重组P53基因复合物对DU145细胞致瘤性的抑制作用

目的 观察野生型Ｐ５３基因对前列腺癌细胞系ＤＵ１４５致癌性的抑制作用。方法 将野生型Ｐ５３真核表达载体用ｌｉｐｏｆｅｃ－ｔａｍｉｎｅ导入ＤＵ１４５细胞中,ＰＣＲ法和抗Ｐ５３基因单抗免疫组化方法检测Ｐ５３基因的表达情况。ＭＴＴ法检测细胞的生长程度,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。软琼脂生长试验检测细胞集落形成能力的变化。结果 Ｐ５３基因可转染入ＤＵ１４５细胞中,且对其致瘤性有一定的抑制作用。结论 本实     

SIRT1抑制剂sirtinol对前列腺癌DU145细胞凋亡的影响及可能机制

目的观察SIRT1抑制剂sirtinol对前列腺癌DU145细胞系细胞凋亡和细胞凋亡关键调控因子(Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3)表达变化的影响,探讨SIRT1在前列腺癌发生的可能机制。方法体外培养DU145细胞,实验分对照组(DMSO组)和sirtinol组(终浓度为10,25和50μmol/L),Western印迹检测DU145细胞SIRT1蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;Western印迹检测DU145细胞中细胞凋亡关键调控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表达。结果与对照组相比,随着sirtinol浓度的增加,SIRT1蛋白表达水平逐渐降低,细胞凋亡比例增加,诱导细胞发生凋亡。不同浓度sirtinol作用DU145细胞后Bcl-2蛋白表达减少,且随剂量增加表达越低;Bax蛋白表达增加,Bcl-2/Bax比率降低;伴随Cytochrome C的释放和Caspase-3的激活。结论下调SIRT1表达诱导前列腺癌细胞DU145细胞凋亡,其机制可能与改变细胞凋亡关键调控因子Bcl-2、Bax、Cytochrome C和Caspase-3的蛋白表达相关。     

基质细胞在DU145前列腺癌细胞种植小鼠肿瘤模型中的作用

目的探讨前列腺基质细胞对肿瘤发生的作用。方法将BALB／c裸鼠分为两组,每组10只,对照组（D组）裸鼠皮下单纯注射前列腺癌细胞株DU145细胞,实验组（D＋P组）混合注射DU145细胞和前列腺外周带分离的基质细胞（PrSC）,注射后第9周收集肿瘤组织,记录肿瘤重量。采用TUNEL法检测凋亡细胞的数量,采用免疫组织化学法标记α-SMA、Ki67和P53阳性细胞,分别检测肿瘤组织中基质细胞和血管数目,增殖细胞的数目和P53蛋白的表达。结果D＋P组瘤重、血管数量和增殖细胞多于D组,但凋亡细胞和P53的表达两组之间差异并无统计学意义。结论基质细胞在肿瘤产生中发挥了重要作用,PrSC的作用可能是促进肿瘤细胞增殖和血管生成,对细胞的凋亡影响较小。     

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3，1( )-GRA8真核表达重组质粒，为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段，纯化后重组入pUC-19克隆载体，再经含IPTG，XGal氨苄培养基蓝白筛选，挑选白色克隆酶切，低溶点琼脂糖纯化，回收目的基因亚克隆入pcDNA3．1( )，经氨苄培养基过夜培养挑选6个克隆提纯酶切，PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA8基因片段，克隆成功pcDNA3．1( )-GRA8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。结论 本结果为研究抗弓形虫核酸疫苗打下基础。     

TRAIL真核表达质粒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达

目的 构建TRAIL真核表达质粒并初步研究其在膀胱癌细胞中的表达.方法 提取Jurkat淋巴瘤细胞总RNA,进行RT-PCR反应,产物测序证实后插入经同样酶切的质粒PcDNA3.1中,构建成真核表达质粒PcD-NA3.1-TRAIL.Western blot法鉴定其能否在膀胱癌细胞中表达.结果 Jurkat淋巴瘤细胞的RT-PCR产物经测序证实为TRAIL基因的全长序列;经酶切、测序证实成功构建PcDNA3.1-TRIAL质粒;Western blot结果显示,转染上述质粒的膀胱癌细胞中有TRAIL的表达.结论 成功构建了表达全长TRAIL的真核表达载体,并通过Westernblot验证其可在膀胱癌细胞中表达.     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

