兔骨髓成骨样细胞体外培养及生物学特性观察

目的建立一种体外培养兔骨髓成骨样细胞的生物学模型,并对其生物学特性进行研究.方法抽取日本大耳兔骨髓液经离心得骨髓单个核细胞,以1×106/ml的细胞浓度进行培养,2周后得到贴壁生长的单层细胞.随后进入传代培养,通过倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜、HE染色、碱性磷酸酶染色后光镜观察及I型、Ⅲ型胶原检测等手段对所获得的细胞进行生物学特性研究.结果获得的成骨样细胞呈多种形态,有长短不一、粗细不匀、互相连接的胞质突起,可互相重叠呈复层生长.胞质丰富,富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等.细胞经连续传代,形态与功能不变.细胞富含碱性磷酸酶活性,I型胶原染色阳性,与典型成骨细胞的生物学特性相似.结论用兔骨髓基质细胞在体外能培养出成骨样细胞,为成骨细胞复合人工骨移植修复骨缺损提供了理论依据.     

骨髓基质细胞培养和体外成骨研究（摘要）

骨髓基质细胞培养和体外成骨研究（摘要）研究生刘劲松导师曾才铭，王宏邦，李世和（昆明医学院第一附属医院骨科，昆明６５００３１）关键词骨髓，基质细胞，细胞培养，成骨作用中图分类号Ｒ６０５将家兔和人的骨髓细胞进行体外培养。接种后的最初７２ｈ，培养物中以造血...     

成人骨髓基质细胞体外培养及鉴定

目的 :探讨简易的成人成骨细胞体外培养方法 ,为进一步研究成骨细胞及骨组织工程提供技术平台。方法:手术中抽取健康成人骨髓组织 ,采用全骨髓培养法在体外进行培养 ,细胞汇合后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C的条件培养基进行传代培养 ,观察细胞增殖和分化情况 ,并对细胞进行鉴定。结果:培养的成人成骨细胞表现出成骨细胞的形态特征 ,细胞碱性磷酸酶 (AL P)阳性率为 6 8% ,经 Von Kossa's染色证实其能最终形成钙结节。结论:全骨髓培养法所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

骨髓基质细胞及诱导成骨的研究进展

骨髓基质细胞（BMSCs）具有多分化潜能，近年来，组织工程中选择种子细胞的研究方兴未艾，由于BMSCs取材方便容易，扩增方法可靠，应用范围广泛及成骨确定且避免了免疫排斥问题，已成为最有前途的骨组织工程种子细胞。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的实验研究

目的：探讨兔骨髓基质干细胞的体外培养技巧,观察免骨髓基质干细胞的体外生长特性,为用于骨组织工程的功能细胞提供实验基础。方法：自兔髂骨抽取骨髓,分离骨髓基质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液进行培养,绘制细胞生长曲线,对细胞行碱性磷酸酶染色,计算细胞碱性磷酸酶染色阳性率,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果：第1-3代细胞生长曲线基本相同,加入矿化液后细胞生长速度明显减慢,但细胞表现出成骨细胞特性,其碱性磷酸酶染色阳性率大大提高,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论：兔骨髓基质干细胞在体外适当的培养条件下可以向成骨细胞方向分化,可作为骨组织工程的种子细胞．     

兔骨髓基质干细胞体外培养的实验研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（MSC）的体外分离、培养和增殖,探讨其生物学特性。方法：自兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离纯化MSC,并培养、增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点,绘制细胞生长曲线,同时计算贴壁率。结果：体外培养的兔MSC贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆;生长曲线为典型的S形曲线;MSC的贴壁率高,第3代培养14h贴壁率达90%以上。结论：用密度梯度离心法分离MSC是可行的。分离获得的MSC体外培养显示,MSC生长稳定,增殖速度快。MSC将是骨组织工程理想的种子细胞。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

