hTR反义寡核苷酸对不同鼻咽癌细胞生长分化的影响

目的 :研究端粒酶反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞生长分化的影响。方法 :脂质体介导反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株 ,用细胞体外增殖实验、免疫组织化学S P法 ,观察细胞生长分化的变化情况。结果 :针对端粒酶RNA模板区的反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量和时间依赖性 ,反义寡核苷酸组细胞角蛋白表达高于其它处理组及空白对照组 (P <0 0 1) ,细胞形态趋向分化成熟。结论 :端粒酶反义寡核苷酸可抑制鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞的生长 ,并促进细胞分化。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促胰腺癌细胞凋亡

目的研究逆转录病毒载体介导的端粒酶反义RNA促进胰腺癌细胞Can-pan-2凋亡的作用。方法通过电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞,G418筛选抗性细胞,获取稳定表达病毒的产病毒细胞株,以病毒上清感染Can-pan-2细胞,G418筛选获得稳定转染细胞集落并扩增培养,PCR鉴定端粒酶RNA基因的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,免疫荧光化学检测不同处理组细胞的增殖情况,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡。结果两种逆转录病毒上清的滴度分别为0.95×106CFU/mL和1.1×106CFU/mL,PCR法可于约500bp处观察到目的基因的表达,反义端粒酶RNA作用后,Can-pan-2细胞端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制,并出现明显的细胞凋亡。结论反义端粒酶RNA可抑制胰腺癌细胞端粒酶活性,促进胰腺癌细胞的凋亡。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核酸促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制HL-60细胞的端粒酶活性后,探讨顺铂对HL-60细胞凋亡的影响。方法:采用聚合酶链反应-酶联免疫测定(PCR-ELISA)方法检测人工合成的反义核酸处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变;免疫荧光标记通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达水平;用DNA电泳及流式细胞仪计数检测细胞凋亡。结果:hTERT基因的ASODN作用于HL-60细胞后,细胞的hTERT蛋白表达及端粒酶活性表现不断降低;抑制HL-60细胞端粒酶活性后,顺铂可诱导HL-60细胞产生明显的DNA断片;ASODN与顺铂联合作用于HL-60细胞后的凋亡细胞百分率(38.62±3.45)%分别同正义寡核苷酸(SODN)与顺铂联合作用组(11.02±2.07)%、单用顺铂作用组(9.23±1.70)%进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论:hTERT基因的ASODN能促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡。     

反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞P16、P21表达的增强作用

目的 观察反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞周期的影响,检测P16和P21的表达,探讨端粒酶与细胞期调控间的关系及反义端粒酶RNA在肝癌基因治疗中的意义。方法 经脂质体介导,将反义端粒RNA真核表达载体pBBS212－hTR导入SMMC7721细胞中。细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、TRAP－PCR－ELISA及免疫组化技术,结合图像分析,在检测SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721／pBBS212－hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达。结果 与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721细胞端粒酶活性的同时,P16和P21蛋白的表达水平显著增高。结论 转染反义端粒酶RNA在封闭细胞端粒活性表达的同时,伴发P21与P16表达水平的升高。本实验研究为探讨肝癌发病机制及治疗提供了一定的依据。     

亚砷酸对CNE1细胞株增殖和端粒酶hTRT的影响

目的　观察亚砷酸对人鼻咽癌CNE1细胞株增殖的抑制作用及端粒酶逆转录酶 (hTRT)的影响。方法　人鼻咽癌细胞株CNE1用不同浓度亚砷酸处理 ,MTT法观察不同浓度亚砷酸作用不同时间后对CNE1细胞生长的影响 ,流式细胞仪检测不同条件作用后CNE1细胞增殖指数和凋亡指数及周期分布改变 ,免疫组化法检测增殖细胞核抗原 (PCNA)及端粒酶hTRT表达情况。结果　亚砷酸抑制人鼻咽癌细胞株CNE1细胞的增殖 ,其作用随着亚砷酸浓度增加和作用时间延长而增加 ;一定浓度亚砷酸作用于CNE1细胞后 ,其S期细胞比例及增殖指数随着时间的延长而逐渐减少 ,但凋亡指数逐渐增多。随着亚砷酸浓度增加 ,PCNA及hTRT阳性细胞平均灰度值逐渐下降 (P <0 0 5 )。结论　亚砷酸可抑制人鼻咽癌细胞株CNE1的生长 ,除了诱导凋亡以外 ,调控DNA合成及细胞增殖的PCNA蛋白合成降低 ,抑制端粒酶的活性可能是亚砷酸的部分抗肿瘤作用机制。     

