脱细胞软骨支架材料的制备及物理性质

目的 探讨脱细胞软骨生物支架材料(ACM)的制作方法,使其在孔隙率、比表面积、弹性模量等物理性质更加接近天然软骨.方法 猪膝关节软骨冻干加工为粉末,0.25%胰酶消化,1%曲拉通洗脱,蒸馏水洗净冻干,8 W 312 nm紫外线照射(UVI)后成型;扫描电镜观察孔径分布,压汞仪测定孔隙率等参数;INSTRON 5544对ACM进行抗雎弹性模量测定.结果 脱细胞生物支架材料为白色,略微发黄,外表呈多孔疏松网状结构,脆性大并有一定弹性;ACM孔隙率为68.54%,平均孔径为47.13 μm;ACM弹性模量为(1.05±0.38)MPa.结论 ACM在孔隙率、比表面积、平均孔径等方面符合关节软骨支架材料的要求.     

脱细胞软骨支架材料修复兔关节软骨缺损

目的 观察异种异体脱细胞软骨支架材料(ACM)复合同种异体兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果.方法 (1)密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSCs,选择第3代BMSCs作为种子细胞;(2)利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;(3)3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4 mm,深3 mm砌关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,Ⅰ ACM-BMSCs组:第3代BMSCs 1×106个/ml与ACM于37℃5%CO2饱和湿度复合48 h;Ⅱ ACM组;Ⅲ空白对照组.(4)移植6、12周后大体及组织学观察,免疫组织化学染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果.结果 (1)大体观察及组织学观察:6和12周Ⅰ组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨.Ⅱ组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞.Ⅲ组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;(2)Wakitani组织学评分可见在不同的时间段I组和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组间组织学评分差异无统计学意义(P>0.05).(3)免疫组织化学:ACM-BMSCs组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性.结论 以ACM为支架材料,同种异体BMSCs为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织.     

软骨脱细胞基质仿生支架体外构建组织工程软骨

目的探索软骨脱细胞基质(ACM)仿生支架体外构建组织工程软骨的可行性。方法将软骨组织彻底粉碎后脱细胞处理,复合一定比例的明胶(GT)制备三维多孔支架。分析比较不同ACM/GT比例多孔支架的孔径、孔隙率、生物力学和降解速率,选取最适宜软骨体外再生的一组多孔支架用于体外构建。获取、培养猪关节软骨细胞,接种于ACM多孔支架上,体外培养8周后,行大体观察及组织学检测。结果 ACM多孔支架孔隙分布均匀,随ACM含量的增加,孔径和孔隙率逐渐增大,力学强度逐渐降低,其中,ACM:GT=5:5组在孔径和孔隙率方面均适宜体外软骨再生。大体观察和组织学检测显示,ACM支架可体外再生均质、典型的软骨组织。结论 ACM可制成适宜软骨再生的三维多孔支架,并可体外构建组织工程软骨。     

软骨脱细胞基质支架材料的软骨组织工程实验研究

目的应用软骨脱细胞基质作为支架材料，按照组织工程的原理再生软骨，为修复软骨缺损探索新的途径。方法取新西兰大耳白兔1只，体重2．4kg，按改良Courtman法对兔耳软骨行脱细胞处理后用于实验。选用纯种6月龄新西兰大耳白兔18只，雌雄不限，体重2．4～2．6kg。每只耳形成2处1cm&#215;1cm软骨缺损，按修复方式不同随机分为3组，每组24处缺损。A组，软骨脱细胞基质加软骨膜；B组，软骨脱细胞基质；C组软骨膜，作为对照。术后每日观察兔耳修复区的大体变化，并分别于4、12周每组处死3只动物，于修复区切取标本，行HE染色、藏红花红一奥尔新蓝染色、II型胶原基因探针原位杂交实验。结果术后4周内A、B组大体形态无明显改变；术后12周可见修复区轻度增厚，触摸时质地较正常软骨稍硬。C组术后2周，2只2处修复区形成痂皮，术后5周痂皮脱落形成穿孔。术后4周，A、B组HE染色可见软骨脱细胞基质周边有轻度的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，未形成包囊，藏红花红．奥尔新蓝染色均阴性；C组软骨缺损处的软骨膜塌陷，无细胞增殖现象；各组修复区均未见II型胶原基因探针原位杂交显色。术后12周，A组HE染色示部分软骨脱细胞基质内有新生细胞，细胞排列不规律，ECM嗜碱性增强，藏红花红-奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色示新生细胞内均有大片棕黄色阳性染色区域；B组HE染色示软骨脱细胞基质无吸收现象，周边无包囊，炎性细胞消失，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阴性，未见II型胶原基因原位杂交显色；C组HE染色示近软骨断端处可见部分形成新生组织，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色可见棕黄色阳性染色细胞。结论脱细胞软骨可诱导软骨膜细胞向其中生长而重建软骨，软骨膜和脱细胞软骨复合移植是软骨组织工程的另一种选择。     