人骨髓成骨细胞培养法的改良及其体外成骨能力

目的：探讨简便、易行的人达成骨细胞体外培养方法,研究骨髓基质在体外培养条件下的成骨能力。方法：抽取人骨髓组织,梯度离心后置于含１００ｍＬ／Ｌ小牛血清的ＤＭＥＭ培养液中,培养２４小时换液,稳定伟代后改用含地塞米松和β－甘油磷酸钠的条件增大２液,用倒置显微镜观察、组织化学染色、四环素荧光标记等方法进行观察。结果：传代细胞４天～５天即可传代,在条件培养液中２ＷＫ形成多层结构,并聚集成黑色结节。培养细胞Ａ     

骨髓基质细胞体外成骨的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞体外培养的成骨能力,为细胞移植修复骨缺损提供一条新途径。方法 取新西兰大白兔股骨大转子处骨髓,进行体外培养,纯化,10－14天后进行转代。培养后的细胞经倒置显微镜,透射地镜,钙染色,碱性磷酸酶染色等方法进行观察。结果 培养纯化后的细胞呈梭形,多角形,电镜显示具有分泌功能旺盛的结构,碱性磷酸酶染色强阳性,培养3－4周后,能形成钙结节。细胞在体外能多次传代,维持成骨表型。结论 骨髓基质细胞在体外培养纯化后,骨与成骨细胞相似的形态结构和生物学特性,能形成钙化的骨样组织。     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养的兔骨髓基质细胞生长特性的影响

目的：研究骨髓基质细胞（BMSC）在体外培养条件下分化为成骨细胞的能力,及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对其贴附、增殖、分化的影响。方法：将各组BMSC传代后加入bFGF,其浓度分别为0、5、10、50、100、200?ng/ml,用倒置相差显微镜、电镜、四唑盐比色法、碱性磷酸酶（ALP）染色、钙染色和电子探针等方法观察其形态、贴附、生长增殖活性、分化成熟和体外钙化的状况。结果：经10?ng/ml bFGF诱导后,BMSC贴附细胞数量明显增加。当100?ng/ml时,bFGF对BMSC的促增殖作用达到最大值。当加入bFGF时,ALP染色阳性率降低,当bFGF浓度为100?μg/L时阳性率最低（P<0.01）。传代细胞连续培养30?d后钙染色结果呈阳性,电子探针检测矿化区的Ca/P值与羟基磷灰石结晶中Ca/P值相符。电镜观察可见培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,并能产生胶原纤维。结论：BMSC在体外培养条件下具有分化为成骨细胞的能力,bFGF能够促进细胞的贴壁和增殖,但对其分化成熟具有抑制作用。     

骨髓基质细胞的体外培养和分化诱导

目的 :建立一种简单可靠的骨髓基质细胞 (BMSc)向成骨细胞转化的体外培养方法 ,探讨骨髓基质细胞向成骨细胞转化的机理。 方法:将兔 BMSc悬液进行体外培养 ,进行形态学观察和组织学检测。 结果:传代培养细胞的碱性磷酸酶 (AL P)阳性率达 80 %以上 ,表现为成骨细胞形态并形成钙结节。结论:地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C可促进 BMSc分化为成骨细胞 ,BMSc的分化和增殖是两个对立的状态。     

颗粒骨和块状骨对骨髓基质细胞作用的实验研究

目的 研究颗粒骨和块状骨在体外培养条件下对骨髓基质细胞的诱导作用。方法 将家兔的骨髓基质细胞进行体外培养，待其在培养瓶中铺成单层后，加入颗粒骨及块状骨，经活体相差显微镜观察、组织化学染色方法进行观测。结果 细胞培养2周后细胞分泌活动增强。经ALP染色发现，颗粒骨组阳性率明显高于块状骨组。HE染色发现，第2周时颗粒骨内细胞大部分存存，而块状骨内细胞已大部分死亡。结论 颗粒骨的诱导骨髓基质细胞向成骨细胞方向转化作用强于块状骨；颗粒骨的结构有利于骨内细胞的存活。     

