携带超抗原SEA基因的特异性溶瘤腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建携带超抗原SEA基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-SEA.将鉴定正确的pCA13-SEA与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-SEA.Ad-SEA在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度.结果 克隆得到771bpSEA全长基因.经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,SEA基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现SEA基因的表达,且病毒滴度达6.5×109pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体.     

超抗原SEA对人胃癌细胞株小鼠荷瘤模型作用及其机制的研究

目的　探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 (SEA)对体内肿瘤的抑瘤效果及作用机制。方法　采用人胃癌细胞 (MGC80 3 )皮下接种建立小鼠胃癌模型 (n =40 ) ,实验组 (n =2 0 )注射SEA ,对照组 (n =2 0 )注射生理盐水 ,观察肿瘤的发生率及肿瘤的重量。并对瘤体组织应用免疫组织化学方法初步探讨其发生机制。结果　超抗原SEA处理的小鼠肿瘤的发生率低于对照组 ,两者差异无显著性 ;超抗原SEA处理的小鼠肿瘤的重量明显低于对照组 ,两者差异有显著性 (P <0 .0 1) ;SEA处理的小鼠肿瘤组织有CD4 T细胞和CD8 T细胞浸润 ,而对照组很少或没有T细胞浸润。结论　超抗原SEA对小鼠胃癌细胞有明显抑瘤效果 ,其作用机制可能为SEA诱导了超抗原依赖细胞介导的细胞毒效应所致     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对小鼠体内肺瘤的抑制作用

我们通过小鼠模型注射超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA），观察SEA对小鼠体内肿瘤的抑瘤效果，并探讨其作用机制。     

超抗原金葡萄球菌肠毒素A对大鼠骨肉瘤的免疫治疗

本实验旨在观察超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对骨肉瘤荷瘤鼠免疫功能的影响及抑瘤效应，并分析其作用机制，以期为成骨肉瘤的免疫治疗寻求一种新方法。     

用白蛋白纳米粒做基因载体的体外研究

目的　评价白蛋白纳米粒做为p5 3基因载体的可行性。方法　应用复凝聚法制备白蛋白纳米粒 ,连接上 p5 3基因 ,制备成 p5 3 白蛋白纳米粒。将p5 3 白蛋白纳米粒 ,同剂量的 p5 3 脂质体微粒阳性对照组与裸DNA的阴性对照组分别转染至培养的HepG2细胞中 ,用逆转录 多聚合酶链反应 (RT PCR)及Westernblot测 p5 3的表达。 结果　 (1)白蛋白纳米粒呈均匀分散的球形颗粒 ,平均粒径为 98nm。 (2 )白蛋白纳米粒能有效结合 p5 3基因。 (3 )白蛋白纳米粒能将p5 3基因高效地呈递到HepG2细胞中并表达 ,作用优于阳性对照组 ,而阴性对照组无表达。结论　制备了粒径较小的白蛋白纳米粒 ,能有效连接上 p5 3基因片段 ,并能转染HepG2细胞。     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A锚定的膜表达热休克蛋白70的肠癌瘤苗的抗癌治疗作用研究

目的 研制超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）锚定的膜表达热休克蛋白（HSP）70的肠癌细胞瘤苗，研究其抗肿瘤治疗作用。方法 以先期实验制备的膜表达HSP70肠癌细胞株CT26。扩增后以本研究组早先研制的跨膜型SEA蛋白转染法锚定肠癌细胞，灭活并制备双重修饰的肠癌细胞瘤苗。观察瘤苗在体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效应；在BALB／c小鼠结直肠癌移植模型中观察瘤苗的抗癌治疗作用：瘤体生长抑制和荷瘤鼠的生存时间；并同时检测实验鼠的自然杀伤细胞（NK）和细胞毒淋巴细胞（CTL）活性。结果 激光共聚焦显微镜和流式细胞术均证明瘤苗细胞的双重修饰：SEA锚定，HSPT0表达并结合在瘤苗细胞膜表面。比较对照。SEA锚定或膜表达HSPT0的单一修饰瘤苗均显示出较高的鼠淋巴细胞增殖刺激效应；较强的瘤体生长抑制。并使荷瘤鼠的生存时间延长。而SEA锚定的膜表达HSP70的双重修饰瘤苗比单一修饰瘤苗，有着更高的淋巴增殖刺激效应，更强的瘤体生长抑制作用，并使荷瘤鼠的生存时间进一步延长。结论 成功研制了超抗原SEA锚定的膜表达HSPT0的肠癌细胞瘤苗，此双重修饰瘤苗对结直肠癌荷瘤小鼠有更强的治疗作用。     

