利用母血胎儿游离DNA检测胎儿遗传信息的应用进展

目前临床广泛开展的产前诊断技术主要是侵入性产前诊断技术,包括妊娠早期(7～11周)绒毛活检技术、妊娠早中期胚胎(胎儿)镜检查技术、妊娠中期羊膜腔穿刺取样技术、妊娠中晚期脐静脉穿刺胎血取样技术等,因其创伤性、有一定的流产风险使得有创产前诊断的普及率不高.目前,利用孕妇外周血中胎儿细胞或胎儿DNA开展产前诊断已成为非侵入性产前诊断临床探索的新方向.然而,由于参与母体血循环的胎儿细胞数量极少、母血胎儿有核红细胞含量随孕周变化差异巨大,且分离、提纯、富集胎儿有核红细胞技术复杂、价格昂贵,导致利用母血胎儿细胞检测胎儿遗传信息发展缓慢[1].     

利用胎儿血红蛋白表型分选、检测母血中胎儿有核红细胞

目的:建立高纯度、高得率、高特异性的分选技术,富集纯化母血中胎儿有核红细胞(FNRBC)。方法:70例孕妇外周血,经密度梯度离心初步富集后行血红蛋白γ链免疫组化染色,以显微操作术挑取阳性细胞。采用单细胞PEP-PCR技术检测SRY基因,并进行荧光原位杂交分析。结果:胎儿NRBC具有鲜明的形态学、免疫学特征。每例母血FNRBC数5~27个,平均0.82±0.37/m l。PEP-PCR检测的灵敏度、特异度分别为95.35%、100%。4例FISH结果均与实际核型相符。结论:以γ-血红蛋白为分选标志,结合显微操作技术,可以有效地获取高纯度、高浓度研究模板,保证后继分析的准确性,为无创性产前诊断发展奠定基础。     

母血中分离检测胎儿细胞的研究进展

进入母体血循环的胎儿细胞有4种.使用有效的方法从正常与异常妊娠母血中分离富集极少量的胎儿有核红细胞、滋养细胞、淋巴细胞和粒细胞.目前国外采用较多的有荧光激活细胞分选法、磁活化细胞分选法、免疫磁珠分离法、密度梯度离心法.分子生物学方法的引入.特别是聚合酶链反应及其衍生技术和荧光原位杂交技术提供了从母血中检测胎儿细胞敏感的方法并在无创伤性产前诊断方面得到一定的应用.     

母血中胎儿DNA与子痫前期关系的研究

目的:探讨孕妇外周血中胎儿DNA的浓度水平与子痫前期之间的关系。方法:留取第一次常规产前检查的472例孕妇的外周血并随访。设置阴性对照后,采用实时PCR方法定量检测怀男性单胎并发展为子痫前期的17例孕妇及34例怀男性单胎正常孕妇的血浆胎儿DNA的SRY基因浓度。结果:发展为子痫前期患者的外周血浆胎儿DNA浓度明显高于正常孕妇,中位数分别为165.41copies/ml和48.75copies/ml,有显著的统计学差异(P<0.001)。结论:发展为子痫前期患者外周血中的胎儿DNA明显增高,而浓度水平与子痫前期的严重程度似乎无关。     

PCR法改良检测母血中胎儿细胞

检测母血中的胎儿细胞的可能性是获取胎儿细胞进行分析的另一种手段,这对胎儿几无影响,尤其能证明这种方法的是在母血中找到来源于男胎的Y染色体携带细胞。作者成功地用根据DYZI部分序列设计的引物,非常准确地识别了母血中Y染色体     

胎儿畸形与母、胎血锌的关系

战争及灾荒年后流行先天性畸形病,尤多发生在中枢神经系统已有报导.最近也提出了食品不足可致人胎先天畸形的论据.动物孕期,锌的少量缺乏可使其子代发生神经管缺陷.Jameson(1976)报导8名畸胎产母的血锌明显低于对照组.本文对产母及胎儿血浆锌浓度与先天畸形的关系进行了研究.作者用Pye-Unicam SP90A分光光度计,测定74例病人的血浆锌:1组18名在过去24月内分娩过畸胎者;2组36名在过去24时内分娩过畸胎者;3组20名畸胎于产时取脐带血.对照组各为18及37名     

