地高辛标记核酸探针及其在分子杂交中的应用

地高辛标记核酸探针及其在分子杂交中的应用汤权江苏盐城市卫生防疫站（２２４００２江苏）地高辛一毛地黄毒甙配基（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，简称Ｄｉｇ）是甾族半抗原，ｄＵＴＰ分子可在Ｃ３位上通过空间短臂与之相连接（Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ）。用Ｄｉｇ标记的核酸探针避...     

PCR系统制备地高辛标记的探针检测脊髓灰质炎病毒核酸

笔者应用聚合酶链反应（PCR）合成系统，以逆转录的SabinⅠ、Ⅱ、Ⅲ型病毒cDNA为模板，在反应液中加入标记的Dig-dUTP，经扩增制备了地高辛配基标记的脊髓灰质炎病毒cDNA探针、该法比PCR扩增产物后，电泳，片段回收到标记、提纯，常需3天。结果比较PCR技术直接制备地高辛标记cDNA探针方便，快速，标记率高，用于型别鉴定比中和试验快，敏感，特异性强等优点。     

酶联免疫吸附试验检测产不耐热肠毒素大肠杆菌的研究

本文报道了ELISA法检测产不耐热肠毒素大肠杆菌(ETEC/LT⁺)的研究。用酶标抗-CT建立的ELISA,检测杭州市医院病人分离的70株和动物分离的56株大肠杆菌,以及来源于腹泻患者的10株沙门氏菌、亲水气单胞菌、类志贺氏邻单胞菌和耶尔森氏菌,结果仅从病人菌株中检出3株ETEC/LT₊,阳性率为4.3%;未发现与其它4种肠道病原菌有交叉反应。这是一种特异、敏感、快速检测ET EC的方法,在感染性腹泻的病原研究中有推广应用价值。     

聚合酶链反应标记输血传播病毒(TTV)地高辛素探针的初步应用

用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）制备地高辛素标记的输血传播病毒（ＴＴＶ）探针，并与巢式ＰＣＲ法（ｎＰＣＲ）比较。结果该探针具有ＴＴＶ特异性，其灵敏度为１０ｐｇＤＮＡ。应用该法检测１０８份非甲～庚型肝炎病人的血清标本，ＴＴＶＤＮＡ阳性率为１８５％（２０／１０８）；检测２２份病人的粪便标本，ＴＴＶＤＮＡ阳性率为２７３％（６／２２）。该法与ｎＰＣＲ法的总符合率为９６９％（１２６／１３０）。结论：用ＰＣＲ法直接制备地高辛素标记ＤＮＡ探针简便、快速、灵敏度高，特异性好。应用该法从６名病人的粪便中检出ＴＴＶＤＮＡ，提示ＴＴＶ有可能通过粪口途径传播。     

广州某农村产肠毒素大肠杆菌腹泻病监测

１９９０～１９９１年对广州农村产历毒大肠杆菌（ＥＴＥＣ）所致腹泻病进行了监测。结果其年发病率为２．３％，其中５岁以下儿童年发病率为１３１．９％，远高于５岁以上人群３．６％的年发病率．７、８月为ＥＴＥＣ腹泻病的高发季节．４种毒力因子以猪源热稳定肠毒素（ＳＴｐ）的检出率最高（约５０％）。另外，ＥＴＥＣ同其他肠道致泻病原体的混合感染和抗药性均非常普遍。     

MGB-TaqMan探针实时荧光定量在快速检测产肠毒素大肠杆菌中的价值

目的 采用MGB-TaqMan探针建立产耐热肠毒素大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法.方法 针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素Ⅰ基因片段设计引物、MGB探针,采用外标法,绘制标准曲线,进行实时荧光定量PCR检测.评价该方法的特异性,灵敏度,准确度,检测范围,重复性及稳定性等.做阴性对照,排除假阳性,采用UNG酶抗污染.结果 实验结果表明引物、探针特异性良好,该方法的灵敏度可达到每反应3DNA拷贝,特异性强,检测范围在100～109拷贝每反应,重复性及稳定性较好,整个过程只需要2 h.结论 该方法能快速、灵敏、特异检出产耐热肠毒素大肠埃希菌,对控制由耐热肠毒素引起的腹泻性疾病具有重要意义.     

