蛋白激酶C在软脂酸诱导HepG2细胞胰岛素抵抗中的作用

目的从蛋白激酶C(PKC)信号通路角度,探讨游离脂肪酸(FFA)引起肝脏胰岛素抵抗(IR)的可能机制。方法培养HepG2细胞,同时设立对照组、软脂酸(PA)组、高胰岛素组。软脂酸组、高胰岛素组分别用250μmol/L PA、5×10-7mol/L胰岛素处理24h。然后对照组、软脂酸组再根据胰岛素刺激前加( )与不加(-)PKC抑制剂白屈菜红碱盐酸盐(chelerythrine chloride,CC)5μmol/L预处理1h,随机分为两亚组:对照组(-)、对照组( )、PA组(-)、PA组( )。葡萄糖氧化酶法测定胰岛素刺激后12h葡萄糖消耗量,蒽酮法测定胰岛素刺激后3h点细胞内糖原含量,Western blotting技术检测15min点细胞内P-Ser473PKB、P-Ser21/9GSK-3α/β水平。结果PA组(-)与高胰岛素组葡萄糖消耗量无统计学差异(P=0.523)。葡萄糖消耗量、细胞内糖原含量、P-Ser473PKB、P-Ser21GSK-3α、P-Ser9GSK-3β水平均显示,PA组(-)与对照组(-)比较显著降低(P值依次为0.000,0.000,0.004,0.004,0.028),对照组( )与对照组(-)比较略有升高但无显著性差异;PA组( )与PA组(-)比较显著升高(P值依次为0.000,0.014,0.043,0.041,0.035)。结论PA(250μmol/L)体外成功诱导了HepG2细胞产生IR,PKC信号通路在FFA引起肝脏IR中起着重要作用。     

胰岛素抵抗HepG2细胞模型的建立及鉴定

目的 建立呈胰岛素抵抗的ＨｅｐＧ２细胞模型。方法 将ＨｅｐＧ２细胞置于１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ胰岛素培养液中２４小时,使ＨｅｐＧ２细胞胰岛素受体充分下调,检测燕比较下调和未下调的ＨｅｐＧ２细胞,糖,脂类代谢水平,发现：下调ＨｅｐＧ２细胞胰岛素受体减少了５６％,将ＤＲ－ＨｅｐＧ２细胞于不同浓度胰岛素培养液中,胰岛素受体数 明显减少,当培养液中胰岛素的浓度为１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ时,ＤＲ－ＨｅｐＧ２细胞胰岛     

花生四烯酸改善饱和脂肪酸诱导肝细胞胰岛素抵抗的作用机制

目的探讨花生四烯酸（AA）改善软脂酸（PA）诱导的肝细胞胰岛素抵抗（IR）的作用机制。方法分别用0.25 mmol/L PA和PA＋50μmol/L AA与HepG2细胞共同培养24 h,并设正常对照组。测定每组在有无胰岛素刺激时及胰岛素刺激情况下加和不加入PI3K抑制剂WT或PKC抑制剂CC时细胞内糖异生限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性和胰岛素受体底物2（IRS-2）蛋白水平。结果PA组基础及胰岛素刺激的PEPCK活性比对照组和PA＋AA组明显升高,IRS-2蛋白下降（P〈0.05）。加入WT与否,对照组和PA＋AA组PEPCK活性、IRS-2蛋白水平有明显差异（P〈0.05）;加入CC与否,对照组和PA＋AA组IRS-2蛋白水平有明显差异（P〈0.05）;PA组均无变化。结论肝细胞IR时,胰岛素信号转导通路的PI3K途径和PKC通路可能存在严重障碍。AA通过纠正异常的糖代谢关键酶活性和胰岛素信号蛋白量,改善胰岛素信号转导通路缺陷,缓解PA引起的IR。     

