人血管内皮生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

Objective To establish an effective method of transfecting human marrow mesenchymal stem cells (MSC) with human vascular endothelial growth factor 165 ( VEGF 165) gene. Methods MSCs isolated and cultured in vitro were divided into transfection group (pShuttle-CMV/VEGF 165 plasmid was transfected into MSCs through liposome-mediating method), empty plasmid group (pShuttle-CMV vehi-cle was transfected into MSCs as control), liposome group (liposome was transfected into MSCs as control) and control group(normal culture). Expressions of Mrna and protein of MSCs were determined by RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay and Western Blot. Sensitivity to MSCs on VEGF plasmid transfec-tion was detected by MTT test. Results Expression level of VEGF 165 gene Mrna in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively 0.89 ± 0.03, 0. 34 ± 0.04, 0.40 ± 0.03, and 0.30 ± 0.03, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0. 01 ). Content of VEGF protein in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively (778 ± 35 ), (543 ± 24), (561 ± 28), (571 ± 23) pg/Ml, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0.01 ). In the transfection group, expression level of VEGF protein peaked on 7th day after transfec-tion, which was decreased gradually later. In transfection group, expression level of V EGF 165 protein was obviously higher than that of the other three groups ( P <0. 01 ), and no inhibitory effect of VEGF plasmid transfection on MSCs proliferation was found. Conclusions The method for transfecting human VEGF 165 gene into MSCs is established in this research, through which target gene and protein can express effectively.     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

转染血管内皮生长因子基因神经干细胞移植对大鼠脑缺血损伤的修复作用

目的 探讨转染血管内皮生长因子（VEGF）基因神经干细胞移植对大鼠脑缺血损伤的修复作用。方法 建立大鼠大脑中动脉梗塞（tMCAO）模型，将tMCAO模型随机分为对照组、注射磷酸盐缓冲液（PBS液）的PBS液对照组、接受神经干细胞（NSCs）移植的NSCs组、接受转染VEGF基因的NSCs移植的NSCs-VEGF组，采用立体定向法将相应移植物注射到tMCAO模型的右侧纹状体缺血半暗区。各组移植后2、4、6、8、10、12周进行神经功能损害程度（NSS）评分；移植后7d，采用免疫荧光染色法观察NSCs-VEGF组移植细胞的VEGF基因表达情况；12周时，采用免疫荧光染色法追踪NSCs-VEGF组移植细胞向神经元方向分化情况，并同时行各组移植区周围血管内皮细胞半定量计数。结果 移植后2～12周，NSCs-VEG组的NSS评分均低于其它3组，第12周时的NSS评分与其它3组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；移植后7d，NSCs-VEGF组的移植细胞从移植点向周围迁徙，部分表达VEGF基因；移植后12周，NSCs-VEGF组部分移植细胞分化成神经元，其移植区血管内皮细胞数显著高于其它3组（P〈0．05）。结论 转染VEGF基因的神经干细胞移植对脑缺血所致的损伤具有一定的修复作用。     

脂质体介导血管内皮生长因子基因片段在犬骨髓基质干细胞中的表达及其影响

目的 探讨脂质体介导的重组血管内皮生长因子165(vascularendothelial growthfactor 165,VEGF165)基因转染后的犬骨髓基质干细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)的能力及细胞增殖能力的改变,为改善骨缺血坏死的干细胞治疗方法提供基础.方法 实验分VEGF165基因转染组与空白对照组,从成年犬的胫骨抽取骨髓,体外分离纯化,贴壁培养骨髓基质干细胞,传代培养后以脂质体法将携带荧光蛋白VEGF165基因的穿梭质粒转入实验组骨髓基质干细胞中,在荧光显微镜视下观察转染效率,并通过ELISA法分别检测转染后1、3、5、7、9、11、13 d实验组与对照组培养液中VEGF的含量,对结果进行统计分析.MTT法检测转染细胞的增殖能力,绘制增殖曲线.结果 重组人血管内皮生长因子165(recombinate the human being vasular endotheial growth factor165,hVEGF165)基因通过脂质体能够成功转染犬骨髓基质干细胞并分泌VEGF.h-VEGF165基因转染组培养液中VEGF蛋白含有量较未转染组增高,ELISA结果显示转染后上清液中第2天即可出现VEGF浓度的增高,到第7天时达到分泌高峰,筛选后的细胞上清液中VEGF浓度稳定在300ng/L左右,与对照组相比升高约10倍,其差别具有显著的统计学意义.骨髓基质干细胞转染基因后,细胞的增殖能力同对照组相比无明显差别.结论 采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到犬骨髓间充质干细胞中并可有效表达VEGF. hVEGF165基因转染犬骨髓基质干细胞对细胞的增殖能力无明显影响.     