互补于hTERT关键区段的反义RNA抑制肝癌细胞

目的研究针对人类端粒酶催化亚单位(hTERT)调控区C-MYC结合位点的反义RNA抑制肝癌细胞生长。方法细菌内同源重组构建反义RNA腺病毒(rAd-asmycb),转染HepG2.2.15肝癌细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜下观察凋亡细胞形态,聚合酶链反应-酶联免疫分析(PCR-ELISA)、逆转录-PCR(RT-PCR)分别检测细胞端粒酶活性及mRNA水平上hTERT表达。结果反义RNA抑制肝癌细胞生长,细胞凋亡率为40.7%,显示特征性凋亡细胞形态,能够显著降低细胞端粒酶活性,在mRNA水平上抑制hTERT表达。结论hTERT调控区C-MYC结合位点可能是肝癌基因治疗的有效靶位。     

LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系 ,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞 ;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞 ;MTT法检测细胞增殖能力 ;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达 ;免疫组化法检测LMP1蛋白表达。结果显示 :转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。经端粒酶反义核酸作用 4 8h ,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERTmRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组 (均P <0 0 1) ,反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化 ;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERTmRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。以上结果提示 :EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关。     

口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞端粒酶活性的影响

目的:研究口虾蛄提取物(EOS)对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)端粒酶活性的抑制作用及其可能机制。方法:MTT法检测不同浓度的EOS对CNE-2Z细胞增殖能力的影响;端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测各组细胞端粒酶活性,RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达,Western blotting检测c-Myc蛋白表达。结果:EOS对CNE-2Z细胞增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性(P0.01);EOS处理组CNE-2Z细胞端粒酶的活性、hTERT mRNA和c-Myc蛋白的表达水平均低于对照组(P0.01),也呈剂量依赖性,并且hTERT mRNA的下调与c-Myc的抑制存在相关性(P0.05)。结论:EOS可能通过下调细胞c-Myc表达而抑制了hTERT mRNA的转录,以致端粒酶的活性降低而抑制CNE-2Z细胞增殖。     

端粒酶反义核酸对乳腺癌细胞生长的抑制作用

为了探讨针对人类端粒酶RNA（hTR）基因的反义寡核苷酸（AS－ODN）对乳腺癌细胞系MCF－7的影响，将AS－OND作用于细胞。进行细胞计数，MTT比色法测细胞生长抑制率，PCR－ELISA法测端粒酶活性，流式细胞仪测细胞周期与凋亡。结果表明该AS－ODN能抑制MCF－7细胞生长，降低端粒酶活性并诱导细胞凋亡。针对hTR的AS－ODN对治疗恶性肿瘤有潜在意义。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响。方法:将LMP1基因真核表达质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞,脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测LMP1和P53蛋白表达,原位杂交技术检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达。 结果:对照组,转染并表达LMP1基因的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞。端粒酶反义核酸作用组,LMP1基因转染细胞的LMP1蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.01);LMP1基因转染细胞与未转染细胞和转染空载质粒的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著低于对照组(P＜0.01),但LMP1基因转染细胞的增殖能力和P53蛋白表达水平仍显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(P＜0.01)。 结论:EB病毒LMP1可促进鼻咽癌细胞P53蛋白的表达。     

受体酪氨酸激酶Axl高表达促进鼻咽癌临床进展

目的:探讨受体酪氨酸激酶anexelekto(Axl)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)中的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测78例NPC和32例鼻咽黏膜慢性炎中Axl的表达,分析Axl蛋白表达与NPC患者临床参数的相关性。常规培养NPC细胞,免疫荧光法检测不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z及C666-1中Axl的蛋白表达情况。应用Axl特异性抑制剂TP-0903处理CNE1和C666-1细胞,CCK-8实验检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞周期的分布,q PCR检测Axl和增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA表达,Western blot检测Axl及p-Axl蛋白的表达。结果:Axl蛋白定位于胞膜和胞质。NPC中Axl高表达阳性率显著高于鼻咽黏膜慢性炎(P0.01)。Axl高表达与患者年龄、性别及M分期无关,与临床分期、T分期和N分期呈正相关(P0.05)。Axl在高分化CNE1细胞中低表达,在低分化CNE2Z细胞和未分化C666-1细胞中表达水平明显增高。TP-0903呈浓度和时间依赖性抑制NPC细胞的活性,2 nmol/L TP-0903即具有显著抑制效应,能阻滞细胞周期于G0期,在降低Axl活性的同时也显著抑制PCNA的表达。结论:Axl高表达可促进NPC的临床进展;TP-0903显著抑制NPC细胞的增殖,提示Axl可能在NPC靶向治疗中具有一定的价值。     

