母血中胎源性RASSF1A基因的检测及其在子痫前期中的临床意义

目的:初步探讨孕妇血浆中胎源性Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)基因的动力学特点及其在子痫前期中的含量变化。方法:应用2种甲基化敏感的限制性内切酶HinP1I和HhaI去除孕妇血浆中非甲基化的RASSF1A序列,保留超甲基化RASSF1A序列。通过含目的基因的质粒标准品绘制标准曲线,结合荧光定量PCR(FQ-PCR)技术测定血浆中酶切后RASSF1A基因的含量,反映游离胎儿DNA水平。同时检测β-actin基因确保酶对非甲基化序列的完全消化。结果:①最早可在妊娠7+3周检测出孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因;②孕妇血浆中超甲基化RASSF1A基因的含量随妊娠的进程逐渐增加,且在分娩后24 h内消失;③未妊娠组中均未检测到超甲基化的RASSF1A基因;④妊娠晚期子痫前期组超甲基化RASSF1A基因含量为正常同期妊娠组的3.52倍。结论:孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因可以作为胎儿表观遗传学标志物,其水平的异常变化或能提示子痫前期-子痫的发生。     

C21orf25片段在母胎间的甲基化差异及其临床价值

目的:阐明C21orf25片段在母胎间甲基化状态的差异,探讨其用于无创性产前诊断的价值。方法:收集388例孕妇血浆,其中126例同时提取外周血细胞及胎盘(或绒毛)组织DNA,采用甲基化敏感性限制性酶切联合荧光定量PCR(MSRE+PCR)技术,检测母胎间C21orf25基因、RASSF1A基因甲基化状态的差异,分析其影响因素,并分别以胎源性RASSF1A或SRY基因为参照位点,计算孕妇血浆中胎源性C21orf25与参照位点的浓度比,判断胎儿21号染色体数量。结果:C21orf25及RASSF1A在胎盘或绒毛组织中均呈高甲基化状态,而在母体外周血细胞呈现低甲基化状态。C21orf25在母胎间的甲基化差异程度受孕周的影响,早孕期小于中、晚孕期(P=0.002,P<0.01)。采用MSRE+PCR技术对孕妇血浆中C21orf25、RASSF1A片段的检出率分别为100%和96.9%。计算184例正常妊娠孕妇血浆中胎源性C21orf25/RASSF1A比值,确定其95%的参考值范围为0.20～3.46,以此为标准判断71例胎儿21号染色体数量,其中67例二倍体妊娠的准确率为94.0%(63/67),4例21三体综合征妊娠,2例C21orf25/RASSF1A比值高于参考区间上限而获得诊断。以SRY为参照位点,94例正常二倍体男胎妊娠中甲基化C21orf25/SRY比值为3.16±1.20,95%参考值范围为0.81～5.51,以此为标准判断35例男胎21号染色体数量,准确率为97.1%(34/35),2例21三体妊娠均获准确诊断。结论:高甲基化C21orf25基因可作为孕妇血浆中胎儿DNA的标志物,通过计算该位点与参照基因的浓度比值,有望进行唐氏综合征的无创性产前诊断。     

母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展

发现母血浆及血清中胎儿游离DNA,为无创性产前诊断技术开辟新途径.利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在.用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYS14),确定性别敏感性60%～100%.利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度,妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA,随妊娠周增加胎儿DNA量也增高.另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿,母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段.     

母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展

发现母血浆及血清中胎儿游离DNA，为无创性产前诊断技术开辟新途径。利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在。用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYSl4)，确定性别敏感性60％～100％。利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度，妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA，随妊娠周增加胎儿DNA量也增高。另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿，母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段。     

DNA异常甲基化在卵巢癌中的研究进展

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,严重威胁着女性的生命健康,其发生与多种分子变化有关。表观遗传学改变与人类多种肿瘤有着密切的关系,而肿瘤抑制基因的DNA甲基化则是卵巢癌中常见的表观遗传学现象,与卵巢癌的发生、发展有着密切的联系。DNA甲基化属于基因表观遗传调控的重要方式之一。新的研究发现,DNA异常甲基化,尤其是基因启动子CpG岛高甲基化,使肿瘤抑制基因——乳腺癌易感基因1(BRCA1)、Ras相关区域1A基因(RASSF1A)等失活,在卵巢癌发生、发展中起重要作用。综述DNA异常甲基化在卵巢癌中的研究进展,可为卵巢癌发病机制、早期诊断、治疗及判断预后提供新的方法。     