脱细胞骨软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞修复羊骨软骨缺损的研究

目的探讨脱细胞骨软骨支架接种自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复羊骨软骨缺损效果,探索骨软骨缺损新的修复方式。方法制备直径为8mm骨软骨脱细胞支架,培养羊BMSCs,接种于骨软骨支架,制备羊负重区骨软骨缺损模型,分空白、空白支架及细胞支架复合物3组,每组4只羊,3个月后处死动物取标本行大体及组织学检测。结果修复羊负重区骨软骨缺损模型实验结果显示细胞支架复合修复组骨软骨有较好修复,空白支架组软骨下骨基本修复、软骨侧无明显修复,空白对照组未见明显修复,缺损边缘软骨退变。结论含骨软骨连接结构的脱细胞骨软骨支架接种种子细胞能较好的修复羊负重区骨软骨缺损。     

异种关节软骨脱细胞基质支架的免疫反应研究

[目的]观察异种脱细胞软骨基质支架的免疫排斥反应,探讨其用于组织工程软骨支架的可行性。[方法]分别获取猪和新西兰大白兔的关节软骨,制作成:①猪脱细胞软骨支架;②猪未脱细胞软骨支架;③兔脱细胞软骨支架。将9只新西兰大白兔随机分成三组,分别在兔背部深筋膜与肌膜之间埋入:①异种(猪)脱细胞软骨支架;②异种(猪)未脱细胞软骨支架;③同种(兔)异体的脱细胞软骨支架,术后分组饲养。于术后1、2、4周分别取支架埋藏部位组织,进行普通病理观察及CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫组织化学检测,并在术前和术后1周,2周,4周抽取外周血,分离检测血清中对支架产生的抗体的浓度(ELISA法)。[结果]所有新西兰大白兔无不良反应,细胞免疫显示异种(猪)和同种(兔)的脱细胞软骨支架及周围埋藏部位组织无明显淋巴细胞浸润,而异种未脱细胞组支架在埋入第4周时有明显淋巴细胞浸润,体液免疫显示术前后抗体浓度无明显差异(P0.05)。[结论]猪来源的脱细胞软骨支架用于异种移植时无免疫反应,从免疫学方面为异种脱细胞软骨支架的临床应用提供了可行性。     

软骨组织工程用细胞支架生物材料的研究进展

骨关节炎、类风湿性关节炎等疾病一直困扰着人类的健康,当关节软骨全层损伤后,软骨的修复能力十分有限,软骨下骨髓可产生纤维软骨样修复,但这种修复产生的软骨细胞无论是形态还是功能特性与正常软骨相差甚远[1].临床证明,自体骨移植是治疗骨缺损的最好方法,但其取骨来源有限,供骨区会出现失血过多、伤口难愈合等并发症;异体骨取材简便,但存在免疫排斥和疾病传播等问题,其应用受到很大限制.发展安全、有效和实用性强的细胞支架生物材料越来越引起了广泛的关注,寻求对有机体组织进行修复、替代与再生,具有类似功能作用的人工支架材料成为目前生物医学工程研究的重要课题.     

脱细胞脊髓基质支架的研究进展

应用组织工程学技术进行脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的修复已成为神经医学领域内的研究热点.支架构建作为组织工程学研究的基本要素,在进行组织水平的脊髓重构研究中具有极其重要的意义.如何构建符合脊髓组织解剖和生理需要的组织工程脊髓支架,学者们进行了广泛探索.     