基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P 0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P 0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P 0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P 0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。     

表没食子儿茶素没食子酸酯通过调控P53/miR-34a抑制鼻咽癌细胞的增殖

目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鼻咽癌细胞增殖的影响,并以微小RNA-34a(miR-34a)为靶点探讨其作用机制。方法:不同浓度的EGCG处理CNE-2Z细胞,CCK-8法、Ed U染色法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞周期分布的改变;Western blot检测P53和Notch1蛋白水平的变化;real-time PCR检测miR-34a和Notch1 mRNA的表达。结果:EGCG处理后,CNE-2Z细胞的增殖受到明显抑制,克隆形成能力降低,细胞周期阻滞于G0/G1期,呈剂量依赖关系;随着EGCG浓度增高,P53和miR-34a的表达水平明显上调,而其下游Notch1 mRNA和蛋白的表达水平则明显下降。结论:EGCG可能通过调控P53/miR-34a/Notch1通路诱导细胞周期阻滞,抑制鼻咽癌细胞增殖。     

p53沉默对人鼻咽癌细胞株CNE2放射生物学特性的影响

目的：研究p53沉默对鼻咽癌(NPC)细胞株CNE2放射敏感性的影响,探讨NPC中过表达的p53蛋白是否参与了放射诱导的细胞损伤和凋亡过程。方法：以稳定干扰p53基因表达的鼻咽癌细胞株CNE2sip53和对照细胞株CNE2/pSUPER为对象,采用集落存活分析法分析在不同放射剂量照射后的细胞存活分数(SF)并计算放射生物学参数D0, α, β和放射敏感比(SER);采用MTT法检测放射线对细胞生长的影响;采用流式细胞术检测放射线对细胞周期及凋亡的影响。 结果：CNE2sip53细胞照射后的SF值高于CNE2/pSUPER细胞;与CNE2/pSUPER细胞相比,CNE2sip53细胞D0值和SF2值均增大,而α值, β值和SER均减小; 放射线诱导CNE2sip53细胞凋亡及对细胞增殖的抑制作用弱于其对CNE2/pSUPER细胞的作用;放射线诱导CNE2/pSUPER细胞阻滞于G1期,而诱导CNE2sip53细胞阻滞于G2期。 结论：稳定沉默鼻咽癌细胞中p53基因表达后,细胞对放射的敏感性降低,提示NPC细胞中过表达的p53蛋白参与了放疗诱导的NPC细胞损伤和凋亡过程。     

非小细胞肺癌中端粒酶催化基团mRNA表达的临床意义及其与P53的相关性

目的:研究非小细胞肺癌与正常肺组织穿刺标本中端粒酶催化基团mRNA表达与肿瘤分期与分级关系,探讨其在非小细胞肺癌早期诊断中的临床意义.观察肿瘤抑制基因P53与hTRT mRNA表达的关系.方法:采用原位杂交技术检测非小细胞肺癌与正常肺组织中端粒酶催化基团mRNA表达;用免疫组化方法检测非小细胞肺癌的P53蛋白表达.结果...     

EB病毒感染对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法:用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1;用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果:感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性,生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P＜0.01),2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生,而均仅有2%~3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论:EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长,但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。     

肝素增强佛波酯对人鼻咽癌CNE2细胞的作用：上调c-jun、p53、p21的表达（英文）

目的：观察肝素联合佛波酯对人鼻咽癌细胞的增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制。方法：用细胞记数法、流式细胞术观察肝素联合佛波酯对人鼻咽癌细胞的增殖及细胞周期的影响；而用TUNEL、琼脂糖凝胶电泳、Western blot等方法观察肝素与佛波酯联合应用对人鼻咽癌细胞凋亡的作用。结果：肝素与佛波酯联合应用后对鼻咽癌细胞的生长抑制及其凋亡具有显著增强的作用，同佛波酯单独应用于诱导细胞凋亡相比,低剂量的肝素与佛波酯联合应用后发现：TUNEL阳性细胞明显增多；G₁期细胞阻滞，S期细胞明显减少，凋亡率增加；DNA“梯形”变化更加明显；c-jun、p53、p21基因表达明显升高，而c-fos在整个用药过程中没有改变。结论：肝素增强佛波酯对人鼻咽癌细胞的抗增殖及促凋亡，这可能与c-jun、p53、p21的表达上凋有关。