转染人VEGF165基因对大鼠胰岛移植物再血管化及生物学功能的影响

目的探讨转染人血管内皮生长因子（VEGF）基因对大鼠胰岛移植物再血管化和生物学功能的影响。方法实验分二步进行，首先构建携带人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因的重组腺病毒载体AdhVEGF165，用其按病毒／细胞的感染倍数（MOI）分别为10、100、500的比例在体外转染新鲜分离、纯化的近交系Lewis大鼠胰岛，检测体外培养的胰岛表达hVEGF165基因的情况；然后按MOI为10的比例在体外用AdhVEGF165转染Lweis大鼠胰岛，再经门静脉注射至近交系Lewis大鼠的肝脏内（VEGF组），并设不含hVEGF165基因的空载体转染对照组（GFP组）和磷酸盐缓冲液处理对照组（PBS液组），术后测定受鼠的血糖变化，进行静脉糖耐量试验（IVGTT），并观察受鼠肝脏中移植胰岛的组织学变化。结果体外转染hVEGF165基因的大鼠胰岛分泌至细胞外的hVEGF165的浓度显著高于未转染者（P〈0．01）。糖尿病大鼠移植转染hVEGF165基因的胰岛后，静脉注射葡萄糖后40、60、120min时的血糖水平显著低于GFP组和PBS液组（P〈0．05）；40min时体循环中胰岛素的浓度，VEGF组显著高于GFP组和PBS液组（P〈0．05）；VEGF组移植胰岛内CD34和胰岛素免疫组化染色的强度均高于GFP组和PBS液组。结论转染hVEGF165基因对胰岛移植物的再血管化和生物学功能有促进作用。     

血管内皮生长因子基因转染促进股骨头坏死修复

目的　探索治疗股骨头及其它骨缺血性坏死新方法。方法　将血管内皮生长因子真核表达质粒pCD hVEGF1652 0 0 μg与胶原混合植入坏死的兔股骨头内 ,术后 2、4周用免疫组化SABC方法检测血管内皮生长因子 (VEGF)表达情况 ,组织形态学分析术后 2、4周修复区血管生成情况及术后 6、8周股骨头新骨形成情况。结果　术后 2周免疫组化证实基因转染组股骨头内有VEGF表达 ,组织形态学检测发现术后 2、4周转染基因的股骨头内血管生长快于对照组 ,术后 4、8周转染基因股骨头新骨形成多于对照组 ,差异均有显著性(P <0 0 1)。结论　利用VEGF基因转染刺激坏死骨组织内血管再生 ,可促进坏死骨修复 ,为临床治疗骨缺血性坏死提供了新的研究方向     

血管内皮生长因子基因体外转染大鼠神经干细胞的研究

目的 探讨经脂质体介导转染血管内皮生长因子(VEGF)121基因的大鼠胚胎神经干细胞体内外基因表达的特点。方法脂质体介导法将VEGF121基因转染到大鼠神经干细胞中。经逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫荧光染色检测转基因神经干细胞及其分化细胞的基因表达情况。用立体定向法将BrdU标记的转基因神经移植到大鼠大脑中动脉梗死模型的纹状体缺血半暗区。免疫荧光染色观察移植后1周转基因神经干细胞在脑内的基因表达情况。结果转基因神经干细胞及其分化的子代细胞均有VEGF121的表达并持续2周左右。转基因神经干细胞移植后1周在宿主脑内迁徙并表达VEGF基因产物。结论经脂质体介导转染VEGF121基因的大鼠胚胎神经干细胞在体内外均有良好的基因表达。     