软骨脱细胞基质的研制及其力学性质分析

目的　猪CACM的制作及其力学特征的检测。方法　切取猪耳软骨 ,采取TritonX - 10 0、Tris -HCl液等 4步法制取脱细胞的猪耳CACM。采用光镜、透射电镜、扫描电镜等对结构进行检测 ,同时对CACM进行力学检测。结果　肉眼观察 ,CACM与软骨除颜色略白外无差别。组织学HE染色 ,细胞陷窝已无细胞结构 ,阿尔新兰染色呈淡染 ,阴性 ;透射电镜下CACM软骨陷窝内已无细胞结构 ,细胞膜、核器均已溶解 ;扫描电镜下CACM基质纤维成分与正常软骨基质的胶原纤维在形态上无差异 ;力学试验 ,最大拉伸强度 ,最大拉伸比 ,猪耳软骨与其脱细胞基质比较及其弹性模量无统计学意义。结论　经TritonX - 10 0为主的脱细胞处理方法可以脱去软骨的细胞成分 ,不改变软骨细胞基质的主要成分 ,不改变其原有力学性质     

软骨微粒脱细胞基质和纤维蛋白凝胶支架皮下构建组织工程软骨

目的观察皮下植入异体软骨细胞复合异种软骨微粒脱细胞基质(Cartilage microparticle acellular matrix,CMACM)和纤维蛋白胶(Fibrin glue,FG)为支架形成组织工程软骨的可能性。方法制备猪耳廓CMACM,体外培养成年兔的耳软骨细胞,将不同的混合物植人5只成年兔背部皮下。A组:异体软骨细胞复合CMACM和FG;B组:自体软骨细胞复合CMACM和FG;C组:CMACM和FG。将每只兔子背部皮肤均分为6个区,分别植入不同混合物各两个点,以备两次取材。观察并记录皮下植入体的形态变化,分别于植入后8周和12周取材,行组织学检测。结果A组和C组未能形成软骨样组织。B组8周可以形成软骨样组织,周围炎症细胞数量较多;12周时形成的软骨组织成分单一,周围没有炎症反应,类似于正常软骨,且新生的软骨组织中均长有许多小血管,新生软骨的厚度不超过1 mm。结论将同种异体软骨细胞复合CMACM和FG植入皮下,不能形成软骨样组织:而以自体软骨细胞为种子细胞则可以得到软骨样组织,但新生软骨的体积和厚度有限,并且新生的软骨组织中长有许多小血管,可能更有利于新生软骨组织的长期存活。     

软骨脱细胞基质的研制及其力学性质分析

目的猪CACM的制作及其力学特征的检测.方法切取猪耳软骨,采取Triton X-100、 Tris-HCl液等4步法制取脱细胞的猪耳CACM.采用光镜、透射电镜、扫描电镜等对结构进行检测,同时对CACM进行力学检测.结果肉眼观察,CACM与软骨除颜色略白外无差别.组织学HE染色,细胞陷窝已无细胞结构,阿尔新兰染色呈淡染,阴性;透射电镜下CACM软骨陷窝内已无细胞结构,细胞膜、核器均已溶解;扫描电镜下CACM基质纤维成分与正常软骨基质的胶原纤维在形态上无差异;力学试验,最大拉伸强度,最大拉伸比,猪耳软骨与其脱细胞基质比较及其弹性模量无统计学意义.结论经Triton X-100为主的脱细胞处理方法可以脱去软骨的细胞成分,不改变软骨细胞基质的主要成分,不改变其原有力学性质.     

