷酸的RPMI-1640基础培养基或完全培养基中培养,在培养的第2,5 h采用单细胞凝胶电泳技术分析细胞DNA损伤和修复情况.结果:培养2 h时,基础培养基中各组间的拖尾细胞百分率差异无统计学意义(P＞0.05);完全培养基中核苷酸能降低拖尾率(P＜0.01).5 h时,随着核苷酸添加浓度的升高,拖尾率均降低(P＜0.01).在相同的培养基中,各组的彗星尾长在2 h差异无统计学意义(P＞0.05),5 h后,在基础培养基中添加1,10 mmol/L的核苷酸使得彗星尾长降低(P＜0.05);在完全培养基中添加1,10 mmol/L的核苷酸也使得彗星尾长降低(P＜0.01).在培养的2～5 h内,补充核苷酸均能提高基础培养基(P＜0.05)和完全培养基(P＜0.01)中DNA修复细胞的百分率.结论:外源核苷酸能明显促进受损小鼠胸腺细胞DNA的修复,且核苷酸的作用与其添加水平有关.     

吉西他滨对放射相关DNA损伤修复的影响

目的研究吉西他滨（GEM）在体外对胰腺癌细胞的放疗增敏作用及机制。方法体外培养胰腺癌Pancl细胞株,将其分为空白对照组、单纯照射组、吉西他滨组及吉西他滨联合放疗组（联合放疗组）。采用源皮距（SSD）为100cm,剂量2、4和6Gy的4MV—X线进行细胞照射;运用MTT实验方法选出细胞生长抑制率≤10％的药物浓度（IC10）,即GEM的最佳实验浓度;克隆形成实验观察空白对照组、GEM组、单纯放疗组及联合放疗组胰腺癌细胞Pancl体外增殖情况。流式细胞仪分析上述各组细胞的细胞周期和凋亡改变。免疫印迹法分别检测空白对照组、GEM组、单纯放疗组及联合放疗组DNA损伤以及损伤修复指标ν-H2AX、Rad51、Ku80及p-ATM蛋白的表达。结果GEM在体外具有放射增敏作用。MTT结果显示,GEM在0．04～0．06μmol／L之间为最佳实验浓度。射线照射后,GEM能显著降低胰腺癌细胞的克隆形成能力,即增殖能力。凋亡结果显示,与GEM组及单独放疗组比较,联合放疗组Pancl细胞的凋亡数明显增加,其凋亡率差异有统计学意义（P＜0．05）;细胞周期检测结果表明,GEM作用于胰腺癌细胞后,S期细胞水平明显升高。胰腺癌细胞DNA损伤指标ν-H2AX蛋白表达水平在GEM组,单纯放疗组及联合放疗组均增加,联合放疗组较GEM组有进一步升高。与空白对照组、单纯照射组、GEM组比较,联合放疗纽胰腺癌细胞中DNA损伤修复指标Rad51、Ku80及p-ATM蛋白的表达均降低。结论GEM对胰腺癌放射治疗有增敏作用。其机制涉及诱导细胞凋亡,改变Pancl细胞生长周期,并通过抑制射线照射后胰腺癌细胞DNA损伤修复,间接对胰腺癌的放疗起增敏作用。     

氯乙烯致DNA损伤与DNA修复基因甲基化

目的探讨氯乙烯职业接触的早期效应DNA损伤与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因MG-MT、错配修复基因hMLH1启动子甲基化的关系。方法氯乙烯接触工人按淋巴细胞双核微核数分为DNA损伤组(72例)和非损伤组(43例),采用甲基化特异的PCR法检测修复基因的甲基化。结果hMLH1基因在DNA损伤组和非损伤组均未检测到甲基化,MGMT基因在DNA非损伤组未检测到甲基化,在DNA损伤组MGMT发生甲基化频率为6.9%(5/72)。结论在氯乙烯致DNA损伤阶段,可检出MGMT基因甲基化异常。     

DNA损伤修复基因MPG在人体骨肉瘤的表达及其治疗意义

目的本研究首先观察N-烷基嘧啶DNA糖基化酶(MPG)在人体骨肉瘤中的表达特点及其与患者预后的关系,进而构建复制缺陷型腺病毒MPG表达载体,探讨人骨肉瘤细胞HOS过表达MPG及其对DNA损伤药物MMS,MNNG和TMZ敏感性的影响.方法应用免疫组化方法检测60例骨肉瘤组织和3株骨肉瘤细胞中MPG的表达.按染色强度将其分为低表达组和高表达组,统计分析它们与临床病理及患者预后的关系.应用流式细胞术、蛋白印迹和HEX标记寡核苷酸方法确定MPG腺病毒表达载体Ad5 HA-MPG在人体骨肉瘤细胞HOS中的感染效率,MPG蛋白表达和MPG酶活性;MTS、SRB和[3H]胸腺嘧啶掺入法检测细胞存活;PE-Annexinv/7-AAD流式细胞术检测细胞凋亡.结果3株骨肉瘤细胞MPG均呈弱阳性表达.60例骨肉瘤中MPG 40例(65%)为高表达,MPG表达和WHO分型和患者预后显著相关.10 MOI Ad5 HA-MPG可使90%以上HOS感染,感染细胞高表达MPG并具有MPG酶活性.MPG过表达HOS显著地提高DNA损伤性化疗药物MMS、MNNG和TMZ的敏感性,其IC50值分别下降了6.0、4.5和2.5倍.结论Ad5 HA-MPG瞬时MPG过表达,可能是一种提高骨肉瘤细胞对DNA损伤性化疗药物敏感性的潜在治疗方法.     