血管内皮生长因子基因在原代培养大鼠肝细胞的转染表达

目的　研究血管内皮生长因子基因 (VEGF12 1)在原代培养大鼠肝细胞中转染表达。方法　构建 pIRES EYFP /VEGF12 1质粒 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、WesternBlot和荧光显微镜观察VEGF基因在原代培养大鼠肝细胞中的转染表达。结果　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建并转染原代培养大鼠肝细胞 ,RT PCR观察到 2 5 8bp的VEGF特异性条带 ,WesternBlot检测到相对分子质量 42× 10 3 的特异性条带 ,荧光显微镜观察到转染阳性肝细胞发出黄绿色荧光。结论　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒在原代培养大鼠肝细胞转染并表达 ,为VEGF基因修饰肝细胞移植和基因治疗奠定基础。     

血管内皮生长因子转染胚胎成骨细胞的实验研究

目的 观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)转染胚胎成骨细胞后的成骨细胞增殖情况.方法 取SD大鼠的胎鼠颅骨成骨细胞作原代培养后再进行体外培养扩增传代,同时构建含有VEGF基因片段(ad5-h-VEGF)的人5型腺病毒载体,以进入对数生长期的成骨细胞为靶细胞进行转染,免疫组化、免疫荧光定性检测实验组即转染(+)组与对照组即转染(-)组细胞,绘制转染前后的生长曲线,并进行统计分析.结果 VEGF在成骨细胞的表达可通过免疫组化、免疫荧光定性检测;实验组细胞增殖能力较对照组增强,统计分析转染组的细胞计数(＞48 h)显著高于空白对照组(P＜0.05).结论 VEGF能够在成骨细胞中成功表达,VEGF转染后能够促进成骨细胞生长及成骨.     

血管内皮生长因子在直肠癌中的表达与临床意义

目的：探讨血管内皮细胞生长因子在直肠癌中的表达及临床意义。方法：应用免疫组化S－P法，检测124例病人直肠癌组织中血管内皮细胞生长因子（VEGF）蛋白表达和微血管密度（MVD），分析VEGF和MVD及其与直肠癌组织学分型、Dukes分期，癌肿浸润转移的关系。结果：VEGF表达强度和MVD与直肠癌的Dukes分期（P＜0．05）、淋巴结转移（P＜0．05）及远处转移（P＜0．01）密切相关，而与组织学分型无关（P＞0．05），MVD与VEGF表达两者呈达相关（r=0.89)。结论：VEGF与直肠癌的血管生成密切相关，对直肠癌的生长和浸润转移有促进作用，VEGF和MVD可作为反映直肠癌生长学行为的指标之一。     

人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165腺病毒表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-VEGF165腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-VEGF165腺病毒,并进行电镜观察及滴度测定。感染大鼠骨髓间充质干细胞观察VEGF165基因的转录和表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒含有hVEGF165cDNA,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,测定包装的病毒滴度为6.3×1010TCID50/ml。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及免疫印迹检测骨髓间充质干细胞内有VEGF165的转录和表达。结论构建的VEGF腺病毒表达载体可有效感染骨髓间充质干细胞,并在体外高效表达,为将表达VEGF基因的骨髓间充质干细胞用于基因治疗提供了实验依据。     