软骨脱细胞基质的研制及其力学性质分析

目的 猪CACM的制作及其力学特征的检测。方法 切取猪软骨，采取TritonX－100、Teis-HCl液等4步法制取脱细胞的猪耳CACM。采用光镜、透射电镜、扫描电镜等对结构进行检测，同时对CACM进行力学检测。结果 肉眼观察，CACM与软骨除颜色略白外无差别。组织学HE染色，细胞隐窝已无细胞结构，阿尔新兰色呈淡染，阴性；透射电镜下CACM罗骨陷窝内已无细胞结构；细胞膜、核器均已溶解；扫描电镜下CACM基质纤维成分与正常软骨基质的胶原纤维在形态上无差异；力学试验，最大拉伸强度，最大拉伸比，猪耳软骨与其脱细胞基质比较及其弹性模量无统计学意义。结论 经TritonX-100为主的脱细胞处理方法可以脱去软骨的细胞成分，不改变软骨细胞基质的主要成分，不改变其原有力学性质。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

微粒软骨脱细胞基质复合纤维蛋白凝胶构建软骨组织工程支架材料的研究

目的：应用异体微粒软骨脱细胞基质与纤维蛋白凝胶结合作为可注射性支架材料，进行体内构建良好可塑性和生物特性的组织工程化软骨。方法：制备普通家猪耳廓软骨微粒脱细胞基质，与体外扩增的小型实验猪第二代软骨细胞结合，以纤维蛋白凝胶为支架材料，利用其可注射性回植于实验猪自体腹壁外侧皮下，8周后取财进行大体及组织学检测，并与不合微粒脱细胞软骨基质实验组相比较。结果：培养出的组织工程化软骨组织细胞生长良好，具有分泌软骨基质功能，含微粒脱细胞软骨基质实验组表现出更佳的生物学性能。结论：将异体微粒软骨脱细胞基质与纤维蛋白凝胶结合，可以作为良好的可注射性复合支架材料应用于组织工程化软骨的构建。     

脱矿脱细胞骨基质环细胞支架的物理化学性能研究

目的 探讨脱矿脱细胞骨基质环物理化学性能是否适合用于构建组织工程椎间盘纤维环细胞支架.方法 取兔股骨近端骨制成环状,经脱矿脱细胞处理并对材料的外形、组织结构、孔隙率、吸水力、平均孔径、体外生物降解性能等支架性能指标进行检测.结果 该材料为环状,质地柔韧,多孔结构;HE染色光镜观察显示支架材料为嗜酸性,为不均匀的多孔结构:扫描电镜观察发现支架材料为相互沟通的多孔结构,支架材料的平均孔径为(246±113)μm.平均孔隙率为(77.8±2.8)%.吸水力平均为(72.5±5.9)%.支架材料与松质骨体外生物降解率无明显差异(P>0.05).支架材料最大载荷为(0.61±0.28)N,与正常椎间盘比较P<0.05,有显著差异.可拉伸长度为(17.2±2.3)%,与正常椎间盘纤维环比较P>0.05,差异不显著.结论 脱矿脱细胞骨基质环的物理化学性能适合作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架材料.     

软骨脱细胞基质仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞成软骨分化的影响

目的探讨软骨脱细胞基质(ACM)仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。方法将软骨组织粉碎后脱细胞处理,并以不同的比例与明胶(GT)溶液混合并交联,冷冻干燥制成多孔仿生支架。用扫描电镜(SEM)观察不同交联比例制成的ACM/GT支架,并对其孔径、孔隙率、生物力学、降解速率进行评估,从而选取最优组用于体外软骨构建。分离并培养山羊BMSCs,接种于单纯GT和ACM/GT支架上,SEM观察培养1、7、14 d后细胞在支架上的黏附、分布与基质分泌情况,并通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)评估成软骨分化能力。结果制备的ACM无细胞残留。随着ACM占比增加,孔径逐渐增大,降解速率逐渐增快,力学强度逐渐降低。其中G2A2组在孔径、孔隙率、生物力学和降解速率方面均适宜体外构建软骨组织。SEM显示细胞在单纯GT和G2A2支架上均匀分布,增殖显著,基质分泌明显。qRT-PCR显示G2A2显著促进了BMSCs的成软骨分化。结论ACM可以制备成适宜软骨再生的支架材料,并可促进BMSCs的成软骨分化。     