产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)单克隆抗体研制及应用

本研究用小分子量大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)经戊二醛聚合成功地免疫了Balb/c小鼠,小鼠脾细胞与SP2/O小鼠骨髓瘤细胞融合,获得1株产生特异性ST单克隆抗体(STMcAb)的杂交瘤细胞株并用特的STMcAb建立了检测ETEc ST的竞争性ELISA。该方法检测ST的敏感性较乳鼠灌胃法(SMA)高30倍。用两种方法对330株腹泻监测点的大肠杆菌做平行试验,发现12个相同的菌株两种试验ST均阳性,其余菌株两种试验均阴性。     

多基因PCR检测产毒性大肠杆菌和志贺氏菌的研究

为了提高普通的单基因ＰＣＲ检测致病性肠道杆菌的时效，采用ＥＴＥＣ４４８１３（ＬＴ）、ＥＴＥＣ１９４４９（ＳＴ）和福氏２ａＴ３２（ｉｐａＨ）３个标准株为模板，建立了检测产毒性大肠杆菌（ＬＴ，ＳＴ）和志贺氏菌的三基因ＰＣＲ方法。并分别用相应单基因ＰＣＲ方法标记的探针斑点杂交标准株ＥＴＥＣ４４８１５（ＬＴ）、工程株ＰＳＬＭ００４（ＳＴ）和标准株４８０２５１１（ｉｐａＨ）。杂交的结果都是阳性，证实了这个多基因ＰＣＲ扩增是特异的。并用此三基因ＰＣＲ反应系统检测１１３株ＥＴＥＣ和志贺氏菌，结果是ＬＴ２５株、ＳＴ１６株、ＬＴ和ＳＴ共３０株及ｉｐａＨ４２株。在几种病原体可能共存的样本中，用一次ＰＣＲ就能解决病原体的检测和鉴别问题，比单基因ＰＣＲ更快速、经济。     

环介导等温基因扩增技术快速检测不耐热型肠毒素大肠杆菌反应条件的优化

[目的]建立环介导等温基因扩增技术快速检测食源性致病菌不耐热型肠毒素大肠杆菌的方法。[方法]基于产肠毒素大肠杆菌的LT基因序列设计1套(共4条)能识别6个区域的特异性LAMP引物,优化引物加入量、反应温度以及反应时间等反应条件,最终评估该方法的特异性和灵敏性。[结果]引物加入量对扩增影响较大;在扩增温度为63℃时扩增最明显;扩增反应进行到45min后即有扩增产物产生。[结论]该方法检测不耐热型肠毒素大肠杆菌具有耗时短、操作简捷、特异性较好、灵敏性高等优点。     

大肠杆菌不耐热肠毒素的免疫学机制研究进展

随着免疫学及疫苗研究的不断发展,大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)在免疫过程中的作用日益受到人们重视.本文介绍了LT的免疫学机制与应用方面的进展.     

DNA扩增制备探针并用于临床白色念珠菌感染鉴定

目的应用聚合酶链反应技术扩增特异DNA片段,并制备成为可应用于临床鉴定白色念珠菌的基因探针. 方法采用聚合酶链反应技术特异地扩增白色念珠菌标准株DNA EO3 125 bp基因片段,然后用半抗原地高辛配基标记,在完成基因探针显色敏感度检测之后,应用该基因探针分别对血液病病房分离的白色念珠菌、热带念珠菌及大肠埃希菌等多种细菌进行斑点杂交测试. 结果基因扩增制备Dig-125 bp DNA探针显色敏感度为0.01 pg,具有白色念珠菌特异性,与其他念珠菌和细菌不发生杂交. 结论基因扩增制备EO3 125 bp DNA探针方法简便可靠,具有很强特异性,可应用于临床鉴定白色念珠菌感染.     

三对引物同时PCR分型检测产毒素大肠杆菌的方法及在分子流行病学研究中的应用

在产毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）肠毒素基因内设计合成三对引物，建立了三对引物同时ＰＣＲ检测ＥＴＥＣ的方法，一次ＰＣＲ即可扩增出６２７ｂｐ（ＬＴｈ）、２４０ｂｐ（ＳＴＩａ）和１６９ｂｐ（ＳＴＩｂ）三种肠毒素基因片段，可同时分型检测出ＬＴｈ、ＳＴＩａ、ＳＴＩｂ、ＬＴｈ－ＳＴＩａ、ＬＴｈ－ＳＴＩｂ五种基因型的ＥＴＥＣ，与非ＥＴＥＣ对照菌无交叉反应，最小检出量为１０ｃｆｕ，显示了很高的特异性和敏感性。将建立的方法用于山东省六县市６２３例大肠杆菌致泻标本的检测，阳性率为４０．３％，并能鉴别ＥＴＥＣ的基因型，为ＥＴＥＣ腹泻的分子流行病学研究提供了有效的检测手段     

用二种基因探针对肠毒性大肠杆菌腹泻的初步分子流行病学研究

应用肠毒性大肠杆菌三种肠毒素(LT、ST-P、ST-H)基因探针对近年来从广州、武汉、四川、沈阳、湖南等部分省市搜集到的921株致急性腹泻的大肠杆菌进行DNA-DNA菌落原位杂交检测。LT198株占21.5%(198/921)、ST-H 131株占14.2%(131/921)、ST-P 54株占5.9%(54/92l),ST+LT 19株占2.1%(19/921)。表明我国ETEC腹泻病原体中以LT⁺ ETEC为主,其次为ST-H⁺郊区农村ST-P⁺也占相当比例。为国内ETEC腹泻的分子流行病学研究提供了基本数据和较先进的诊检工具。     

