实时荧光定量PCR技术在乳酸菌定量检测中的应用

与传统的菌落计数、杂交技术及PCR技术等相比,实时荧光定量PCR技术作为一种检测和定量微生物的方法,具有较高的灵敏度及可重复性,而且反应过程快速,污染较小.作者综述了实时荧光定量PCR技术的定量原理,荧光检测物质,目的基因序列以及其特点,并且列举了在乳酸菌定量检测中的应用,同时对其应用前景进行了展望.     

实时荧光定量PCR检测胃癌淋巴结微转移及其临床意义

目的使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测胃癌淋巴结的微转移情况,并探讨微转移的临床意义。方法收集我院2010年1～6月期间40例行胃癌根治术切除的281枚和10例行胃十二指肠溃疡手术切除的39枚,共计320枚淋巴结标本,以CEA、CK-19和CK-20为引物进行qRT-PCR检测其微转移情况,并分析微转移的临床病理特点。结果 40例胃癌患者中有28例(70.00%)、31枚(15.35%,31/202)淋巴结检测出有微转移。10例胃溃疡的39枚淋巴结标本,HE染色检测和qRT-PCR检测均为阴性。淋巴结微转移的阳性率与肿瘤分化程度、浸润深度和临床分期有关(P<0.05)。结论 qRT-PCR是检测胃癌淋巴结微转移敏感且特异的方法,对胃癌临床分期、判断预后以及治疗方案选择具有重要意义。     

实时荧光定量检测胃癌患者MUC1基因表达及临床意义

目的:检测胃癌患者肿瘤组织及外周血MUC1 mRNA的表达水平,探讨MUC1 mRNA表达的临床意义.方法:利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测胃癌组织、正常组织及外周血中MUC1mRNA水平,分析其表达与肿瘤临床病理因素的关系.结果:胃癌患者肿瘤组织及外周血MUC1 mRNA表达水平高于正常对照组(P<0.05),肿瘤组织MUC1 mRNA的检出率与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、血行转移及临床分期有关(P<0.05),外周血MUC1 mRNA的检出率与肿瘤的淋巴结转移、血行转移及临床分期有相关(P<0.05).结论:检测胃癌组织及外周血MUC1 mRNA的表达有助于早期发现胃癌及其微转移.     

光滑假丝酵母菌感染实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的：建立、优化快速检测临床标本中光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法，并评价其临床应用价值。方法：以光滑假丝酵母菌ITSⅡ基因的一段高度保守序列为扩增靶序列，合成引物和探针，并与pMD19-T构建重组质粒作为标准品，建立检测光滑假丝酵母菌的实时定量荧光PCR方法。从线性范围、重复性、敏感性、特异性等4个方面对反应体系进行方法学评价。用建立的实时荧光定量PCR方法对1042例临床标本（包括血液、尿液、痰液、胸水、支气管肺泡灌洗液）进行检测，并与真菌培养法进行比较。结果：建立的光滑假丝酵母菌实时荧光定量PCR方法的灵敏度可达10CFu／ml；与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。重复检测样本，其循环阈值的试验内及试验间变异系数均小于10％。用于临床标本检测时共检出96份阳性标本，与真菌培养法（检出93份阳性标本）的一致性好（Kappa值为0．925）。结论：实时荧光定量PCR方法检测光滑假丝酵母菌灵敏度高、特异性及重复性好；可直接用于各种临床标本中光滑假丝酵母菌的检测，能大大缩短报告时间，为临床诊断提供可靠依据。     

实时荧光定量RT-PCR检测良性前列腺增生与前列腺癌相关基因表达的临床意义

目的应用实时荧光定量RT-PCR检测良性前列腺增生（BPH）与前列腺癌相关基因表达。方法通过实时荧光定量RT-PCR对9个前列腺癌相关基因（KLK3、KLK2、KLK11，pim-1，hepsin，PSMA，AR，p27，IGF-1）在前列腺正常组织、BPH组织和癌组织（PCa）定量表达，分析其特异性的差异。结果检测9个选定相关基因中发现KLK2，pim-1，AR和IGF-1在这3种组织中的表达差异有统计学意义（P＜0．01）。结论KLK2，pim-1，AR和IGF-1作为前列腺癌组织特异性的分子标记物组合，有望提高前列腺癌早期诊断的准确性。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术检测人早孕蜕膜和黄体中期子宫内膜白血病抑制因子的表达

目的探讨白血病抑制因子(LIF)在人早孕期子宫蜕膜和黄体期子宫内膜的表达情况。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术,对36例正常早孕子宫蜕膜和34例输卵管阻塞妇女黄体中期子宫内膜进行LIF定量检测。结果黄体中期子宫内膜LIF表达量高于早孕期子宫蜕膜组织,表达中位数(M)分别为240.00和46.50 ng/L。两组比较差异有显著性(P<0.01)。结论LIF基因在黄体中期(胚泡着床期)子宫内膜表达量较高,在早孕期子宫蜕膜表达量较低,提示黄体中期和早孕期LIF基因表达量的差异与胚泡着床和妊娠维持的不同生理阶段有关。     