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素对荷瘤大鼠胃癌模型炎性介质影响的研究

目的　研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 (SEA)对荷瘤大鼠胃癌模型炎性介质影响。方法　采用人胃癌细胞 (MGC80 -3 )皮下接种建立大鼠胃癌模型 40只 ,实验组注射SEA ,对照组注射生理盐水 ,检测大鼠体内炎性介质水平。结果　荷瘤大鼠模型SEA处理以后 ,血清IL 1β ,IL 6,IL 12 ,TNF α和内毒素水平均明显上升 ,与对照组相比差异有显著性 ,尤其以血清IL 1β内毒素水平上升明显 (P <0 .0 1)。结论　超抗原SEA可激活大量的T细胞 ,分泌多种细胞因子 ,直接或间接地杀伤肿瘤细胞。     

装载超抗原SEA基因的由前列腺特异性抗原和端粒酶逆转录酶启动子双调控靶向前列腺癌的溶瘤腺病毒载体的构建

目的 构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素(SEA)基因的由前列腺特异性抗原(PSA)启动子及端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒SG504-SEA.方法 从前列腺癌组织基因组DNA中获得522 bp大小的PSA启动子序列,将PSA启动子克隆到由hTERT启动子调控的特异性增殖溶瘤腺病毒载体SG502中.得到靶向前列腺癌细胞的双调控溶瘤腺病毒载体SG504.将已构建好的含有771 bp大小SEA基因片段的病毒骨架质粒PPE3-cdb-SEA与SG504用Lipofectamine 2000共转染至293细胞.共转染后9～14 d出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,经鉴定正确的腺病毒命名为SG504.SEA,即携带SEA基因的双调控靶向前列腺癌的特异性溶瘤腺病毒.结果 经聚合酶链反应(PCR)及酶切鉴定,SEA基因成功克隆到病毒载体中,可以表达SEA基因,且病毒滴度为2.0×10~(10)pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG504-SEA.     

固醇携带蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体,研究其与胆固醇结石形成的关系。方法:(1)利用RT-PCR技术克隆小鼠SCP2基因,在其上游接入白蛋白(ALB)启动子,下游连接绿色荧光报告基因(EGFP),构建穿梭质粒pDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP;(2)采用Ad Max TM Adenoviru5 Vector系统包装病毒,CsCl法纯化病毒、TCID50法测定滴度;(3)重组腺病毒感染小鼠hepa-1-6细胞,实时定量PCR检测mRNA的表达;Western印迹检测SCP2蛋白表达情况;结果:成功构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体;当SCP2基因过表达时,CYP7a1基因表达下调,(t=3.97,P<0.05)HMGCR基因基因表达上调,(t=3.23,P<0.05)。结论:当SCP2基因过表达时引起HMGCR、CYP7a1基因转录水平的变化,提示SCP2基因可能通过影响胆固醇和胆汁酸的代谢而参与胆固醇结石的形成。     

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的　构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法　利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果　( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论　成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 ,有望作为肝细胞体外培养的可用技术     