母血中胎儿DNA预测前置胎盘合并粘连的探讨

目的:通过实时荧光定量PCR方法测定孕妇外周血中胎儿DNA量,初步探讨前置胎盘合并胎盘粘连孕妇外周血中胎儿DNA量与正常对照组有无统计学差异;母血中胎儿DNA定量能否预测前置胎盘合并胎盘粘连。方法:收集35例孕28~34周且胎儿为男性,经我院B超诊断为前置胎盘的单胎孕妇作为研究组,其中合并胎盘粘连8例经手术确诊,称为前置胎盘粘连组,未合并胎盘粘连27例称为前置胎盘未粘连组。收集30例孕28~34周,且胎儿为男性,正常单胎妊娠孕妇作为对照组,通过实时荧光定量PCR方法测定3组孕妇外周血中胎儿DNA量,比较3组结果的异同。结果:前置胎盘粘连组孕妇外周血中胎儿DNA量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。前置胎盘未粘连组孕妇外周血中胎儿DNA量与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。前置胎盘粘连组孕妇外周血中胎儿DNA量高于未合并胎盘粘连组,差异有统计学意义(P<0.05)。孕妇外周血中胎儿DNA量与前置胎盘类型无关,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:孕妇外周血中胎儿DNA量与胎盘粘连与否有关,即与胎盘组织的功能状态有关。因此测定孕妇外周血中胎儿DNA量可能有助于预测前置胎盘合并胎盘粘连。     

子宫颈癌组织中抑癌基因DNA甲基化的检测

目的 通过分析宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈癌组织中p16、CDH1、RASSF1A和TIMP3基因DNA甲基化的变化情况,探讨其在宫颈癌发生中的意义。方法 用甲基化特异性聚合酶链反应技术（MSP）对CINI组（40份）、CINⅡ～Ⅲ（40份）、宫颈癌组（40份）病变组织中p16、CDH1、RASSF1A和TIMP3基因DNA甲基化程度进行检测。另取正常宫颈组织20份作为对照组。结果（1）对照组中p16、CDH1、RASSF1A和TIMP3基因的DNA甲基化阳性率均为0。（2）p16和CDH1基因的DNA甲基化阳性率,CIN11～m组（分别为22％、35％）明显高于CINI组（分别为2％、5％,P〈0．05）;RASSF1A和TIMP3基因的DNA甲基化阳性率,CINⅡ～Ⅲ组（分别为12％、15％）虽高于CINI组（均为2％）,但差异无统计学意义（P〉0．05）。（3）宫颈癌组p16（40％）、CDH1（58％）、RASSF1A（20％）和TIMP3（35％）基因的DNA甲基化阳性率虽均高于CINⅡ-Ⅲ组,但差异无统计学意义（P〉0．05）。（4）宫颈癌组p16、CDH1、RASSF1A和TIMP3基因的DNA甲基化阳性率均高于CINI组,差异有统计学意义（P〈0．05）。（5）上述基因的DNA甲基化的总阳性率（即任何一个基因出现甲基化即为阳性）,宫颈癌组（90％）明显高于CINⅡ～Ⅲ组（55％,P〈0．05）,且此两组均明显高于CINI组（8％,P〈0．05）。结论 随着从宫颈不典型增生向浸润癌的进展,p16、CDH1、RASSF1 A和,TIMP3基因的DNA甲基化阳性率明显升高,提示抑癌基因的DNA甲基化在宫颈癌发生、发展中起着一定作用,可能成为判断宫颈癌发生、发展的重要指标。     

检测母血中胎儿mRNA确定胎儿RhD血型行非侵入性产前诊断

实验证实利用母血内胎儿mRNA的RT-PCR检测胎儿RhD血型比用gDNA的PCR检测法更加敏感。选择35例RhD阴性妇女外周血有核红细胞,分为3组,各收集静脉血20ml。孕6～12周者于终止妊娠前取血,同时收集胎盘滋养细胞。孕13～23周者羊膜腔穿刺术收集羊水,于穿刺术前抽     

母血中胎儿游离核酸检测在诊断胎儿非整倍体中的应用

胎儿染色体非整倍体是常见且严重的染色体异常类出生缺陷。目前常用的侵入性检查方式因存在诸多弊端而被部分孕妇拒绝。在过去的15年中,母体血浆中胎儿游离核酸的研究进展使得无创性产前诊断胎儿非整倍体成为可能。而最近胎儿与母体表观遗传学差异及胎儿特异性RNA的发现使得这项技术摆脱了胎儿性别的限制。随着数字PCR及大规模平行测序等新技术的运用,胎儿非整倍体检测的敏感性和特异性得到了提高。本文综述了无创性产前诊断胎儿非整倍体的研究进展,并讨论了其临床应用的可行性。     