抵抗素对HepG2肝细胞胰岛素信号通路IRS-2/Akt的影响

目的探讨抵抗素对HepG2肝细胞中胰岛素信号通路IRS-2/Akt的影响及其与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路之间的关系。方法50 ng/ml重组人抵抗素处理肝HepG2细胞株,siRNA技术抑制HepG2细胞AMPKα2亚基表达,采用实时RT-PCR技术检测胰岛素信号通路相关细胞信号抑制因子3(SOCS-3)和胰岛素受体底物2(IRS-2)mRNA的水平,采用蛋白印迹技术检测蛋白激酶B(Akt)的蛋白含量及磷酸化水平。结果在基础及胰岛素刺激状态下,抵抗素上调SOCS-3 mRNA的表达(P0.05),下调IRS-2 mRNA的表达(P0.05),仅在胰岛素刺激状态下降低Akt总蛋白含量及其磷酸化水平(P0.05),且未转染与转染AMPKα2 siRNA组比较,Akt总蛋白含量及其磷酸化水平差异无统计学意义(P0.05)。结论抵抗素对HepG2细胞胰岛素信号通路IRS-2/Akt起抑制作用,这可能是其导致肝脏胰岛素抵抗的机制之一;抵抗素对IRS-2/Akt信号通路与AMPK通路的影响可以相互独立。     

大黄蒽醌类化合物对HepG2细胞内胰岛素信号通路的激活及其机制

目的 探讨大黄蒽醌类化合物在有或无胰岛素抵抗的情况下是否能激活人肝癌细胞(HepG2)胰岛素信号通路。方法 通过噻唑蓝比色法(MTT法)测定细胞活性,利用醛固酮(ALD)构建HepG2细胞胰岛素抵抗模型,考察2.5～20μmol/L浓度的大黄蒽醌类化合物(大黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素)能否激活HepG2细胞胰岛素信号通路。利用葡萄糖含量检测试剂盒检测细胞葡萄糖,利用糖原含量检测试剂盒检测细胞糖原,通过Western blot检测细胞中磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B((p-Akt/Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β/糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β/GSK-3β)蛋白表达。采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。根据数据类型,分别采用t检验或方差分析进行组间比较。结果 2.5～20μmol/L浓度的大黄蒽醌类化合物(大黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素)对HepG2细胞的存活率无显著影响(P>0.05)。然而,有或无胰岛素抵抗的情况下均能增加p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值(P<0.05)。进一步研究还发现大黄酸、大黄酚、大黄素处理组的葡萄...     

褪黑素对软脂酸诱导L02细胞胰岛素抵抗的防护作用及机制

目的探讨褪黑素(MT)对软脂酸(PA)诱导L02细胞胰岛素抵抗的防护作用及机制。方法培养L02细胞,分别设立对照组(BSA组)、PA组、PA+MT组、PA+维生素C(Vit C)组。各组药物浓度和孵育时间根据不同的实验需要来确定。用荧光比色法测定各组细胞胞内氧自由基(ROS)水平,Western印迹法检测胰岛素刺激后胞内胰岛素信号蛋白磷酸化水平,包括Y-p-胰岛素受体(IR)、Y-p-胰岛素受体底物(IRS)1/2以及应激敏感激酶p-JNK水平。结果用不同浓度的PA处理L02细胞24 h,细胞内ROS生成量呈现明显的浓度依赖关系,差异有统计学意义(P<0.05);用0.3 mmol/L的PA处理L02细胞不同时间,细胞内ROS生成量存在明显的时间依赖关系,在24 h达到最高,并在36 h后仍维持较高水平(P<0.05);与BSA组相比,PA组ROS含量明显升高(P<0.05)PA+MT组ROS含量无明显变化(P>0.05);PA+MT组ROS生成量明显低于PA组(P<0.05)。PA+Vit C组与PA组相比,ROS的生成量减少,但仍高于PA+MT组(P<0.05)。与BSA组相比,PA组Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平减少,而p-JNK磷酸化水平升高;与PA组相比,PA+MT组Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平显著升高,p-JNK磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结论 PA导致细胞内ROS增加,MT能够清除PA产生的过量ROS。MT通过减少JNK的活化,改善因ROS引起的胰岛素信号传递损伤,对PA诱导的胰岛素抵抗具有防护作用。     

胰岛素抵抗状态下HepG2细胞纤维蛋白溶解酶原激活物抑？…

目的 观察胰岛素、胰岛素原对ＨｅｐＧ２细胞纤维蛋白溶解酶原激活物抑制物－１（ＰＡＩ－１）基因表达的影响。方法 将ＨｅｐＧ２细胞置于１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ胰岛素培液中２４小时使胰素受体下调将ＨｅｐＧ２细胞导成为胰岛素抵抗的ＨｅｐＧ２细胞,然后分别用胰岛素、胰岛素原（１０＾－９ｍｏｌ／Ｌ）持续刺激ＨｅｐＧ２细胞２４小时,检测培养液中ＰＡＩ的活性、含量及胞浆中ＰＡＩ－１ｍＲＮＡ水平。结果（１）基因状态下胰     