SYBR green实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA方法的建立

目的：建立SYBR green实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA水平的方法，并初步应用于美容相关疾患。方法：构建内参GAPDH质粒，倍比稀释VEGF和GAPDH标准品，建立PCR标准曲线，同时绘制熔解曲线，后应用SYBR Green实时荧光定量PCR检测正常皮肤、烧伤瘢痕、恶性黑素瘤细胞株A2058和WM793 cDNA的VEGF mRNA水平。结果：VEGF、GAPDH的标准曲线，符合线性要求，相关系数r均为1，熔解曲线峰值单一，产物特异度好，四组样本的SYBR green荧光定量PCR结果提示瘢痕组织、A2058、WM793的VEGF mRNA水平明显高于正常皮肤。结论：本研究成功建立了VEGF mRNA水平的SYBR green荧光定量PCR检测方法。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测前列腺癌中Id1 mRNA的表达及意义

目的 检测Id1 mRNA在人前列腺癌（PCa）组织中的表达，探讨Id1 mRNA的表达与临床意义。方法 用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行实时逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR），检测Id1 mRNA在人正常前列腺、前列腺良性增生（BPH）和PCa组织中的相对定量，分析Id1 mRNA的相对含量与PCa临床病理参数间关系。结果 Id1 mRNA在PCa组织中的含量明显高于BPH组织（P〈0．01）。Id1 mRNA表达量与PCa的Gleason评分有明显相关性（r=0．9995，P〈0．05）。Id1 mRNA表达量高者，2年内发生浸润和转移的机率提高。结论 PCa组织中Id1 mRNA表达明显增高，与肿瘤分化程度成负相关，Id1 mRNA的高表达从转录水平反映了其与前列腺癌病情进展的关系；Id1 mRNA的实时定量检测有助于从转录水平对前列腺癌进行早期诊断并初步指导预后。     

恶性肿瘤的死亡风险与协同刺激分子B7-H4表达的关系

目的 探讨恶性肿瘤死亡风险与协同刺激分子B7-H4表达的关系.方法 制定原始文献的检索方案、纳入标准与排除标准,在PubMed与中国学术期刊网全文数据库(CNKI)、万方数据库、中文期刊上联合检索1999至2009年发表的论文.应用Stata 10.1软件对相关文献进行齐性检验,以(HR)值和95%CI为效应指标,根据一致性检验的结果,选择效应模型对HR值进行合并,并进行偏倚评估.结果 共检索到相关文献35篇,6篇进入Meta统计分析,异质性检验(x2=9.61,df=5,P＞0.05),选择固定效应模型进行估计.多因素分析合并HR值为1. 42(95%CI为1.16～1.72).结论 协同刺激分子B7-H4高表达与恶性肿瘤患者死亡风险密切相关,B7-H4可能是影响恶性肿瘤患者长期生存的一个负性调节分子.     

共刺激分子B7-H4在胃癌组织中表达及其与预后的关系

H4的高表达与胃癌患者的生存时间成负相关,证实了B7-H4为一负性调节分子,可作为判断胃癌生存期的指标;CIK细胞治疗可以显著延长胃癌患者的生存期.     

B7-H1 与B7-H4 在膀胱癌大鼠及其癌旁组织中的差异表达

目的:研究膀胱原位癌组织及癌旁组织中共刺激分子 B7-H1与 B7-H4的表达情况,并分析二者的相关性。方法:采用 N-亚硝基 -N-甲基脲(MNU)溶液膀胱灌注法制备膀胱癌大鼠模型(30只),处死大鼠,获取癌组织及癌旁组织,进行病理检查;采用生理盐水溶液膀胱灌注法作为对照组( 12只),处死大鼠,获取膀胱组织,进行病理学检查;采用 RT-PCR技术分别检测对照组大鼠膀胱组织( A组)、膀胱癌模型组癌组织( B组)及模型组癌旁组织( C组)中 B7-H1与 B7-H4的 mRNA的表达水平,并分析二者之间的相关性。结果: 30只膀胱癌模型组大鼠, 28只模型制备成功,造模成功率 93.3%。A组、C组 B7-H1、B7-H4 mRNA表达量均明显低于 B组(0.71±0.38、0.79±0.21 vs 1.44±0.67;0.84±0.22、     