母血中胎儿有核红细胞数量与胎儿异常的关系

目的 :探讨母血中胎儿有核红细胞数量与胎儿异常的关系 ,为将它用于无创性产前诊断提供实验依据。方法 :对孕 6～ 40周的 86例妇女 (包括胎儿正常组 68例、胎儿异常组 1 8例 )的外周血进行单密度梯度离心、瑞氏染色和细胞计数 ,分析母血中胎儿有核红细胞数量与孕周、胎儿异常及胎儿性别的关系。结果 :胎儿正常组 ,母血中胎儿有核红细胞平均数量为 1 4.2 3±1 2 .0 1 /ml,与妊娠周数呈直线相关 (R >R0 .0 5)。胎儿异常组中 ,母血中胎儿有核红细胞平均数量较正常胎儿组显著增加 ,约为 3 8.73± 2 4.97/ml,且与妊娠周数无明显直线相关性。母体外周血中胎儿有核红细胞数量与胎儿性别无统计学相关性。结论 :胎儿发生异常时母血中胎儿有核红细胞数量较正常妊娠时增加。母血中胎儿有核红细胞数量在胎儿正常时随孕周而增加 ,且不受胎儿性别的影响。母血中胎儿有核红细胞计数可以辅助用于产前筛查胎儿异常的发生。     

母血中单个胎儿有核红细胞基因分析诊断巨细胞病毒宫内感染

目的:探讨利用母血中单个胎儿有核红细胞的基因分析产前诊断巨细胞病毒(HCMV)宫内感染的科学性和可行性。方法:从273例母体血标本中分离出单个胎儿有核红细胞,用引物延伸预扩增方法对其基因组预扩增,再用PCR方法检测HCMV-DNA。结果:41例证实为HCMV-DNA阳性标本中该产前诊断方法检测出39例,该方法对232例HCMV-DNA阴性标本诊断均为阴性。该方法的敏感性为95.12％,特异性为100％,符合率为99.27％。结论:该无创性产前诊断方法具有较好的科学性和可行性,是适合临床应用的较好方法。     

运用O型血孕妇血浆中游离胎儿DNA检测胎儿ABO血型

目的:探讨利用O型血孕妇血浆中游离胎儿DNA检测胎儿ABO血型的可行性。方法:用酚/氯仿法从39例O型血孕妇(孕36~40+3周)且孕男性胎儿的血浆中提取胎儿DNA,巢式PCR扩增血浆中的SRY基因证实胎儿DNA存在,再用特异性序列-聚合酶链反应(SSP-PCR)检测胎儿ABO血型。用常规血清学方法测母体及新生儿血型。结果:10例孕A型血胎儿的孕妇血浆中扩增出A基因8例,6例孕B型血胎儿的孕妇血浆中扩增出B基因6例,23例孕O型血胎儿扩增出O基因而无A或B基因21例,准确性和敏感性分别为89.7%(35/39)和87.5%(14/16)。结论:利用孕妇外周血中游离胎儿DNA检测胎儿ABO血型可行,对诊断和预防新生儿ABO血型不合性溶血病的发生具有积极意义。     

产时胎儿手术的母胎结局

正出生缺陷儿围生儿死亡率、病率高,严重影响其生活质量,并给社会及家庭带来巨大负担,及时矫正可改善其预后。产时胎儿手术(intrapartum fetal operation,IFO)对改善其预后起到了重要作用。IFO广义概念包括胎盘支持的产时胎儿手术(operation on placental support,OOPS),即维持胎儿胎盘循环状态下进行胎儿疾病的矫治手术;子宫外产时处理(ex utero intrapartum treatment,EXIT),即维持胎儿胎盘循环状态     