非典型致病性大肠埃希菌引起食物中毒病原学研究

目的:对一起食物中毒暴发流行的病原体进行分离鉴定和分子流行病学研究。方法:采集患者和厨工肛拭子、末梢水及物表涂抹拭子共90份。通过分离鉴定、生化试验和血清学试验,确定病原菌后采用实时荧光PCR方法分别检测病原菌毒力基因eaeAi、paHs、tl、ts、tx1与stx2存在情况。其中4株病原菌全基因组经限制性内切酶XbaI酶切后,通过PFGE获得电泳图谱并进行同源性分析。结果:90份标本中22份样品分离出携带eaeA基因的EPEC。BioNumerics分析结果显示4株EPEC PFGE带型完全相同,表明来源于同一克隆株。结论:这起食物中毒是由带eaeA基因非典型EPEC引起的暴发流行。     

河南省76株E.Coli O_(157):H_7菌株药物敏感性研究

目的探讨我省E.ColiO157:H7菌株的药物敏感性特点。方法美国疾病预防控制中心和WHO非洲区合作编写的“痢疾和霍乱流行的实验室诊断方法”中介绍的琼脂平板扩散法。结果76株E.ColiO157:H7菌株对庆大霉素、头抱噻甲羧肟、多粘菌素B、氯霉素、氟哌酸、阿莫西林六种抗生素的耐药率均<5%。有毒力菌株与无毒力菌株对庆大霉素、强力霉素、复方新诺明、氯霉素、四环素的耐药率差别有统计学意义,无毒力菌株的耐药率高于有毒力菌株。结论实验结果显示临床治疗可参考使用头抱类、喹诺酮类和氯霉素类抗生素。     

2种免疫层析技术用于4种传染病及其病原体检测的研究

[目的]寻求能够快速定性,定量检测4种传染病及其病原体的试验方法。[方法]应用双抗体夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测炭疽杆菌芽孢(以下简称炭疽芽孢)、鼠疫杆菌、肠出血性大肠埃希菌O_(157)：H_7(以下简称EHEC O_(157)),评价方法的灵敏性、特异性。通过分别检测模拟掺入3种菌/芽孢的“白色粉末”和检测3种细菌的强毒株,评价在实际环境样品检测中的应用。应用双抗原夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测鼠疫F1抗体、SARS病毒抗体,检测239份青海鼠疫疫区人员血清、1236份新疆鼠疫疫源地鼠血清,检测18份恢复期SARS病人血清和9份健康对照者血清,以及206份出入境健康人员血清,考核2种检测抗体的方法在实际样品检测中的应用。通过比较炭疽杆菌、鼠疫杆菌、大肠埃希菌O_(157)以及鼠疫杆菌抗体、SARS病毒抗体的胶体金免疫层析方法、UCP免疫层析方法,比较我们建立的2套系统与加拿大RAMP系统检测炭疽杆菌的能力。[结果]UCP免疫层析方法能在35min内完成检测,炭疽芽孢检测掺入“白色粉末”的样品灵敏性为1×10~4cfu/ test,炭疽芽孢最低检测限为1×10~5cfu/ml(原溶液芽孢浓度),多种不同的芽孢菌及其它细菌共38种54株检测说明该法特异性良好,仅与腊样芽孢杆菌有交叉反应,特异性为97％；鼠疫杆菌检测灵敏性为5×10~4cfu/ml,最低检测菌数为5×10~3cfu/test,在10~7cfu/ml水平上未发现与30余种细菌有交叉反应,包括最近缘假结核耶尔森菌；EHEC O_(157)检测灵敏性为1×10~3cfu/ml,仅与弗氏枸橼酸杆菌有交叉反应,特异性为98％。胶体金免疫层析方法能在10min内完成检测,炭疽芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O_(157)检测灵敏度分别为1×10~6cfu/ml、1×10~5cfu/ml、1×10~5cfu/ml,“白色粉末”等环境样品最低可检测敏感性为1×10~5cfu,1×10~4cfu,1×10~4cfu/test。胶体金免疫层析方法分别应用于炭疽、鼠疫强毒株的检测,检测限为5×10~4cfu/test和7×10~4cfu/test。在实际血清样品检测中,与间接血凝方法对比,鼠疫抗体UCP和胶体金免疫层析方法有更好的敏感性。血清样品检测显示,SARS抗体的胶体金和UCP免疫层析方法均有较好的特异性和敏感性。[结论]2种免疫层析方法都有快速、敏感、特异的特点：上转磷光免疫层析方法可实现定量检测,敏感性优于胶体金免疫层析法；炭疽检测与加拿大RAMP检测系统相当；胶体金免疫层析法具有简便、直观、易行的特点。2种免疫层析方法均适合于炭疽芽孢芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O_(157)、鼠疫杆菌抗体、SARS抗体的现场检测和筛查。