抵抗素基因转染诱导肝性胰岛素抵抗细胞的鉴定

目的 将编码人抵抗素基因的pcDNA 3.1(+)真核表达载体在HepG2肝癌细胞中进行稳定转染,以建立抵抗素诱导的肝性胰岛素抵抗细胞模型.方法 实验分3组:HepG2细胞组;空质粒组;抵抗素基因转染组,通过免疫细胞化学和RT-PCR方法 进行抵抗素基因和蛋白表达鉴定,用微量化的葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的摄取作用.结果 免疫细胞化学染色结果 表明:与对照组比较,抵抗素基因转染组抵抗素蛋白平均光密度值显著升高(P＜0.01);而空质粒组无显著差异(P＞0.05).RT-PCR扩增产物电泳表明:抵抗素基因转染组有目的 条带出现,而对照组和空质粒组无目的 条带出现,细胞葡萄糖摄取实验表明:抵抗素基因转染细胞对葡萄糖摄取作用下降.结论 过度表达人抵抗素基因的胰岛素抵抗的肝细胞建模成功.     

游离脂肪酸与胰岛素抵抗、胰岛B细胞功能障碍述要

游离脂肪酸在糖耐量异常和2型糖尿病发生中发挥着重要作用.现就游离脂肪酸增多与胰岛素抵抗和胰岛B细胞功能障碍关系进行综述.     

高浓度胰岛素、葡萄糖对HepG2细胞蛋白激酶C活性的影响

研究高浓度胰岛素,葡萄糖对ＨｅｐＧ２细胞蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）活性的影响。方法建立具胰岛素抵抗特性受体下调的ＨｅｐＧ２（ＤＲ－ＨｅｐＧ２）细胞模型,测定１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ胰岛素、２５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖对未处理ＨｅｐＧ２（ＮＤＲ－ＨｅｐＧ２）细胞和ＤＲ－Ｈ细胞膜ＰＫＣ、胞浆ＰＫＣ活性的影响。结果ＤＲ－ＨｅｐＧ２细胞未受高浓度胰岛素、葡萄糖刺激时膜和胞浆ＰＫＣ活性均高于ＮＤＲ－ＨｅｐＧ２细胞（Ｐ〈０．     

游离脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制

目的研究游离脂肪酸（FFA）对3T3-L1脂肪细胞IKKβ及胰岛素信号转导蛋白的影响,探讨FFA诱导胰岛素抵抗（IR）的分子机制。方法诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞与0.3-1.0mmol/L的软脂酸（PA）培养6-24h,以2-脱氧-〔^3H〕-D-葡萄糖摄入法观察葡萄糖的转运率,用Western blot检测IKKβ蛋白、IKKβ Ser181磷酸化、IRS-1蛋白、IRS-1 Ser307磷酸化、PI3Kp85蛋白及GluT4蛋白的表达。结果0.3-1.0mmol/LPA作用6-24h后,3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗明显减少,同时,Western blot显示,PA对IKKβ及GluT4蛋白的表达无明显影响,却能明显增加IKKβ Ser181及IRS-1 Ser307磷酸化,同时减少IRS-1蛋白和PI3Kp85蛋白的表达。结论FFA可以诱导IR,其分子机制可能与FFA激活IKKβ,使IRS-1丝氨酸残基磷酸化增加而酪氨酸残基磷酸化减少,进而使其下游的PI-3Kp85蛋白表达减少抑制葡萄糖转运有关。     

Urotensin Ⅱ-induced insulin resistance is mediated by NADPH oxidase-derived reactive oxygen species in Hep G2 cells