腺病毒介导的HSV-tk基因治疗膀胱癌的研究

目的观察腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)联合更昔洛韦(GCV)治疗膀胱癌的效果。方法构建膀胱癌SCaBER移植瘤模型,观察肿瘤注射重组腺病毒(Ad.tk)结合GCV治疗移植瘤的变化;免疫组织化学法(SP法)检测肿瘤内微血管密度(MVD)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达;PCR检测肿瘤及脏器内tk基因和腺病毒E1区表达。结果肿瘤内注射5×108pfu的Ad.tk/GCV可使肿瘤缩小或消失,治疗组肿瘤平均重量为0.21g,对照组分别为1.63g(HSVtk/PBS组)、1.69g(PBS/GCV组)、1.72g(PBS组),治疗组与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。PCNA染色治疗组肿瘤细胞呈弱阳性(21.43%),对照组呈强阳性,分别为71.44%、65.81%、74.63%,差异有显著性(P<0.01)。MVD在治疗组明显低于对照组(P<0.01)。结论HSVtk/GCV系统治疗膀胱癌效果显著,其作用机制包括干扰DNA合成、诱导凋亡和杀伤肿瘤微血管     

Preoperative serum albumin level is a prognostic indicator for adenocarcinoma of the gastric cardia

Among patients with adenocarcinoma of the gastric cardia, we noted that patients with higher preoperative serum albumin levels appeared to survive longer than patients with lower levels. Thus, we evaluated serum albumin as a prognostic factor for patient survival. From 1987 to 1997, 314 patients with adenocarcinoma of the gastric cardia underwent curative resection. Patient serum albumin levels were evaluated on the second day after admission, before any nutritional support. Patients were divided into two groups: those with normal serum albumin levels (>3.5 g/dl) and those with abnormal serum albumin levels. The perioperative mortality and morbidity were 5.7% (18 of 314) and 22.3% (70 of 314), respectively. The surgical resectability rate was significantly better among patients with normal serum albumin levels (P < 0.001). The 5-year overall survival rate of patients with normal serum albumin levels was also better than those with abnormally low serum albumin levels (38.4% versus 19.1%, P = 0.0003). In each cancer stage, the 5-year survival rate of patients with normal serum albumin levels was better than that among those with hypoalbuminemia. By multivariate analysis, serum albumin level and the pathologic T, N statuses were independent factors correlated with prognosis. Preoperative serum albumin level correlated highly with resectability and survival. Patients with abnormal serum albumin levels had worse survival than did those with normal serum albumin levels. We recommend that postoperative adjuvant therapy be given to all patients with hypoalbuminemia preoperatively. Presented at the Forty-Fifth Annual Meeting of The Society for Surgery of the Alimentary Tract, New Orleans, Louisiana, May 15–19, 2004 Presented at the Forty-Fifth Annual Meeting of The Society for Surgery of the Alimentary Tract, New Orleans, Louisiana, May 15–19, 2004     

可调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建

目的　构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体 ,检测该调控元件的特异性和可调控性。方法　PCR扩增截短的AFP基因启动子、增强子 ,将上述片段与含有报告基因强化绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP 1的多克隆位点连接 ,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性EGFP表达载体 (pEGFP 1 EP)。用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系 ,荧光显微镜观测重组AFP顺式作用元件的启动活性 ,并用流式细胞术检测全反式视黄酸对它的抑制作用。结果　成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pEGFP 1的多克隆位点 ,酶切鉴定和DNA序列分析无误 ,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达 ,1× 10 -7M全反式视黄酸对其活性有明显的抑制。结论　AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体 ,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达 ,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础。     

Phase i study of intravesical vaccinia virus as a vector for gene therapy of bladder cancer