利用母血胎儿游离DNA检测胎儿遗传信息的应用进展

目前临床广泛开展的产前诊断技术主要是侵入性产前诊断技术,包括妊娠早期(7～11周)绒毛活检技术、妊娠早中期胚胎(胎儿)镜检查技术、妊娠中期羊膜腔穿刺取样技术、妊娠中晚期脐静脉穿刺胎血取样技术等,因其创伤性、有一定的流产风险使得有创产前诊断的普及率不高.目前,利用孕妇外周血中胎儿细胞或胎儿DNA开展产前诊断已成为非侵入性产前诊断临床探索的新方向.然而,由于参与母体血循环的胎儿细胞数量极少、母血胎儿有核红细胞含量随孕周变化差异巨大,且分离、提纯、富集胎儿有核红细胞技术复杂、价格昂贵,导致利用母血胎儿细胞检测胎儿遗传信息发展缓慢[1].     

5-氮杂脱氧胞苷对子宫内膜癌细胞的生长及RASSF1A基因表达的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶抑制剂--5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对子宫内膜癌细胞的生长及RASSF1A基因表达的影响.方法 5-Aza-CdR作用后,采用锥虫蓝染色法、流式细胞仪分别检测子宫内膜癌细胞株HEC-1B细胞的生长及凋亡情况,采用RT-PCR技术、甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测HEC-1B细胞中RASSF1A mRNA的表达和RASSF1A基因启动子的甲基化状态.结果 (1)HEC-1B细胞的生长及凋亡情况:5-Aza-CdR对HEC-1B细胞生长的抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性(P＜0.01);且HEC-1B细胞的凋亡率也呈明显的剂量依赖性(P＜0.01).(2)HEC-1B细胞中BASSF1A mRNA的表达:未经5-Aza-CdR作用的HEC-1B细胞中BASSF1A mRNA表达缺失;不同浓度5-Aza-CdR(分别为0.05、0.1、1、5、10 nmol/ml)作用后,HEC-1B细胞中RASSF1AmRNA表达不同程度地上升,其相对表达水平分别为0.074±0.004、0.105±0.004、0.167±0.006、0.334±0.005、0.484±0.007,分别与未经5-Aza-CdR作用的细胞(为0)比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).(3)HEC-1B细胞中RASSF1A基因启动子的甲基化状态:未经5-Aza-CdR作用的HEC-1B细胞中RASSF1A基因启动子呈高甲基化状态;加入低浓度(即0.05、0.1、1、5 nmol/ml)的5-Aza-CdR后,HEC-1B细胞中RASSF1A基因启动子的甲基化水平下降,呈半甲基化状态(即同时出现甲基化和非甲基化条带);当5-Aza-CdR浓度为10 nmol/ml时,HEC-1B细胞中RASSF1A基因启动子呈非甲基化状态.结论 (1)5-Aza-CdR可抑制HEC-1B细胞增殖、促进HEC-1B细胞凋亡.(2)5-Aza-CdR能使HEC-1B细胞重新表达RASSF1A mRNA,能逆转RASSF1A基因启动子的高甲基化状态.     

DNA异常甲基化在宫颈癌中的研究进展

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁女性生命健康。随着对肿瘤的分子生物学机制研究的不断深入,发现表观遗传学的改变与人类多种肿瘤的发生密切相关,而抑癌基因的DNA甲基化则是宫颈癌中最重要的表观遗传学修饰形式。研究发现,p16、RASSF1A、MGMT等抑癌基因启动子区Cp G岛的高甲基化是导致抑癌基因失活的一个重要机制,在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。综述DNA异常甲基化在宫颈癌中的研究进展,可为宫颈癌的病因学研究、早期诊治和预后判断提供新的思路。     

母血胎儿细胞遗传学诊断技术

1969年,Walknowska首次报道在母血循环中可能存在胎儿细胞[1],随后一些学者相继证实了这一发现。进入90年代以来,随着分子生物学和细胞生物学等技术的发展与完善,形成了从母血循环中识别、分离和检测胎儿细胞等一系列遗传学诊断技术。母血胎儿细胞医学遗传学诊断技术的形?..     