AIM: To investigated the effects of urotensin Ⅱ(UII) on hepatic insulin resistance in Hep G2 cells and the potential mechanisms involved.METHODS: Human hepatoma Hep G2 cells were cultured with or without exogenous UII for 24 h, in the presence or absence of 100 nmol/L insulin for the last 30 min. Glucose levels were detected by the glucoseoxidase method and glycogen synthesis was analyzed by glycogen colorimetric/fluorometric assay. Reactive oxygen species(ROS) levels were detected with a multimode reader using a 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe. The protein expression and phosphorylation levels of c-Jun N-terminal kinase(JNK), insulin signal essential molecules such as insulin receptor substrate-1(IRS-1), protein kinase B(Akt), glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β), and glucose transporter-2(Glut 2), and NADPH oxidase subunits such as gp91 phox, p67 phox, p47 phox, p40 phox, and p22 phox were evaluated by Western blot.RESULTS: Exposure to 100 nmol/L UII reduced the insulin-induced glucose consumption(P 0.05)and glycogen content(P 0.01) in Hep G2 cells compared with cells without UII. UII also abolished insulin-stimulated protein expression(P 0.01) and phosphorylation of IRS-1(P 0.05), associated with down-regulation of Akt(P 0.05) and GSK-3β(P 0.05) phosphorylation levels, and the expression of Glut 2(P 0.001), indicating an insulin-resistance state in Hep G2 cells. Furthermore, UII enhanced the phosphorylation of JNK(P 0.05), while the activity of JNK, insulin signaling, such as total protein of IRS-1(P 0.001), phosphorylation of IRS-1(P 0.001) and GSK-3β(P 0.05), and glycogen synthesis(P 0.001) could be reversed by pretreatment with the JNK inhibitor SP600125. Besides, UII markedly improved ROS generation(P 0.05) and NADPH oxidase subunit expression(P 0.05). However, the antioxidant/NADPH oxidase inhibitor apocynin could decrease UII-induced ROS production(P 0.05), JNK phosphorylation(P 0.05), and insulin resistance(P 0.05) in HepG 2 cells. CONCLUSION: UII induces insulin resistance, and this can be reversed by JNK inhibitor SP600125 and antioxidant/NADPH oxidase inhibitor apocynin targeting the insulin signaling pathway in HepG 2 cells.     

老年代谢综合征患者血清游离脂肪酸与胰岛素抵抗的相关性研究

目的探讨老年代谢综合征（MS）患者中血清游离脂肪酸（FFA）水平与胰岛素抵抗（IR）的相关性。方法选取2009年1月至2010年6月上海交通大学附属第一人民医院老年科住院患者96例,年龄≥65岁。采用2005年国际糖尿病联盟提出的标准,分为MS组38例及非MS组58例,分别检测血清FFA、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆同醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）,用稳态模式（HOMAModel）公式计算HOMA—IR评估胰岛素抵抗。分别测各组体重、腰围、身高,计算体质指数（BMI）。结果1、MS组的身高、体重、腰围、BMI、FBG、FINS及HOMA—IR、TC、HDL—C、TG水平均高于非MS组（P〈0．01）,MS组的FFA水平高于非MS组（P〈0．01）;2、直线相关分析显示在MS组中FFA水平与FBG、FINS、HOMA-IR呈正相关（P〈0．05）;3、多元逐步回归分析结果显示FFA与HOMA—IR独立相关（P〈0．05）。结论老年MS患者FFA升高,FFA水平与m存在相关性,FFA是老年MS患者IR的独立危险因素。     

胰岛素抵抗肝癌细胞IGF-1R/NF-κB表达及多药耐药机制研究

目的 探讨胰岛素抵抗（IR）肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）和核因子-κB（NF-κB）表达变化及多药耐药（MDR）发生机制。方法 采用高浓度胰岛素诱导人肝癌细胞（HepG2和HepG2.2.15）建立胰岛素抵抗（IR）细胞模型。采用Western blot 法检测胰岛素受体（InsR）、IGF-1R、NF-κB 和 P-糖蛋白（P-gp）表达变化。使用流式细胞仪（Annexin V-FITC法）检测阿霉素对细胞凋亡的影响。结果 分别用100 nmol/L 和 1 000 nmol/L 胰岛素培养 HepG2 和 HepG2.2.15 细胞 48 h,成功建立 IR 肝癌细胞模型;IR 肝癌细胞 IGF-1R、NF-κB、P-gp 表达上调,而InsR 表达下调;应用 25μg/mL 阿霉素作用细胞 24 h 后,IR-HepG2 细胞组凋亡率（31.1%±1.9%）显著低于HepG2 细胞组【（49.7%±2.2%）,P＜0.01】,IR-HepG2.2.15细胞凋亡率【（20.1±1.7） %】显著低于 HepG2.2.15 细胞【（33.8±1.8）%,P＜0.01】;HepG2.2.15 和 IR-HepG2.2.15 细胞凋亡率分别较 HepG2 和 IR-HepG2 细胞显著降低（P＜0.01）。结论 IGF-1R/NF-κB/P-gp 过表达可能介导 IR 肝癌细胞对阿霉素的多药耐药。     

