Ki-67核心启动子内最关键Sp1顺式作用元件的确定

目的 确定Ki-67启动子内调控转录最关键的Sp1顺式作用元件,探讨肿瘤细胞Ki-67基因高表达机制.方法 对Ki-67启动子内(-170～-145 nt)位置的Sp1顺式作用元件A2含有的两个Sp1一致性序列(-170/-160 nt)、(-159/-145 nt)分别作定点突变,把每个Sp1一致性序列的第3个碱基胞嘧啶"C"突变为胸腺嘧啶"T",得到突变体MutA(-170/-160 nt)和MutB(-159/-145 nt).使用双荧光素报告基因系统检测这些突变体在宫颈癌Hela细胞、人肾癌OS-RC-2和A549细胞中的转录活性.结果 2个Sp1一致性序列定点突变的启动子重组体在3种肿瘤细胞的转录功能均有显著降低,其中MutA在Hela细胞、OS-RC-2细胞、A549细胞中的活性分别降至突变前启动子活性的79.8%、65.9%、77.5%.MutB分别降至突变前启动子活性的36.9%、26.9%、28.6%.结论 Ki-67启动子-159～-145 nt区域的Sp1顺式作用元件对转录激活最为关键,起到调控肿瘤细胞Ki-67基因表达的作用.     

Ki-67启动子内Sp1位点与Hela细胞核蛋白结合活性

目的 观察Ki-67启动子内能与细胞核蛋白结合的转录因子Sp1结合位点,探讨肿瘤细胞Ki-67基因高表达机制.方法 提取Hela细胞核蛋白.针对Ki-67启动子内4个潜在Sp1位点区域A1(-198～-172)、A2(-170～-144)、A3(-63～-37)、A4(-14～+12),以及没有Sp1结合位点的阴性对照区域C(-117～-91),设计相应的Sp1一致性寡核苷酸探针和Sp1突变性寡核苷酸探针,凝胶阻滞电泳实验(EMSA)验证Sp1探针与Hela细胞核蛋白的结合活性.结果 EMSA显示A2、A3、A4一致性探针均可以和Hela细胞核蛋白结合,这种结合可以被相应的100倍浓度非标记的一致性探针竞争抑制,不能被100倍浓度的非标记的突变性探针所抑制.出现结合带的反应中加入Sp1抗体后观察到明显的Supershift现象.A1和C相应探针不能和Hela细胞核蛋白发生结合反应.结论 Ki-67启动子-170～-144、-63～-37和-14～+12区域上存在能与肿瘤Hela细胞核蛋白结合的Sp1结合位点.     

Ki-67启动子转录调控结构与功能研究

目的 观察Ki-67核心启动子调控元件对转录调控的影响.方法 根据Ki-67启动子结构软件分析结果,对Ki-67核心启动子(-223～+30)内的5个调控区域,包括(+13～+30)及4个潜在Sp1结合位点(-198～-172)、(-170～-144)、(-63～-37)和(-14～+12)进行内部缺失,目的片段缺失的Ki-67核心启动子插入pGL3-Basic载体,构建报告基因重组体质粒.将重组体分别转染肿瘤Hela、SW1990、SGC-7901、A549细胞株,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,并与Ki-67核心启动子质粒pGLBK2+转录活性比较.结果 缺失(+13～+30)的启动子重组体质粒在4种肿瘤细胞的转录功能均有显著提高,分别达到缺失前的1.2、2.0、1.7、1.4倍.缺失潜在Sp1结合位点的4个启动子重组体在4种肿瘤细胞的转录功能均有显著降低,其中缺失(-170～-144)后转录活性最小,在4种肿瘤细胞中分别降至未缺失前的16.2%、10.4%、6.7%、12.2%.结论 Ki-67启动子(+13～+30)区包含负性调控元件,对其缺失后形成的新的Ki-67核心启动子(-223～+12)是更好的调控肿瘤基因治疗的启动子.(-198～-172)、(-170～-144)、(-63～-37)和(-14～+12)可能存在潜在的Sp1顺式作用元件,其中-170～-144区域的顺式作用元件最为重要.     