卵巢癌的DNA甲基化研究进展

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤,但由于缺乏早期的诊断手段,其病死率居于妇科肿瘤首位。 DNA甲基化是最早发现的表观遗传学改变。RAS相关领域家族基因1（RASSF1A）、乳腺癌易感基因1（BRCA1）和hMLH1等基因的甲基化在卵巢癌的发生、发展中发挥重要作用,通过对这些基因的甲基化检测,可以有助于对卵巢癌的早期诊断。然而,一些基因的甲基化,如hMLH1,可能降低癌细胞对化疗的敏感性。去甲基化药物则可以使得这些甲基化基因发生去甲基化,从而改善化疗效果和患者的预后。综述对卵巢癌主要相关基因的甲基化研究的最新进展。     

表观遗传学与卵巢癌耐药的关系研究

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高,目前其临床治疗手段主要是手术切除和辅助性化疗,但治疗后其易复发、易转移和易耐药的特性,使得很多抗肿瘤药对其作用仅限于初期治疗。研究表明肿瘤的发生、发展及其耐药机制与表观遗传学关系密切,而相关研究也证实卵巢癌的发生发展与耐药受表观遗传学的调控,如DNA甲基化,包括Ras相关区域1A基因(RASSF1A)和乳腺癌易感基因1(BRCA1)异常甲基化;组蛋白修饰,包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等多种方式;微小RNA(mi RNA)调控相关基因等。同时研究表明通过调控表观遗传学如DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂等与传统抗肿瘤药物进行联合治疗能够显著提高卵巢癌的疗效,因此研究表观遗传学与卵巢癌的耐药机制有望为临床治疗卵巢癌提供新的思路与研究基础。     

21-三体综合征无创性产前诊断新进展

21-三体综合征是胎儿最常见的染色体病,发生率约为1/800,占小儿染色体病的70%～80%,发生率随着母亲年龄的增高而增高.当前在进行产前诊断时采用的是有创方法来获取胎儿细胞以明确产前诊断.有创检查对母儿存在一定的风险,因此临床上仅用于有遗传学高风险的孕妇.过去几十年中,一直广泛应用的方法之一是从母血中分离胎儿有核红细胞,但是胎儿有核红细胞在母血中含量稀少、需进行细胞富集等操作,限制了其发展和应用[1],因而临床医学工作者迫切期望建立一套更安全有效的方法进行无创产前诊断.     

应用表观遗传学方法检测母体循环中游离胎儿DNA

目的:探讨表观遗传学方法检测孕妇血浆中游离胎儿DNA水平的应用价值。方法:随机选择早、中、晚期妊娠孕妇各20例,以非妊娠妇女20例为对照组。提取血浆中的总游离DNA,用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测各组血浆标本中目的基因m-maspin(一种肿瘤抑制基因启动子的甲基化序列)、u-maspin(前者的未甲基化序列)的表达水平,再进行相对定量,对妊娠组和对照组样本均数进行统计学分析。结果:(1)m-maspin在妊娠早、中、晚期孕妇血浆中的浓度分别是非妊娠妇女血浆中浓度的1.0、1.1、1.1倍,差异无统计学意义(P>0.05);(2)u-maspin在正常非妊娠妇女血浆中未能检测到,在60例孕妇血浆中57例可检测到,它在孕妇血浆中的浓度随妊娠进展呈升高趋势,中、晚期妊娠妇女血浆中其浓度相对于早期妊娠分别为1.7倍和3.1倍,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:m-maspin不是妊娠特异性标志物,u-maspin为妊娠特异性标志物。u-maspin基因可作为孕妇血浆中游离胎儿DNA水平变化的表观遗传学标志,相对于以胎儿性别基因作为遗传学标志的检测方法,它有助于扩大非创伤性产前诊断的临床应用范围。     

血清DNA定量及基因甲基化状态检测在卵巢上皮性癌诊断中的应用

卵巢恶性肿瘤是病死率最高的女性生殖系统肿瘤,其中90%为卵巢上皮性癌(卵巢癌),而70%的患者诊断时已达Ⅲ期或Ⅳ期,5年生存率仅为15%～20%[1].因此发现新的既敏感又特异的肿瘤标志物,对卵巢癌的早期诊断、提高生存率具有重要意义.近年的研究发现,作为表观遗传的主要方式之一,DNA异常甲基化是肿瘤发生的早期事件,可早于基因及其表达产物的改变[2].而且,肿瘤患者血清DNA含量明显升高,虽然其来源尚未十分明确,但其具有与肿瘤DNA类似的遗传学和表观遗传学改变[3].因此,血清DNA的异常甲基化用于肿瘤的早期诊断具有明显的优势和极大的潜力.本研究通过定量检测卵巢癌患者血清DNA含量,以及基因EGFLAM、CDKN2A和LSM2的启动子区胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸岛(CpG island,CGI)甲基化状态,探索新的可用于辅助卵巢癌早期诊断的血清DNA甲基化标志物.     

荧光原位杂交技术在无创性产前诊断中的应用

产前诊断技术的发展趋势为早期、快速、准确、无创伤,能够在胚胎发育的较早期,安全、准确地对出生缺陷作出诊断.通过无创伤性的技术进行产前诊断是临床产前诊断的目标.荧光原位杂交(FISH)技术是一种具有高度灵敏性和特异性的染色体和基因分析技术,随着DNA技术的发展与染色体基因特异性探针的出现,目前广泛用于产前诊断各种染色体异常,尤其是在母血胎儿细胞遗传学诊断和胚胎植人前遗传学诊断中的应用,将无创性产前基因诊断水平提高到新的高度.     