人肝细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的：构建肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体，为基因修饰肝细胞移植的细胞来源及建立HGF的工程细胞株提供实验依据。方法：利用DNA体外重组技术，将HGFcDNA重组人真核表达载体PEGFP-C，限制性内切酶及测序鉴定聚合酶链式反应(PCR)鉴定外源基因的导入。结果：重组真核表达载体PEGFP-C1-HGF经限制性内切酶分析，与理论值相符，测序结果与Gene Bank对比，序列正确，插入正确。结论：成功构建带有绿荧光蛋白的HGF基因真核表达载体PEGFP-C1-HGF。     

带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签（HA标签）的乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）的表达质粒,为进一步研究HBe蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563bp;PCR产物经过Eco砒和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3／HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48h后,RIPA裂解细胞,Western blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5．9kb,酶切鉴定结果符合目的条带（563bp）大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3／HA—HBc蛋白,为进一步研究HBe蛋白的功能奠定了良好的实验基础。     

pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达

目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.     

恶性疟原虫海南株STARP基因真核表达重组质粒的构建及基因结构分析

目的 构建恶性疟原虫海南（RCC1／HN株）STARP基因真核表达重组质粒pcDNA3-STARP;分析STARP基因结构,并了解FCC1／HN株与其它分离株STARP基因序列的差异。方法 根据STARP基因已知序列设计合成两对引物,用PCR技术从RCC1／HN株基因组DNA中扩增两个部分序列重叠的STARP基因片段;将两基因片段分别双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。酶切,PCR扩增鉴定筛选重组质粒阳性克隆;用双脱氧链末端终止法测序,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 分别PCR扩增获得1078bp,1092bp的两个STARP基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组质粒;恶性疟原虫FCC1／HN株与T9／96株STARP基因核苷酸序列同源性92．2％;推测编码氨基酸序列同源性为90．9％;在STARP蛋白中部重复区推测有多个明显的抗原表位区段。结论 从FCC1／HN株恶性疟原虫基因组DNA中获取STARP基因,并成功构建真核表达重组质粒pcDNA3－STARP;FCC1／HN株与其它分离株STARP基因有高度的同源性。     

人遗传印记基因PEG10重组真核表达质粒的构建及其在转染细胞株中的表达

目的构建人遗传印记基因PEG10的全长表达基因质粒,观察PEG10的过表达对人正常肝细胞及其非肝脏来源的对照细胞的作用。方法将PEG10基因全长cDNA直接连入真核细胞表达质粒pcDNA3．1hisC中,以脂质体介导的方法将该表达质粒pcDNA3．1hisC-PEG10转染入人正常肝细胞及其对照细胞,采用RT-PCR、Western blot、MTT、TUNEL等方法分析PEG10基因在正常人肝细胞及其对照细胞中的表达和功能。结果限制性酶切及DNA测序结果均说明所构建质粒为PEG 10全长表达质粒。该质粒经过稳定筛选后稳定表达于细胞内,促进人肝细胞的生长,抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞没有明显影响。结论PEG10全长表达质粒的构建为进一步研究PEG10基因的效应和机制提供了有利的工具,研究结果显示PEG10基因可以促进人正常胚肝细胞增殖并抑制其凋亡,但对非肝脏来源的对照组细胞人胚肾细胞株293细胞没有明显效应。     

辅助性T细胞表位HBV表面抗原融合基因真核表达质粒的构建

为提高HBVDNA疫苗的免疫效率，将一个通用型辅助性T细胞表位基因引入HBV表面抗原基因的5‘末端，构建成真核表达质粒。PCR方法合成PADRE-HBsAg目的基因，产物与pMDl8T载体连接，经Hind Ⅲ，EcoR Ⅰ双酶切，再克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )。酶切及测序鉴定，该真核表达载体构建成功，为进一步观察其特异性细胞和体液免疫反应奠定了基础。     

霍乱弧菌ctxB基因真核重组质粒的构建及表达

目的构建霍乱孤菌ctxB基因真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxB上切下ctxB基因,导入真核表达载体pcDNA3·1( ),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3·1-ctxB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3·1-ctxB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法对pcDNA3·1-ctxB的瞬时表达产物进行鉴定。结果约380bp的ctxB被克隆到pcDNA3·1( )真核表达载体中,经测序无误后,用阳离子脂质体转染的方法,检测到重组质粒pcDNA3·1-ctxB在NIH3T3细胞的胞浆和胞膜上得到了表达。结论ctxB真核表达的成功构建及表达为进一步从分子水平研究霍乱肠毒素B亚单位的免疫原性及其作为佐剂的应用价值提供研究基础。     