协同刺激分子B7-H3与B7-H4联合效应对胃癌患者预后的影响

目的 探讨胃癌组织中协同刺激分子B7-H3和B7-H4的表达水平对胃癌患者预后的影响及其与临床病理特征的关系.方法 采用回顾性研究随访调查157例胃癌患者的相关临床资料;应用免疫组织化学染色法检测相关病理指标及胃癌患者手术标本中B7-H3、B7-H4的表达;胃癌患者不同临床特征与B7-H3、B7-H4表达水平的相关性采用x2检验,不同临床特征患者的无进展生存期(PFS)及总生存期(OS)的比较采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验,拟合多因素Cox模型,用风险比(HR)及95％可信区间(CI)估计不同临床指标与复发和死亡结局的联系强度.结果 B7-H3、B7-H4表达水平与不同临床特征之间无明显相关;单因素生存分析显示年龄较大(＞60岁)、分期较晚、肿瘤较大(＞5 cm)、浸润较深(侵及深肌层)、远处转移及协同刺激分子B7-H4高表达等显著减少PFS及OS(P ＜0.05);多因素Cox模型分析提示,与Ⅰ期[5.58(95％ CI:1.27 ～24.58)]比较,Ⅳ期胃癌患者复发和死亡的HR分别为6.20(95％ CI:1.31 ～29.34);与肿瘤直径≤5 cm的患者[1.95(95％ CI:1.20 ～3.18)]比较,肿瘤直径＞5 cm的患者其为1.97(95％CI:1.19 ～3.25);相对于其他表达组,B7-H3低表达且B7-H4高表达的胃癌患者复发和死亡的HR分别为1.92(95％ CI:1.20 ～ 3.10),1.93(95％CI:1.19 ～3.10).结论 B7-H3、B7-H4不同表达水平对胃癌患者PFS和OS有显著影响.     

共刺激分子B7-H3 mRNA和B7-H3蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的研究B7家族的新成员B7-H3mRNA和B7-H3蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法采用荧光实时定量逆转录-多聚酶链反应（RT—PCR）方法检测38例胃癌患者癌组织及其邻近正常组织B7-H3mRNA的表达；免疫组织化学Elivision法检测B7．H3蛋白在胃癌组织中的表达。结果B7-H3mRNA在胃癌组织及其邻近正常组织中均有表达，其在胃癌组织中的表达明显低于邻近正常组织。B7-H3mRNA的表达与胃癌患者性别、年龄、组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分级和浸润深度无关（P〉0.05）。B7-H3蛋白在胃癌组织中表达的阳性率为39、5％，其与患者性别、年龄、组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移和浸润深度也无关（P〉0.05）。B7-H3蛋白表达随肿瘤临床分期的递增而降低，各组间差异有统计学意义（P=0.022）；病理分级各组间差异也有统计学意义（P=0.039）。Kaplan—Meier生存分析显示，B7-H3阳性表达组无病生存期明显优于B7-H3阴性表达组（P=0.009），B7-H3阳性表达组总生存期亦明显优于B7-H3阴性表达组（P=0.010）。结论B7-H3表达与胃癌预后有关，可以作为反映患者免疫状态和预后的一个新的指标．为制定临床治疗方案提供依据。     

协同刺激分子B7-H4影响细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胃癌预后的多因素COX模型分析

目的 探讨协同刺激分子B7-H4的表达与胃癌的关系,并分析B7-H4在胃癌组织中的不同表达水平对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗胃癌患者的复发和死亡的风险.方法 对156例胃癌病例(1998年1月1日至2009年12月31日),采用免疫组织化学染色及IHS评估法确定B7-H4的表达状态,使用回顾性队列研究方法调查每位病例的人口学、临床资料及复发时间和死亡时间.应用COX多因素模型分析B7-H4高表达影响胃癌复发和死亡的风险.结果 胃癌组织B7-H4高表达组与B7-H4低表达组比较,患者中位无瘤生存时间(月)及95%CI分别为16(11.9～20.1)和47(22.4～71.6),中位生存时间(月)及95%CI分别为25(19.0～31.1)和43(35.2～50.8).在化学治疗组中,B7-H4低表达患者的中位生存时间明显高于B7-H4高表达患者(36比16),差异有统计学意义(x2=14.14,P<0.01).在化疗联合CIK治疗组中,B7-H4低表达患者的中位生存时间有高于B7-H4高表达患者的趋势(55比34),但差异无统计学意义(x2=1.78,P>0.05).在化学治疗组中,B7-H4低表达患者中位无瘤生存时间高于B7-H4高表达(33比11),差异有统计学意义(x2=18.956,P<0.01).在化疗联合CIK细胞治疗组中,B7-H4低表达患者中位无瘤生存时间显著高于高表达组(90比18),差异有统计学意义(x2=3.842,P<0.05).在调整了性别、年龄等混杂因素后,与B7-H4低表达比较,B7-H4高表达组病例的复发和死亡风险明显增加(RR=2.30,95%CI=1.41～3.75;RR=1.90,95%CI=1.20～3.01).结论 B7-H4高表达可能是提高胃癌复发和死亡风险的独立危险因素.采用CIK细胞回输治疗可控制和干预B7-H4的表达并延长胃癌患者的中位生存时间,胃癌B7-H4低表达可作为CIK细胞治疗的纳入标准.     