应用表观遗传学位点检测孕妇血浆中的胎儿DNA

随着对遗传病分子基础认识的不断深入和检测特异基因突变技术能力不断提高,为以DNA检测为基础的产前诊断提供了理论和技术基础,对胎儿DNA进行遗传分析已成为常规检测手段。传统的产前诊断中获取胎儿组织样本的方法包括羊膜腔穿刺、绒毛膜取样、脐带取血等,这些方法均有创伤性,对胎儿和孕妇都有一定的危险性。近年孕妇外周血中胎儿DNA的发现开创了非侵入性产前诊断的可能性,同时母体血浆中相对高纯度和相对浓缩胎儿DNA技术发展促进了非侵入性产前诊断的临床应用。但是,区分孕妇血浆中的母体DNA和胎儿DNA是关键,目前已发现有印迹基因、胎盘组织特异性表达基因和病理情况下胚胎组织基因组特异性甲基化基因,这3类基因位点均可用于区分检测孕妇血浆中的母体DNA和胎儿DNA。     

母血中分离检测胎儿细胞的研究进展

进入母体血循环的胎儿细胞有4种.使用有效的方法从正常与异常妊娠母血中分离富集极少量的胎儿有核红细胞、滋养细胞、淋巴细胞和粒细胞.目前国外采用较多的有荧光激活细胞分选法、磁活化细胞分选法、免疫磁珠分离法、密度梯度离心法.分子生物学方法的引入.特别是聚合酶链反应及其衍生技术和荧光原位杂交技术提供了从母血中检测胎儿细胞敏感的方法并在无创伤性产前诊断方面得到一定的应用.     

孕妇血浆和血清中胎儿DNA在产前诊断中的应用

长久以来许多学者致力于研究利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行非创伤性产前诊断 ,虽然取得了一些重要进展 ,但母血中的胎儿细胞数量稀少 ,富集效率不高且价格昂贵 ,成为常规应用的主要障碍。母体血浆中存在较高浓度胎儿DNA的发现 ,为非创伤性产前诊断开辟了一个新途径。一、孕妇血浆和血清中的胎儿DNA肿瘤患者的血浆和血清中癌源性DNA的发现[1 ,2 ] ,激发了研究人员将血浆用于分子分析的兴趣。由于胎盘的滋养层和恶性肿瘤细胞的生物学行为类似 ,均有侵入性和致癌基因表达 ,故一些研究人员把胎盘喻为“假恶性物”[3] 。这就提示 :癌症患者…     

宫颈癌RASSF2A基因启动子甲基化与其临床病理特征的关系

目的:检测宫颈癌组织中Ras相关区域家族2A(RASSF2A)基因启动子甲基化状态,并分析RASSF2A基因甲基化率与临床病理特征的关系。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)检测46例宫颈癌、38例宫颈上皮内瘤变(CIN)和25例正常宫颈组织中RASSF2A基因启动子甲基化状态。结果:宫颈癌组织中RASSF2A基因甲基化率显著高于CIN组织及正常宫颈组织(P0.05)。RASSF2A甲基化阳性率随着淋巴结转移而升高,具有明显的相关性(P0.05);不同年龄、临床分期、组织分级及病理性类型与RASSF2A基因甲基化无显著相关性(P0.05)。结论:RASSF2A基因启动子甲基化为频发事件,可能与宫颈癌的发生和淋巴结转移有关。     

孕妇外周血胎儿有核红细胞在产前诊断中的作用

目前对遗传性疾病的产前诊断有数种方法。根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为侵入性产前诊断和非侵入性产前诊断。前者包括羊膜腔穿刺术、绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等，虽然诊断精确度较高，但可导致流产等并发症，只能在高危孕妇中实施；后者的优点是既能行产前诊断又无危险性，适用于低风险的孕妇大群体筛选，尽早发现和杜绝异常胎儿，达到优生目的。许多学者致力于利用胎儿细胞进行产前诊断。利用孕妇外周血的胎儿细胞进行产前基因诊断三个关键性技术为：(1)证实母血中存在胎儿细胞和DNA。(2)建立可靠稳定的方法分离胎儿细胞和DNA。(3)应用灵敏性、特异性强的技术以微量胎儿细胞和DNA为模板诊断遗传性疾病。这是最具潜力的非侵入性产前诊断方法之一。