DNA损伤和修复在肝癌中的研究进展

人体细胞中DNA损伤后会引起细胞一系列反应,主要包括损伤信号的传导、损伤与修复、诱导细胞死亡等.肝癌的发生正是由于这些诱因同时作用于损伤修复系统的某个环节,使DNA损伤不能修复或不能正确修复,从而使肝细胞发生恶性转化,最后导致肝癌的发生.因此,损伤DNA的累积则成为肝癌发生的重要分子机制,对其深入研究将会为肝癌的治疗奠定基础.该文通过查阅相关文献,综述近年来DNA损伤和修复在肝癌中的研究进展.     

高尿酸血症肾损害大鼠模型的建立

目的考察3种不同的造模方法,以建立高尿酸血症肾损害大鼠模型,确定建立高尿酸血症肾损害大鼠模型的有效实验方法。方法选用清洁级雄性SD大鼠24只,体质量（200±20）g,随机分为正常组、模型Ⅰ组、模型Ⅱ组、模型Ⅲ组,每组6只。正常组实验过程中正常饲养,模型Ⅰ组根据大鼠体质量以腺嘌呤(0.1 g/kg·d^-1)与氧嗪酸钾(1.5g/kg·d^-1)混悬液灌胃给药;模型Ⅱ组根据大鼠体质量以腺嘌呤(0.15 g/kg·d^-1)与氧嗪酸钾(0.6g/kg·d^-1)的混悬液,每日腹腔注射两次;模型Ⅲ组大鼠以腺嘌呤（20mg/d）和乙胺丁醇（50mg/d）的混悬液灌胃给药。连续给药28 d,检测第7天、第14天、第21天、第28天各组大鼠的血清尿酸（serum uric acid,SUA）、肌酐（creatinine,CRE）、尿素氮（urea nitrogen,BUN）,28 d后留取大鼠肾脏标本行H-E及MASSON染色,观察肾脏病理变化情况。结果模型Ⅰ组大鼠第7天、第14天、第21天及第28天的血尿酸较正常组升高（P<0.05）,血肌酐、尿素氮在第14天、第21天及第28天较正常组均升高（P<0.05）;模型Ⅱ组大鼠仅第14天及第28天的血尿酸值较正常组有所升高（P<0.05）,其血肌酐、尿素氮在第7天、第14天、第21天及第28天较正常组升高（P<0.05）;模型Ⅲ组大鼠仅第7 d的血尿酸值较正常组升高（P<0.05）,其余时间点无明显差异,其血肌酐在第7天、第14天、第21天及第28天较正常组升高（P<0.01）,血尿素氮在第14天、第21天及第28天较正常组升高（P<0.01）;肾组织病理结果提示各模型组可见明显肾小管和间质损伤,其中模型Ⅲ组肾脏组织结构存在广泛性损害。结论腺嘌呤和氧嗪酸钾联合灌胃的造模方法可以成功地制备出尿酸稳定升高、类似于人类尿酸性肾病的高尿酸血症肾损害大鼠模型。     

DNA氧化损伤修复基因hOGG1高表达细胞株的建立

目的联合pcDNA3.1(+)/Myc-HisA-hOGG1和pGL3promoter荧光质粒稳定转染人肺腺癌A549细胞获得hOGG1基因高表达细胞株,并初步探讨转染细胞生物学特性的变化。方法成功构建pcDNA3.1(+)/Myc-His A载体后,大量抽提阳性重组子并在Fu GENE6的介导下联合pGL3promoter荧光质粒转染A549细胞(转染组),同时设空白对照组(A549)和阴性对照组[PGL3+pcDNA3.1(+)/Myc-HisA转染的A549细胞]。生物荧光检测转染细胞hOGG1mRNA表达的改变,蛋白质免疫印迹法检测转染细胞hOGG1蛋白表达水平。将3组细胞于不同高氧条件下培养,相差显微镜观察形态学变化,彗星试验比较各组细胞对抗损伤和修复能力的情况,同时测定DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的变化。结果转染细胞荧光素酶稳定表达,蛋白印迹检测转染组hOGG1蛋白明显高于两对照组细胞,提示hOGG1基因高表达细胞株建立成功。相同高氧条件下,转染组形态学变化明显减轻,彗星细胞率和olive tail moment明显低于空白组和阴性对照组,修复完成率高,修复时间缩短(P<0...