血管内皮生长因子在胰腺癌中的表达及其对预后的影响

目的:研究胰腺癌组织中血管内皮生长因子表达与微血管生成和血管侵犯之间的联系,以及其临床意义和对预后的影响。方法:应用免疫组化方法测定36例胰腺癌切除标本中血管内皮生长因子(VEGF,VEGF-C)的表达;通过CD34染色测定其微血管密度(MVD)。结合临床病理和随访资料分析MVD、VEGF、VEGF-C表达与病人预后之间的关系。结果:胰腺癌组织中的MVD为44.04±12.80,VEGF阳性组MVD(49.95±9.57)显著高于阴性组(30.6±18.24)。VEGF的阳性率为69.4%(25/36),发生胰外侵犯组的阳性率为83.3%(20/24),UICC临床分期Ⅲ～Ⅳ期组的阳性率为92.9%(13/14)。VEGF-C的阳性率为55.6%(20/36),淋巴转移组的VEGF-C阳性率为83.3%(10/12),UICC临床分期Ⅲ～Ⅳ组阳性率为85.7%(12/14)。Kaplan-Meier生存分析显示,VEGF、VEGF-C阳性组的预后较差(P<0.05)。结论:胰腺癌的MVD显著升高,VEGF在胰腺癌中的高表达可反映肿瘤微血管生成状况,与胰腺癌的胰外侵犯及UICC临床分期之间有显著意义,故可作为判断预后的依据;VEGF-C与淋巴转移和UICC临床分期相关,也是判断预后的依据。     

胰腺癌细胞通过高表达核因子E2相关因子2促进巨噬细胞血管内皮生长因子表达的实验研究

目的:探讨胰腺癌细胞对巨噬细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及核因子E2相关因子2(Nrf2)在其中的作用。方法:检测单一人胰腺癌细胞(PANC-1)培养组、单一巨噬细胞培养组、肿瘤细胞和巨噬细胞共培养组中各细胞VEGF表达。利用野生组、Nrf2过表达组、Nrf2敲减组中PANC-1的条件培养基刺激巨噬细胞,检...     

碱性成纤维细胞生长因子小干扰RNA对胰腺癌细胞血管内皮细胞生长因子表达的调节作用

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)小干扰RNA(siRNA)对胰腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的影响.方法 利用siRNA技术抑制VEGF及bFGF表达,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰腺癌细胞株VEGF表达变化.结果 Panc-1及PCT-3细胞VEGF mRNA表达受到显著抑制,Panc-1为0.20 ±0.05,PCT-3为0.23±0.02.sw1990及PCT-3分泌VEGF受到显著抑制,sw1990为(1940.67 ±93.84) ng/L,对照组为(2560.67±181.79) ng/L;PCT-3为(174.00±98.73) ng/L,对照组为(779.33 ±317.52) ng/L.结论 bFGFsiRNA能够抑制胰腺癌细胞VEGF核酸及蛋白水平表达.     

血管内皮生长相关因子在胰腺癌组织中的表达

目的 观察胰腺癌组织中的血管内皮生长相关因子:色素上皮衍生因子(PEDF)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达以及胰腺癌中PEDF和VEGF平衡关系的变化与其预后的关系.方法 用SP免疫组织化学方法检测51例胰腺癌标本,观察PEDF和VEGF在胰腺癌中的表达以及相应的微血管密度(MVD),并和肿瘤血管密度、肿瘤浸润深度、肿瘤大小、血管侵犯、肿瘤病理TNM分期、淋巴结转移、远处转移等临床病理指标作单因素和多因素COX回归分析.结果 PEDF/VEGF与MVD之间明显关系(P<0.01),PEDF/VEGF值大小与肿瘤病理TNM分期(P<0.01)、淋巴结转移(P<0.01)、远处转移(P<0.05)有密切关系.Kaplan-Meier生存曲线分析,51例患者根据PEDF/VEGF值是否大于0.5分为两组,其中PEDF/VEGF≥0.5组生存曲线明显高于PEDF/VEGF<0.5组(log-rank test,P<0.01).PEDF/VEGF比值(风险系数0.390;P<0.05)、淋巴结转移(风险系数3.38;P<0.01)、远处转移(风险系数3.447;P<0.01)是胰腺癌独立的预后指标.结论 PEDF/VEGF比值可较好反映胰腺癌中的血管增生;它与胰腺癌患者的临床分期、淋巴结转移及远处转移相关,是胰腺癌重要的预后因子之一.     