原位杂交和免疫组化研究人类胰腺癌的Ki-67基因表达

目的 应用地高辛标记的Ki-67 cRNA(against exon 13 of the gene)进行mRNA原位杂交和免疫组化分析胰腺癌中ki-67基因的mRNA转录和蛋白翻译，研究Ki-67基因结构和功能表达的关系。方法40例胰腺癌(20例高分化腺癌，20例低分化腺癌)，9例非胰腺肿瘤(5例正常胰腺，1例慢性胰腺炎)，Ki-67基因第13外显子cDNA片段(435 bp)由PCR扩增，然后PCR产物克隆到质粒(3．9kb PCR^TM I vector)进行扩增，以此模扳合成地高辛标记的cDNA探针，应用mRNA原位杂交结合免疫组化研究Ki-67基因在胰腺癌的转录和蛋白翻译。结果应用地高辛标记的Ki-67 mRNA原位杂交和MIB-1免疫组化成功地检测胰腺癌巢中明显高于正常的Ki-67 mRNA转录和蛋白稠译，胰骧癌Ki-67表达明显高于非胰腺癌，并与胰腺癌组织学分级密切相关。结论 本研究首次证明：人类胰腺癌存在Ki-67基因的过度转录和翻译；且此基因的表达强度与胰腺癌的组织学分级亦密切相关，此基因的exon 13的转录在最终Ki-67蛋白的过度表达中起极重要的作用。     

Ki-67启动子的克隆及其转录活性

目的 克隆肿瘤特异Ki-67启动子,观察其在人肿瘤细胞中的转录活性.方法 提取肾癌Ketr-3细胞基因组总DNA作为模板,聚合酶链反应(PCR)获取1.6 kb的Ki-67启动子DNA片段.克隆到pGL3-Basic载体构建双荧光素酶检测质粒pGLB-Ki-67.将pGLB-Ki-67转染4种人肿瘤细胞及人脐静脉内皮Huvec细胞,使用双荧光素酶检测系统鉴定启动子活性及肿瘤特异性.结果 电泳与测序结果 显示克隆出的Ki-67启动子片段序列与Genbank中记录一致,pGLB-Ki-67质粒构建成功.其启动子活性在Hela、BIU-87、Ketr-3、A549 4种人肿瘤细胞内分别达到SV40 promoter/enhancer活性的21.0%、31.1%、23.9%和7.2%;在Huvec细胞内仅为0.5%.结论 克隆出I(5-67基因启动子(-820～+771),并证明其具有良好转录活性.     

Rac1及Ki-67因子在人翼状胬肉中的表达

目的：研究Rac1蛋白和Ki-67在人翼状胬肉中的表达,分析二者在翼状胬肉表达的相关性,探讨利用Rac1作为标记物评估翼状胬肉生物学特性,为临床诊疗提供参考。方法：应用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素免疫组织化学方法（S-P法）对39例原发性翼状胬肉及12例正常球结膜组织中的Rac1及Ki-67蛋白进行检测。结果：Rac1及Ki-67蛋白在翼状胬肉组织中的表达均高于正常结膜组,差异有显著性意义（Z=-3.386,Z=2.707,P均〈0.05）。Rac1及Ki-67蛋白表达之间的相关系数r=0.384,差异无显著性意义（P〉0.05）。结论：Rac1及Ki-67在翼状胬肉中的高度表达,提示翼状胬肉在细胞骨架,基底膜分解代谢和细胞增殖活跃方面发生了变化。     