PURPOSE: Vaccinia virus is a DNA poxvirus previously used as a vaccine to eradicate smallpox. The virus has a high efficiency of infection, replicates in the cytoplasm without chromosomal integration and can transport a large amount of recombinant DNA without losing infectivity. Therefore, it is an excellent choice as a vector for gene delivery in vivo. Large quantities of vaccinia have been injected into dermal, subcutaneous and peripheral lymph node melanoma metastases without significant side effects, and with efficient infection of the tumor cells and recombinant gene transfection. To determine if vaccinia, when given intravesically, can effectively infect bladder mucosa and tumor with acceptable toxicity, we performed a phase I trial of intravesical vaccinia in patients with muscle invasive transitional cell carcinoma before radical cystectomy. MATERIALS AND METHODS: After documenting immune competence and demonstration of a major reaction after revaccination, patients received 3 increasing doses of intravesical Dryvax vaccinia virus (Wyeth-Ayerst Laboratories, Philadelphia, Pennsylvania) that was provided by the Centers for Disease Control. Approximately 24 hours after the third dose, cystectomy was performed and the tissue was examined microscopically. RESULTS: There were 4 patients who were treated. The 3 patients who received the highest doses (100 x 106 plaque forming units) had significant mucosal and submucosal inflammatory infiltration by lymphocytes, eosinophils, and plasma cells into tumor and normal tissue. Dendritic cells were recruited to the site after exposure to the vaccinia. Significant mucosal edema and vascular ectasia were seen. Tumor and normal urothelial cells showed evidence of viral infection, including enlarged vacuolated cells with cytoplasmic inclusions. There were no clinical or laboratory manifestations of vaccinia related toxicity except mild dysuria. Of the 4 patients 3 survived and were free of disease at 4-year followup. CONCLUSIONS: Our study demonstrates that vaccinia virus can be administered safely into the bladder with recruitment of lymphocytes and induction of a brisk local inflammatory response. To our knowledge, this is the first report of direct delivery of live virus into the human bladder. The role of wild type vaccinia as immunotherapy for bladder cancer warrants further study. Furthermore, these data support the exploration of recombinant vaccinia as a putative gene therapy vector for intravesical infection and transfection of bladder tumor cells with cytokine or other genes, an approach that our group pioneered and most recently studied in patients with superficial melanoma.     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的重组腺病毒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒系统，观察其在膀胱癌细胞中的表达。方法构建带有hTERT启动子的腺病毒穿梭载体pDC315-Tp—EGFP，细胞重组技术获得腺病毒Ad-hTERT-EGFP，按感染复数（MOI）100体外转染膀胱癌细胞株253J及人胚肺成纤维细胞株MRC-5，通过倒置荧光显微镜和Rt—PCR分别检测EGFP的表达。带有小鼠巨细胞病毒（mCMV）启动子的腺病毒Ad-EGFP作为阳性对照。结果成功构建出重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP，滴度为3．8×10^10空斑形成单位（pfu）／ml，Ad—hTERT-EG-FP感染的253J细胞中，（85．2±3．3）％发出明亮的绿色荧光；而其感染的MRC-5细胞未产生绿色荧光（P〈0．01）；对照病毒Ad-EGFP在253J和MRC-5中分别有（87．1±2．2）％及（92．5±3．1）％的细胞可见到绿色荧光。RT-PCR检测显示：253J细胞转染Ad-hTERT-EGFP、Ad-EGFP后及MRC-5细胞转染Ad-EGFP后均有EGFP基因表达；而MRC-5细胞转染Ad-hTERT-EGFP后未见EGFP基因表达。结论该腺病毒系统中hTERT启动子调控下游基因可选择性地在膀胱肿瘤细胞中表达，在正常细胞中不表达，具有明显的靶向性。     

腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统杀伤膀胱癌细胞的研究

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／更昔洛韦（HSV－tk/GCV)系统杀伤膀胱癌细胞的作用。方法;采用人巨细胞病毒早期蛋白启动子驱动HSV－tk基因重组腺病毒（Ad)载体,体外转染HTB9和Scan BER细胞,MTT法测定杀伤率,PCR检测Ad-tk转染细胞中tk基因及腺病毒E1区基因。结果：GCV对转染的癌细胞有杀伤作用,感染复数（MOI）100时,10mg/L GCV杀伤80％的tk^ 细胞,而对未转染的细胞无杀伤作用。不同MOI的Ad-tk转染两种细胞,其毒性与Ad-tk MOI正相关,MOI100时,15mg/L GCV杀伤100％的细胞,无GCV组未受到抑制。PCR证实Ad-tk转染细胞有tk基因,腺病毒E1区基因阴性。Annexin V法证实杀伤效应与凋亡有关。结论：HSV-tk/GCV系统是一种有效,安全治疗膀胱癌的新方法。     