胰腺癌淋巴管生成与血管内皮生长因子C的关系

目的探讨人胰腺癌组织中血管内皮生长因子C（VEGF-C）和其受体3（VEGFR-3）的表达与胰腺癌微淋巴管密度（LVD）、区域淋巴结转移的关系。方法免疫组织化学SP法检测67例人胰腺癌组织VEGF-C的表达情况，VEGFR-3结合Ⅳ型胶原（collagen type Ⅳ）进行LVD计数并结合临床和病理资料进行分析。结果VEGF-C的表达和胰腺癌分化程度、区域淋巴结转移、远处转移均呈显著相关（P〈0．05），LVD与胰腺癌分化程度、区域淋巴结转移、VEGF-C的表达程度呈明显相关（P〈0．01）。VEGFR-3不仅在肿瘤淋巴管内皮细胞上表达还在部分肿瘤血管内皮细胞上表达。结论VEGF-C通过其受体VEGFR-3促进胰腺癌淋巴管生成、区域淋巴结转移。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：VEGF—C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF—C的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有EcoRI和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT—RCR方法扩塔人乳腺癌细胞MDA—MB－231中的VEGF—C cDNA(1.26kb)；回收PCR产物(1．28kb)，并将其连接至克隆载体pUMT—18中，重组的pUMT—18在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF—C cDNA全长的酶切片断(1．27kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1（－)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT—PCR产物自有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pUMT—18中自有正确的人VEGF—C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1(-)中含有人VEGF—C cDNA全长序列。结论：VEGP—C/pcDNA3．1(－)。     

血管内皮生长因子和血小板衍化内皮生长因子的表达在甲胎蛋白阴性肝细胞癌根治性切除术后预后预测中的作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍化内皮生长因子(PD-ECGF)在甲胎蛋白(AFP)阴性肝细胞癌切除术后预后预测中的作用.方法 利用组织微阵列技术(tissue mi-croarray)和免疫组织化学方法回顾性研究200例AFP阴性肝癌患者肿瘤中VEGF及PD-ECGF的表达情况,分析其与肝细胞癌切除术后预后的关系.结果 V EGF及PD-ECGF表达阳性组与相应阴性组患者之间的生存率和无瘤生存率差异无统计学意义(P>0.05),而VEGF及PD-ECGF表达阳性组的术后复发率比相应阴性组显著增高(P<0.05).VEGF和PD.ECGF同时阳性表达组其复发率更显著高于同时阴性组(P<0.01),其生存率和无瘤生存率亦显著降低(P<0.05).结论 对于甲胎蛋白阴性肝癌患者,VEGF和PD-ECGF同时表达阳性提示术后易发生复发,预后不佳.     

降钙素基因相关肽促进大鼠BMSCs迁移及VEGF的表达

目的观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在大鼠BMSCs迁移中的作用及对VEGF、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)表达的影响,探讨CGRP通过BMSCs促进血管生成的作用机制。方法全骨髓法分离、培养SD大鼠BMSCs,采用Western blot法于传代培养1、2、3周时检测BMSCs中CGRP受体(CGRP receptor,CGRPR)蛋白的表达。使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP作用于BMSCs作为实验组,单纯BMSCs作为对照组,在培养72 h时采用细胞趋化实验检测CGRP对BMSCs迁移的影响;在培养1、3、5、7 d采用实时荧光定量PCR检测CGRP作用后VCAM-1 mRNA的表达变化,采用免疫细胞化学染色、Western blot法检测CGRP作用后VEGF的表达变化。结果 Western blot检测示BMSCs稳定表达CGRPR,2周时表达最高。细胞趋化实验显示,实验组CGRP刺激后穿膜迁移细胞数(3.20±1.77)个/HP,较对照组(1.11±0.49)个/HP明显增多(t=4.230,P=0.001)。实时荧光定量PCR检测示,实验组VCAM-1 mRNA表达随时间延长逐渐增加,7 d时最高;实验组3、5、7 d的VCAM-1 mRNA表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学染色示,培养1、3 d两组均无阳性染色;培养5、7 d实验组VEGF染色呈阳性,对照组无阳性染色。Western blot检测示,培养1、3 d两组均未检测到VEGF蛋白表达;培养5、7 d实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05);实验组5 d的VEGF蛋白表达量明显高于7 d(P<0.05)。结论 CGRP能促进BMSCs迁移及VEGF表达,这可能是CGRP调节骨内部血流变化而影响骨代谢的机制之一。