母血中胎源性RASSF1A基因的检测及其在子痫前期中的临床意义

目的:初步探讨孕妇血浆中胎源性Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)基因的动力学特点及其在子痫前期中的含量变化。方法:应用2种甲基化敏感的限制性内切酶HinP1I和HhaI去除孕妇血浆中非甲基化的RASSF1A序列,保留超甲基化RASSF1A序列。通过含目的基因的质粒标准品绘制标准曲线,结合荧光定量PCR(FQ-PCR)技术测定血浆中酶切后RASSF1A基因的含量,反映游离胎儿DNA水平。同时检测β-actin基因确保酶对非甲基化序列的完全消化。结果:①最早可在妊娠7+3周检测出孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因;②孕妇血浆中超甲基化RASSF1A基因的含量随妊娠的进程逐渐增加,且在分娩后24 h内消失;③未妊娠组中均未检测到超甲基化的RASSF1A基因;④妊娠晚期子痫前期组超甲基化RASSF1A基因含量为正常同期妊娠组的3.52倍。结论:孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因可以作为胎儿表观遗传学标志物,其水平的异常变化或能提示子痫前期-子痫的发生。     

母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展

发现母血浆及血清中胎儿游离DNA，为无创性产前诊断技术开辟新途径。利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在。用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYSl4)，确定性别敏感性60％～100％。利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度，妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA，随妊娠周增加胎儿DNA量也增高。另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿，母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段。     

母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展

发现母血浆及血清中胎儿游离DNA,为无创性产前诊断技术开辟新途径.利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在.用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYS14),确定性别敏感性60%～100%.利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度,妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA,随妊娠周增加胎儿DNA量也增高.另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿,母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段.     

测量AFP和胎儿红细胞水平以检测胎-母出血

已有人报告妊娠终止和羊膜穿刺后,胎-母出血(FMH)可能引起母血甲胎蛋白(AFP)上升。阴道分娩期经常发生经胎盘的 FMH。作者用敏感的AFP 试验测量分娩前、后母血 AFP 变化,以检测FMH,并将这些资料和用 bmc 试剂装置的酸洗提技术检测的胎儿红细胞变化相比。71例在作者医院单胎足月自然分娩或引产的病人参加本研究。分娩时平均孕龄39.7周。分娩前、后用 bmc 试剂设备进行酸洗提技术检查 FMH,同时测量41例 AFP 浓度。分娩前取母静脉血,分娩后尽快收集第二次血标本。根据化验中变化的系数     

孕妇外周血中胎儿细胞及胎儿DNA的检测

目的　建立从孕妇外周血中分离有核红细胞 (NRBC)及DNA的可靠方法 ,并鉴定其来源。方法　对88例孕妇外周血分别通过密度梯度离心法 ,流式细胞术 (FCM )和荧光激活细胞分离技术 (FACS)分离NRBCs。应用套式PCR技术对 6 5例孕妇血浆DNA进行正常男性SRY基因检测。结果　①NRBCs:2 7例样品经密度梯度离心 ,其中 14例分选到 1～ 10个NRBCs。FACS技术对 6 1例样品进行转铁蛋白受体阳性细胞 (CD71+ )分选 ,所有样品均有CD71+ 细胞 ,其浓度为 (0 35± 0 2 5 )× 10 -2 。②胎儿DNA :4 6例怀男胎孕妇血浆DNA中SRY基因检测出率为 6 5 2 2 % (30 / 4 6 ) ,怀女胎的 19例样品SRY基因未检出率为 94 74 % (18/ 19)。结论　从孕妇外周血中分选胎儿NRBCs和血浆中胎儿DNA的方法已取得较大进展。利用母血中胎儿细胞及DNA诊断遗传性疾病可望成为最佳非创伤性产前诊断技术     

多普勒超声技术用于诊治5例母胎间输血所致胎儿贫血

目的 探讨多普勒超声技术用于诊治母胎间输血（FMH） 所致胎儿贫血的临床应用价值.方法 2002-08-2005-05暨南大学附属第一医院收治5例由孕妇主诉胎动减少或消失、怀疑FMH的病例, 孕周29～35周, 立即记录其胎心监护（CTG）图形, 分别在脐带穿刺或输血前后记录大脑中动脉收缩期血流峰值（MCA-PSV）和脐静脉最大血流速（UVmax）及大脑中动脉和脐动脉血流阻力指数（PI）, 胎儿血红蛋白（FHb） 和红细胞容积（HCT）也由脐带穿刺或输血前后获得.结果 所有病例CTG图形均表现为正弦曲线图形,所有病例MCA-PSV和 UVmax均明显升高,而FHb、HCT则降低,但PI正常.5例中例4为抢救胎儿生命进行了即刻宫内输血.FMH通过Kleihauer Test最后诊断.5例均即刻终止妊娠,胎儿预后均较好.结论 多普勒超声测量MCA-PSV、UVmax是及时诊治FMH所致急性胎儿贫血的最重要方法.