乳腺癌易感基因1、Ki-67在青年乳腺癌患者组织中的表达及其临床意义

目的 探讨乳腺癌易感基因1(BRCA1)和Ki,67蛋白在青年乳腺癌患者组织中的表达及临床意义.方法 选取年龄≤35岁青年乳腺癌89例,对照组为乳腺纤维腺瘤35例及年龄＞35岁的乳腺癌85例,运用免疫组织化学法检测Ki-67和BRCA1蛋白的表达,并结合临床病理因素进行相关分析.结果 在维吾尔族青年乳腺癌患者中,BRCA1的表达(39.33％)低于乳腺纤维腺瘤(74.29％)及年龄＞35岁组(58.82％,P＜0.05),Ki-67的表达(71.91％)高于乳腺纤维腺瘤(28.57％)及年龄＞35岁组(57.64％,P＜0.05);青年乳腺癌患者的病理组织学分级、淋巴结转移、原癌基因表皮生长因子受体2(Her-2)表达与BRCA1及Ki-67表达相关(P＜0.05);青年乳腺癌患者Ki-67与BRCA1蛋白的表达呈负相关(r=-0.265,P＜0.05).结论 青年乳腺癌中BRCA1和Ki-67蛋白表达的异常及BRCA1的失表达,可能与发病早、恶性度高有关.     

膀胱移行细胞癌MRP-1/CD9和Ki-67抗原表达及其相关性分析

目的 探讨MRP-1/CD9和Ki-67抗原表达与膀胱移行细胞癌(TCC)生物学行为的关系.方法 膀胱TCC组60例标本经病理复检,UICC临床分期Ta～T1 29例、T2～T4 31例;WHO病理分级G1 19例、G2 14例、G3 27例.其中肿瘤初发41例、复发19例;单发34例、多发26例.11例正常膀胱组织标本作为对照组.应用免疫组化法检测组织MRP-1/CD9和Ki-67抗原表达情况.结果 TCC组MRP-1/CD9阳性表达率48.3%,对照组为90.9%(P=0.023);Ta～T1肿瘤阳性表达率75.9%、T2～T4为22.6%,G1肿瘤阳性表达率73.7%、G2 42.9%、G3 33.3%,随肿瘤分期分级上升,阳性表达率逐渐下降(P=0.000,P=0.024);MRP-1/CD9阳性表达率肿瘤单发者高于多发者(P=0.017),肿瘤初发和复发者之间差异无统计学意义(P=0.511).TCC组Ki-67阳性表达率75.0%,对照组为18.2%(P=0.001);Ta～T1肿瘤阳性表达率62.1%,T2～T4为87.1%;G1肿瘤阳性表达率47.4%、G2 85.7%、G3 88.9%.随着肿瘤分期分级升高,Ki-67阳性表达率逐渐升高(P=0.001,P=0.003).Ki-67阳性表达率肿瘤多发者明显高于单发者(P=0.000),肿瘤初发和复发者之间差异无统计学意义(P=0.083).MRP-1/CD9表达与Ki-67抗原表达呈负相关(r=-2.74,P=0.034).结论 MRP-1/CD9表达与TCC的分期、分级相关,其表达缺失可能是判断该肿瘤预后的一项指标;Ki-67能较准确地评估膀胱TCC的生物学行为,二者可作为膀胱TCC有诊断意义的肿瘤标志物.     

Bcl基因与Ki—67抗原在胃癌组织中表达的研究

目的:探讨bcl-2基因和Ki-67抗原在胃癌中的表达及其可能的作用和意义.方法:用免疫组织化学LSAB法检测bCI-2和Ki-67在胃癌中的表达.结果:正常胃粘膜中bcl-2基本无表达.慢性萎缩性胃粘膜中可见基底部有bcl-2表达.7例胃癌bcl-2表达阳性,其中肠型胃癌阳性高于弥漫型.bcl-2的表达与胃癌的浸润深度和淋巴结转移无关.弥漫型胃癌的Ki-67表达显著高于肠型胃癌.Ki-67指数随浸润深度的增加而增高.有淋巴结转移的Ki-67指数显著高于无转移者.结论:bcl-2的表达可能对胃癌特别是肠型胃癌的发生有重要作用.Ki-67的表达与胃癌的发展及其预后的判断可能有意义.