B7-H1在直肠癌与镶嵌血管中的表达及意义

目的 探讨共刺激配体B7-H1在直肠癌和镶嵌血管中的表达及临床意义.方法 应用免疫组织化学方法 观察50例直肠癌患者癌组织和镶嵌血管中的B7-H1表达,探讨B7-H1表达和直肠癌的病理学特征及预后间的关系.结果 随访期13例患者死亡,37例存活患者的中位随访期为3.4年(0～5年);64%的标本显示蛋B7-H1阳性染色,中位染色评分为2.5(0～4);B7-H1阳性表达与临床和病理特征呈逆相关(P＜0.05).15例(30%)的肿瘤患者同时B7-H1和镶嵌血管表达阴性,3例(6%)B7-H1阴性而镶嵌血管阳性,13(26%)B7-H1阳性而镶嵌血管阴性,19例(38%)B7-H1和镶嵌血管同时阳性表达.B7-H1阳性的肿瘤患者较N7-H1阴性的患者更可能镶嵌血管表达阳性(59.3%比11.1%;P＜0.01).双阳性组的生存率明显低于阴性或单阳性组(P＜0.01).21例表达镶嵌血管的直肠癌标本中有8例显示镶嵌血管内的内皮细胞或肿瘤细胞存在B7-H1的表达.结论 在直肠癌及镶嵌血管中阳性表达的B7-H1可作为直肠癌患者的预后标志.B7-H1参与直肠癌及镶嵌血管的免疫逃逸.     

肾透明细胞癌组织中B7-H1的表达及其与预后的关系

目的探讨B7-H1在肾透明细胞癌组织中的表达及其与预后的关系。方法采用免疫组织化学方法检测132例肾透明细胞癌患者术后肿瘤标本中B7-H1的表达,单因素及多因素分析B7-H1的表达与预后的关系。结果 132例患者中,B7-H1阳性46例（34.85%）,其中无瘤生存26例,复发6例,死亡14例,至最后随访期限,疾病无进展生存期（PFS）为（32.29&#177;12.56）个月,总生存期（OS）为（27.08&#177;15.43）个月;阴性86例（65.15%）,其中无瘤生存79例,复发3例,死亡4例,PFS为（38.77&#177;20.00）个月,OS为（37.02&#177;20.00）个月,两者比较差异有统计学意义（P〈0.05）。单因素分析表明,B7-H1阳性表达与肿瘤大小、原发肿瘤分期、区域淋巴结转移、远处转移、临床分期、组织学分级呈显著正相关（均P〈0.05）,而与患者年龄、性别无相关性。多因素分析表明,在控制肿瘤大小、TNM分期、临床分期、组织学分级的影响后,B7-H1阳性表达具有更高的肿瘤特异性死亡率[危险因素（RR）3.918,95%可信区间（95%CI）1.305～11.765,P〈0.05]和复发率[RR4.486,95%CI1.404～14.333,P〈0.05]。结论 B7-H1阳性表达与肾透明细胞癌患者术后死亡率及复发率呈正相关,B7-H1是肾透明细胞癌的一个独立预后因素。     

共刺激分子B7-H1和FasL在膀胱移行细胞癌免疫逃逸中的机制研究及临床意义

目的：探讨共刺激分子B7-H1和FasL在膀胱移行细胞癌免疫逃逸机制中的作用及其临床意义。方法：应用免疫组织化学方法检测50例膀胱移行细胞癌及10例正常膀胱组织中B7-H1和FasL的表达．并用计算机图象分析系统对其表达水平进行定量分析。结果：正常膀胱组织中B7-H1和FasL。均不表达;50例膀胱移行细胞癌中．B7-H1和FasL的阳性表达率分别为72％和70％。B7-H1的表达水平与膀胱移行细胞癌的病理分级、临床分期及复发密切相关（P〈0．05）：FasL的表达水平与膀胱移行细胞癌的病理分级、I晦床分期密切相关（P〈0．05）．但与复发无关。B7H1的表达水平与FasL的表达水平呈正相关（r=0．798,P=0．000）。结论：B7-H1和FasL与膀胱移行细胞癌的发生发展密切相关．在膀胱移行细胞癌免疫逃逸中发挥了重要作用。联合检测B7-H1和FasL可以作为了解膀胱移行细胞癌乍物学行为的参考指标,干预B7-H1及FasL信号将有望成为膀胱移行细胞癌免疫治疗的新策略。