Resistin induces insulin resistance by both AMPK-dependent and AMPK-independent mechanisms in HepG2 cells

Resistin is a 12.5-KDa cysteine-rich peptide that has been implicated in the impairment of glucose homeostasis via the AMP-activated protein kinase (AMPK) pathway in a rodent model. However, the role resistin plays in humans is controversial. This study investigated the effect of resistin on glucose metabolism and insulin signaling using human recombinant resistin and small interfering RNA (siRNA) against AMPKα2 to treat the human liver HepG2 cells. The mRNA of key genes involved in glucose metabolism and the insulin-signaling pathway were detected by real-time RT-PCR. Phosphorylation levels of Akt and AMPK were measured by western blot. The incorporation of D-[U–¹⁴C] glucose into glycogen was quantitated by liquid scintillation counting. The results demonstrate that resistin stimulated expressions of glucose-6-phosphatase (G6Pase), phosphoenolypyruvate carboxykinase (PEPCK), and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS-3), repressed the expressions of insulin receptor substrate 2(IRS-2) and glucose transporter 2(GLUT2). In addition, resistin inhibited the insulin-induced phosphorylation of Akt independent of AMPK. In conclusion, our findings suggest that resistin induces insulin resistance in HepG2 cells at least partly via induction of SOCS-3 expression and reduction of Akt phosphorylation through an AMPK-independent mechanism. Resistin also increases glucose production via AMPK-mediated upregulated expression of the genes encoding hepatic gluconeogenic enzymes, G6Pase, and PEPCK.     

间歇低氧对大鼠胰岛素抵抗及骨骼肌细胞GLUT4、Akt2的影响

目的 检测不同间歇低氧暴露时间对骨骼肌葡萄糖转运蛋白(GLUT)4与蛋白激酶B(PKB/Akt)2表达的影响,探讨二者在间歇低氧导致胰岛素抵抗中的作用.方法 选取健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只,按照随机数字表法分为5组:常氧对照组(NC组),间歇低氧2周组(IH2组),间歇低氧4周组(IH4组),间歇低氧6周组(IH6组),间歇低氧8周组(IH8组),每组8只.IH2组、IH4组、IH6组、IH8组每天给予8h间歇低氧暴露(9:00～17:00),NC组室内环境正常饲养.检测各组空腹血糖和空腹胰岛素水平,计算稳态模型评估-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR).采用免疫组织化学法检测大鼠骨骼肌GLUT4及Akt2蛋白的表达,蛋白表达量用平均灰度值表示,并分析GLUT4与Akt2的相关性.结果 与NC组相比,IH2组、IH4组、IH6组、IH8组空腹血糖、HOMA-IR升高,骨骼肌GLUT4与Akt2灰度值升高,并且随间歇低氧暴露时间的延长而升高明显(F =87.67～288.63,P均＜0.05);与NC组相比,IH2组、IH4组、IH6组、IH8组空腹胰岛素升高,其中IH2组、IH4组、IH6组,随间歇低氧暴露时间的延长而升高明显,IH8组较IH6组下降(F=86.04,P＜0.01).Pearson相关分析显示GLUT4与Akt2的表达呈正相关(r=0.895,P ＜0.05).结论 随着间歇低氧暴露时间的延长胰岛素抵抗程度增加,GLUT4与Akt2蛋白表达水平下降,二者在间歇低氧导致胰岛素抵抗的过程中起协同作用.     

线粒体融合蛋白2改善高脂诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗机制的研究

目的 探讨线粒体融合蛋白2 （Mfn2）是否通过减轻氧化应激改善大鼠骨骼肌细胞IR.方法 建立高脂诱导骨骼肌细胞IR模型（PA组）,以Mfn2基因重组腺病毒转染细胞（PMfn2组）,观察细胞内葡萄糖摄取率、超氧化物歧化酶总活力（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、活性氧簇（ROS）及MDA的改变. 结果 （1）与正常对照（NC）组相比,高脂（PA）组葡萄糖摄取率降低（P＜0.01）,T-SOD及CAT活性降低,ROS、MDA含量增加（P＜0.05）;（2）与PA组相比,Mfn2基因重组腺病毒转染（PMfn2）组T-SOD及CAT活力均增加（P＜0.05）;ROS水平、MDA含量降低（P＜0.05）;GSH-Px活力无明显改变. 结论 上调高脂干预后骨骼肌细胞的Mfn2水平可减轻细胞氧化应激,改善IR.