大鼠脱细胞异体脊髓支架的免疫原性研究

[目的]评价脱细胞脊髓支架的免疫原性,为其在组织工程中的应用奠定理论基础。[方法]将脱细胞脊髓(冻融 3%脱氧胆酸钠 DNase,RNase消化)及新鲜大鼠脊髓分别植入SD大鼠椎旁肌内,于术后1～4周分别取材进行组织学观察,通过HE染色评价炎症反应程度;应用免疫组织化学方法观察移植物及周围组织中的CD3、CD4和CD8阳性T细胞浸润程度,评价免疫排斥反应强度。[结果]组织学观察显示术后均引起周围组织炎症反应,脱细胞组术后1周可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润,但2周后只有少量淋巴细胞浸润;新鲜异体脊髓移植组术后1周可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,术后4周仍有大量淋巴细胞浸润;与新鲜异体脊髓移植比较,化学去细胞异体脊髓植入后免疫原性明显降低,但仍有轻度细胞介导的免疫反应存在。[结论]移植经化学去细胞处理的异体脊髓后,仅引起轻微的炎症反应和免疫排斥反应,具有良好的组织相容性,并有可能成为良好的脊髓组织工程替代材料。     

骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

以软骨细胞外基质与脱细胞骨基质构建组织工程骨软骨双层支架及其性能的研究

目的 探讨采用软骨细胞外基质(CECM)与脱细胞骨基质(ACBM)为材料制作新型组织工程骨软骨双层支架的可行性,并检测其性能.方法 双层支架的骨部分以犬松质骨制备的ACBM为原料,软骨部分以人CECM为材料,采用冷冻冻干法制备CECM/ACBM双层支架并交联.测定支架孔隙率,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析支架浸提液毒性.分离培养犬骨髓基质干细胞(BMSCs),成软骨诱导后种植到支架上,倒置显微镜、电镜、Dead/Live荧光染色观察细胞在支架的生长、分化情况.结果 扫描电镜及Micro-CT观察显示支架内孔洞相互贯通呈海绵状,CECM部分孔径(155±34)μm,孔隙率为91.3%±2.0%;ACBM部分具有大然骨的孔径和空隙率,骨软骨部分结合良好.培养1～6 d不同浓度支架浸提液与对照培养液吸光度值比较羌异均无统计学意义(P＞0.05).倒置显微镜、电镜检查结果表明BMSCs在支架上黏附良好,细胞基质分泌增加,Dead/Live荧光染色表明双层支架内细胞均呈绿色.结论 CECM/ACBM骨软骨双层支架具备良好的孔径和孔隙率,骨、软骨两层间结合良好,无毒,生物相容性良好,可作为支架载体用于组织工程骨软骨复合体的构建.

Abstract：

Objective To fabricate a novel bilayered scaffold constructed with cartilage extracellular matrix (CECM) and acellular bone matrix (ACBM) for osteochondral tissue engineering.Methods The bone layer of the osteochondral scaffold was prepared using canine bone cancellous bone columns, and the cartilage layer was fabricated using CECM.After CECM microfilaments were decellularized, the biphasic scaffolds were fabricated by soaking the ACBM columns into cylindrical silicon moulds with a 30 g/L CECM suspension using simple freeze-drying method.After the scaffolds were cross-linked, the porosity was measureed.MTT test was also done to assess cytotoxicity of the scaffolds.Canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) were induced by chondrogenic medium and seeded into novel scaffold.Cell proliferation and differentiation were analyzed using inverted microscopy, scanning electron microscopy (SEM)and Dead/Live staining method.Results SEM and Micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure, with the CECM pore diameter of 155 ± 34 μm and the porosity of 91.3% ± 2.0%.Cytotoxicity testing with MTT revealed no significant difference in absorbance among different extracts, showing no cytotoxic effect of the scaffold on BMSCs.Inverted microscopy and SEM showed that the novel scaffold could provide a suitable 3-D environment to support the adhesion, proliferation and differentiation of BMSCs to chondroeytes in culture with chondrogenic medium.Confocal microscopy of cell-scaffold constructs revealed cells with green fluorescence.Conclusion Since the novel CECM/ACBM bilayered integrated osteochondral scaffold has good mircostructure, non-toxicity and good biocompatibility, it may be a suitable candidate as an alternative cell-carrier for osteochondral tissue engineering.     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。