乙肝病毒L颗粒作为肝癌靶向性基因治疗载体的研究

目的 评估乙肝病毒L蛋白颗粒作为一种新型肝癌靶向性基因治疗转运载体的可行性.方法 通过电穿孔方法(电压=400 V,脉冲时间=60 us,pGFP:L颗粒=4:10)将绿色荧光表达质粒pGFP导入乙肝病毒L颗粒,形成的L/pGFP颗粒转染各种肝来源细胞株以及非肝来源细胞株,以脂质体作为对照转染相同细胞株,荧光湿微镜检测各细胞株基因转运效率.结果 L/pG-FP颗粒对各种肝来源细胞株均保持较高的转染效率.对正常肝来源细胞L02的转染效率(67.0±2.6)%低于肝癌细胞株HepG2(75.0±3.5)%和7721(72.0±2.3)%,然而均显著高于脂质体的转染效率(P<0.05).非肝来源的乳腺癌细胞株MCF-7不能被L/pGFP颗粒有效转染.未接受电穿孔的L颗粒+pGFP混合液不能有效转染任何细胞株.结论 L颗粒能特异性、高效转运外源性基因至各种肝来源细胞,可作为一种安全高效的靶向性转运载体用于肝癌的基因治疗.     

多聚乙烯亚胺介导IL-12基因增强裸鼠抗骨肉瘤免疫

目的 :观察以多聚乙烯亚胺 (polyethylenimine ,PEI)为载体 ,体内转染小鼠白细胞介素 12 (inter leukin 12 ,mIL 12 )基因 ,治疗裸鼠骨肉瘤模型的疗效。方法 :以PEI为载体 ,体外转染mIL 12基因入人骨肉瘤细胞 ,并观察此基因表达情况。建立裸鼠骨肉瘤动物模型 ,将PEI包裹mIL 12基因直接注入肿瘤局部 ,检测此基因的蛋白表达情况和小鼠脾脏自然杀伤细胞 (NK)活性。结果 :在PEI/DNA治疗组小鼠的肿瘤局部 ,mIL 12蛋白水平明显升高 ,小鼠脾NK细胞活性增强。结论 :PEI可以成功的将mIL 12基因导入裸鼠骨肉瘤模型 ,mIL 12基因治疗可提高机体的抗肿瘤免疫应答     

联合自杀基因及内皮抑素基因双靶点体外治疗膀胱癌

目的 观察基因重组腺相关病毒自杀基因及内皮抑素(ES)联合基因体外治疗膀胱癌的效果.方法 (1)通过基因重组腺相关病毒(rAAV)-增强绿色荧光蛋白(EGFP)转染膀胱肿瘤T24细胞,确定rAAV对T24细胞的转染效率;(2)通过rAAV-胸苷激酶(TK)-核糖体插入位点(IRES)-ES(简称rAAV-TIE)体外转染T24、HUVEC细胞,MTT法、流式细胞仪等方法 来检测诱导凋亡作用.结果 (1)rAAV-EGFP转染T24细胞后可以表达携带的外源基因EGFP,感染效率约为62%;(2)rAAV-TK、rAAV-TIE转染T24细胞72 h后,流式细胞仪检测结果 显示.rAAV-TK、rAAV-TIE两组凋亡率分别是37.02%和32.14%,明显高于空病毒转染组(7.90%)和空白对照组(0.30%).结论 rAAV-TIE可有效抑制膀胱癌的血管生成和肿瘤的生长,能够双靶点基因治疗膀胱肿瘤.