吲哚美辛对前列腺癌DU145细胞增殖与凋亡的影响及机制探讨

目的观察吲哚美辛对人激素非依赖性前腺癌细胞系DU145增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法采用不同浓度的吲哚美辛处理DU145细胞。应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测并计算细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞周期分布,并计算细胞凋亡率;采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定细胞培养上清PGE2;应用RT-PCR法检测Bcl-2和Bax mRNA。结果吲哚美辛可明显抑制DU145细胞增殖（P〈0．05）,并具有时间一剂量依赖性;经吲哚美辛作用后,S期细胞明显增多,G2/M期细胞减少,细胞出现凋亡峰;细胞上清中PGB量明显减少（P〈0．001）;Bcl-2 mRNA表达降低,BaxmRNA表达下降,Bcl-2／Bax下降（P〈0．05）。结论吲哚美辛对前列腺癌细胞DU145生长具有抑制作用,阻滞细胞向c2／M期转化,并促进其凋亡。其作用可能与抑制细胞PGE2释放、下调Bel-2／Bax有关。     

弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建

目的构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。方法根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定。结果PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%。构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722bp的SAG1基因片段和511bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中。结论成功克隆了pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础。     

pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系HepG2中的表达

目的构建pEGFP-prohibitin真核表达质粒,并鉴定其在pEGFP-prohibitin转染的人肝癌细胞系HepG2中的表达。方法采用高保真PCR扩增获得prohibitin的全长编码序列,构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并通过基因测序和BLAST比对鉴定重组质粒;提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒,并通过TurboFect转染试剂转染HepG2细胞;采用实时PCR和Western印迹方法分别在mRNA水平和蛋白质水平检测prohibitin蛋白在转染后HepG2细胞中的表达。结果成功构建pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒,并将其成功转染HepG2细胞;pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin的表达量比空载转染组和未转染组细胞明显增加。结论成功构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并证明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin转染人肝癌细胞系HepG2中高表达。     

野生型和A294G突变型血管紧张素转换酶2基因真核表达质粒构建与鉴定

目的构建人野生型和突变型（A294G）血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme2,ACE2）基因真核表达载体。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法扩增人ACE2基因,与pcDNA3．1真核表达载体连接,构建pcDNA3．1-hACE2重组质粒,通过酶切和测序进行鉴定;以此野生型ACE2真核表达载体为模板,在pyrobestDNA高保真聚合酶的作用下利用体外定点突变法构建ACE2基因突变型重组质粒,用DpnI限制性内切酶处理聚合酶链反应产物,直接转化DH5a感受态细胞,挑取克隆并提取相应质粒,测序加以验证。结果测序结果证实,野生型和突变型ACE2基因分别插入到pcDNA3．1＋中,野生型ACE2基因序列与NCBI网站人ACE2基因全长编码序列（NCBI参考序列：NM_021804．2）相应片段一致,突变型（A294G）ACE2基因除第294位碱基A被G替代以外,其余序列与野生型一致。结论成功构建了人野生型和突变型ACE2的真核表达质粒,为下一步研究突变型ACE2的生物学功能以及ACE2在疾病发病机制中的作用奠定了基础．     

靶向Midkine基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向midkine基因的siRNA 的表达载体,为研究midkine在肿瘤中作用提供一个新的方向.方法 根据基因库中midkine cDNA 序列设计和合成针对人midkine 基因的siRNA 寡核苷酸,定向克隆入质粒载体PGCsiU6,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA 测序.结果 酶切鉴定、DNA 测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变.结论 成功构建了靶向midkine 基因表达的siRNA 干扰质粒载体PGCsiU6/midkine,为进一步运用RNA干扰技术进行midkine 基因功能研究奠定了基础.     

大鼠肝细胞生长因子与肝再生增强因子融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建大鼠肝细胞生长因子(rHGF)与大鼠肝再生增强因子(rALR)融合基因的真核表达质粒并进行鉴定,为新的肝纤维化治疗方法奠定实验基础.方法 分别以重组质粒pUC18-rHGF和pUC18-rALR为模板,进行PCR扩增,获得rHGF和rALR的基因片段;利用重叠延伸PCR方法将获得的基因片段通过一个连接序列(linker)进行连接,构建融合基因rHGF-linker-rALR,将融合基因定向插入pcDNA3.1真核表达质粒的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点之间,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR,并进行双酶切及测序鉴定.结果 rHGF和rALR的PCR扩增产物电泳后分别观察到2200 bp和400 bp的条带,与理论值相符.重叠延伸PCR获得的融合基因产物电泳后观察到2600 bp的条带,与预期值一致.重组真核表达质粒pcDNA3.1-rHGF-linker-rALR经双酶切,电泳后观察到2600 bp和5400 bp的两条DNA条带,与预期值相符,测序鉴定结果表明序列正确.结论 成功构建了rHGF与rALR融合基因的真核表达质粒,为肝纤维化的基因治疗奠定了实验基础.