低强度脉冲超声波对体外培养的兔骨髓基质细胞成骨作用的影响

目的：研究低强度脉冲超声波（LIPUS）对体外培养的兔骨髓基质细胞（BMSCs）成骨能力的影响。方法：抽取新西兰白兔的骨髓，体外分离纯化获取BMSCs，加入条件培养基后随机分为实验组和对照组；实验组应用LIPUS对BMSCs每天作用20min，对照组未予作用。通过倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况，分别于1、2、3周后停止LIPUS作用，应用碱性磷酸酶（ALP）和Von Kossa染色的方法鉴定细胞成骨性能。结果：BMSCs经LIPUS刺激后，细胞形态变大，核增大，核质比减小；而对照组细胞相对扁平，折光率降低。BMSCs经LIPUS刺激1、2、3周后，ALP活性均较对照组明显增高（P〈0．05）。LIPUS刺激3周后，实验组钙结节像素值较对照组像素值明显增多（P〈O．05）。结论：LIPUS能促进条件培养基中的BMSCs向成骨细胞转化。     

人骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的　探讨在骨组织工程研究中作为种子细胞来源之一的骨髓基质干细胞体外培养后的生物学特性 .方法　获取人胎儿骨髓于含 10 0 m L· L- 1 胎牛血清的 DMEM培养液中培养 ;将骨髓基质干细胞向成骨细胞方向进行诱导 ,2～ 3wk后行钙化结节 Vonkossa和碱性磷酸酶 (AL P)钙钴染色 ;同时绘制诱导前后细胞的生长曲线、测定细胞内 AL P含量变化 ,并做统计学分析 .结果　骨髓基质干细胞经诱导后增殖速度变慢 ,但合成 AL P的能力明显增强 (P<0 .0 5 ) ;Vonkos-sa和 AL P染色呈阳性 .结论　骨髓基质干细胞取材方便 ,易于诱导为成骨细胞 ,作为骨组织工程的种子细胞应用前景良好 .     

兔骨髓基质细胞组织工程骨治疗骨缺损的研究

目的 探讨应用自体骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨修复骨缺损的效果。方法 将免自体骨髓基质细胞经淋巴细胞分离液分离培养、传代扩增后，与胶原海绵混合培养后植于免挠骨干1．5cm缺损处。12周后处死动物，通过大体形态及x线、组织学检查进行评价。比较细胞和胶原海绵复合物移植与单纯胶原移植治疗骨缺损的疗效。结果 以组织工程骨移植于骨缺损处，骨缺损完全愈合，骨髓腔通畅。而单纯胶原移植对照组骨缺损未愈合，髓腔不通，与实验组有明显差别。结论 骨髓基质细胞是一种良好的骨源细胞，能定向分化成骨细胞，其成骨机制为膜内化骨和软骨内化骨。骨髓基质细胞作为种子细胞的组织工程骨前景乐观。     

BICC1对骨髓基质细胞定向分化的调控作用研究

目的:探讨BICC1在骨髓基质细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化过程中的作用。方法:构建Bicc1过表达质粒Bicc1-pcDNA3.1,以pcDNA3.1为对照,分别转染小鼠骨髓基质细胞ST2。对两组细胞进行成脂和成骨诱导,在成骨诱导14 d时碱性磷酸酶染色检测成骨分化情况,在成脂诱导5 d时利用油红O染色检测脂滴形成情况;采用qRT-PCR及Western blot技术检测细胞Bicc1过表达对成骨及成脂相关因子的影响。结果:酶切及测序结果显示Bicc1过表达质粒构建成功,将其转染到ST2细胞后,Bicc1 mRNA表达水平较对照组升高15.23倍（P＜0.05）。成骨诱导条件下,Bicc1过表达组ST2细胞碱性磷酸酶染色增强,成骨相关因子Osterix、碱性磷酸酶、Osteopontin、Runt相关转录因子2（Runx2）和骨钙素的mRNA和/或蛋白表达水平显著上升（均P＜0.05）。成脂诱导条件下, Bicc1过表达组ST2细胞中脂滴形成减少,油红OD520较对照组明显降低（P＜0.01）,成脂相关因子过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、脂肪酸结合蛋白（FABP4/aP2）和adipsin的mRNA及蛋白表达水平显著下降（均P＜0.05）。结论:BICC1可促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化。     

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞（BMSCs），诱导其向成骨细胞分化，初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs，DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养，部分传代细胞以含10mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察，VonKossa法染色检测体外矿化结节形成，细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性，体外矿化（骨样）结节的Von Kossa染色阳性；传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞．传代细胞具有较强的成骨潜能。