Smad4基因沉默促进PanIN裸鼠移植瘤增殖和微血管形成的研究

背景与目的:由已建立的小鼠基因打靶模型证实,K-ras突变启动了胰腺癌前病变一胰腺腺管内上皮瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN),p53或p16失活均可单独促进小鼠PanIN发展为浸润性胰腺癌.作为人胰腺癌中另一失活频率高发的抑癌基因Smad4,其失活对PanIN的转化作用及是否可单独促进PanIN发展为胰腺癌目前仍不清楚.基于此目的,在已成功分离建立K-ras突变启动的PanIN细胞株基础上,本研究拟进一步应用RNA干扰技术沉默PanIN细胞株中内源性Smad4表达,以探讨siRNA干扰Smad4基因对PanIN细胞恶性转化作用.方法:构建Smad4基因沉默慢病毒质粒,筛选Smad4沉默稳转细胞并命名为PanIN-S细胞;分别用PanIN和PanIN-S细胞并采用皮下接种的方法,构建获得PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型(每组5只),2周后测定各组肿瘤体积和质量;应用免疫组织化学SP法检测并比较各组增殖细胞核抗原(PCNA)和CD31的表达及其差异.结果:成功构建了Smad4基因SiRNA体系;与未干扰PanIN细胞组相比,PanIN-S组裸鼠肿瘤体积和质量显著增加(P<0.05);组织病理学检查,符合胰腺癌(腺癌);免疫组织化学结果显示PCNA和CD31表达显著增高(P<0.05).结论:Smad4基因沉默可促使在K-ras突变基础上的小鼠PanIN细胞的恶性转化;裸鼠移植瘤中Smad4失活可显著促进小鼠移植瘤增殖和肿瘤微血管形成,这些可能是其致瘤恶性转化的重要作用机制.     

胰腺腺管内上皮瘤的分子遗传学研究进展

胰腺腺管内上皮瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)是近几年提出的新术语,并被认为是胰腺癌的癌前病变,近年来随着PanIN转基因动物模型的建立,对其诸多方面的认识向前推进了一大步,尤其是对其分子生物学行为的认识也在逐渐深入,发现K-ras、p53、p16、Smad4等主要分子遗传学事件异常与PanIN及胰腺癌的恶性转化密切相关.为此深入研究胰腺癌癌前病变PanIN的分子遗传学事件异常是发现胰腺癌新肿瘤标志物及早期诊断,并最终有效治疗或控制胰腺癌的关键,同时亦是近几年研究的热点与难点之一.本文从PanIN的起源、形态学变化和分子遗传学异常等方面做一简要概括.     

Smad4静默前后PanIN细胞基因芯片检测及表达谱的研究

背景与目的:由己建立的小鼠基因打靶模型证实,K-ras突变启动了胰腺癌前病变即胰腺导管上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN),Smad4基因失活可促使PanIN细胞恶性转化.PanIN细胞中Smad4基因静默后其下游基因表达将如何改变及促使PanIN细胞恶性转化,目前尚不清楚.基于此目的,我们在己成功分离建立K-ras突变启动的PanIN细胞,并应用siRNA干扰技术静默PanIN细胞株中内源性Smad4表达的基础上,应用全基因表达谱芯片研究Smad4基因静默前PanIN细胞与其静默后PanIN-S细胞基因表达谱的变化.方法:应用包含41174个小鼠基因转录本Agi lent小鼠4×44K全基因芯片检测Smad4基因静默前后PanIN细胞基因表达谱变化,分析差异表达基因,并选择其中有差异表达的部分基因进行实时荧光定量多聚酶链反应(Real-time PCR)验证.结果:基因芯片筛选出差异倍数2倍以上的差异表达基因,如Fut9、CXCR4、MMP2、PIK3C2G、Cplx4、Lemdl、TIMP4、Reln和PITX2等.Real-time PCR验证差异表达基因CXCR4、MMP2、PIK3C2G、TIMP4、PITX2与基因芯片结果一致.结论:Smad4基因静默前后PanIN细胞中CXCR4、MMP2、PIK3C2G、TIMP4、PITX2基因表达存在显著差异,其中CXCR4、PIK3C2G基因可能与胰腺肿瘤新生血管形成相关,MMP2、TIMP4基因可能与胰腺肿瘤细胞黏附、浸润、迁移相关,PITX2表达高低可能与胰腺肿瘤预后相关.     

合并慢性胰腺炎的胰腺癌癌旁增生性胰管上皮细胞线粒体DNA突变的意义

目的 探讨合并慢性胰腺炎的胰腺癌癌旁增生性胰管上皮细胞线粒体DNA调控序列（D—loop）突变的意义。方法 利用PCR技术,扩增胰腺导管增生性细胞、癌细胞及其各自正常的胃黏膜上皮细胞的线粒体DNA D—loop。核苷酸序列同源性对比分析,观察病变细胞的D-loop突变频率。结果 癌细胞和增生性病变细胞至少存在一个以上的突变点,总突变点为31。突变类型：线粒体DNA 11／12为同质性突变,1／12为异质性突变。D—loop突变频率随病变进展程度呈进行性增加的趋势,异常D—loop由PanIN1的33．3％增加到PanIN3的75,0％（P〈0．01）。结论 胰腺导管上皮细胞病变存在着异常D—loop,D—loop异常程度与病变发展程度呈平行性发展。异常D-loop可作为检测胰腺导管上皮性细胞病变的标志物。     

肥胖小鼠胰腺组织肿瘤相关基因突变频率的分析

目的：检测肥胖小鼠胰腺组织中癌基因Kras,抑癌基因Trp53、Smad4的突变,初步探讨肥胖与胰腺组织肿瘤相关基因突变的关系。方法：将雄性C57BL/6小鼠分为两组,分别以普通食物和高脂食物饲养24周,测量其体质量、进食量、体成分和血脂水平。提取高脂食物组小鼠胰腺组织的DNA,设计引物并通过高保真DNA聚合酶扩增Kras基因第2外显子,Trp53基因第8外显子,Smad4基因第9外显子的基因片段,进行DNA测序。通过实时荧光定量PCR（qPCR）和免疫组化方法检测细胞增殖标志基因Ki67在胰腺内的表达水平。结果：24周高脂食物饲养引起小鼠肥胖。与普通食物组相比,高脂食物组小鼠的体质量、摄入单位质量饲料的体质量增长量、体脂质量、肝体比、附睾脂肪脂体比均显著增高（P均 < 0.05）,血浆中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平也显著上升（P < 0.05）。qPCR结果显示,高脂食物组小鼠胰腺组织Ki67 mRNA的水平显著升高（P < 0.05）。免疫组化结果显示,高脂食物组小鼠胰腺内存在多个Ki67阳性的胰腺导管细胞,提示胰腺细胞增殖活性升高。同时,检测到胰腺癌促癌基因Kras在肥胖小鼠中Kras基因CDS序列的第96位碱基由T突变为C（突变频率为2%）。结论：肥胖可能会增加胰腺组织中Kras基因的不稳定性,从而起到促进胰腺癌发生、发展的作用。     

MUC1在胰腺肿瘤中的表达及意义

目的探讨MUC1 在胰腺上皮内肿瘤、胰腺导管腺癌组织中的表达及其在胰腺癌早期诊断中的意义.方法应用免疫组化技术检测30例胰腺上皮内肿瘤（PanIN）、52例胰腺导管腺癌和10例正常胰腺组织中MUC1的表达.结果 3例PanIN1-2组织中MUC1阳性表达3/18（16.7%）,7例PanIN-3组织中MUC1阳性表达7/12（58.3%）,PanIN-3与PanIN1-2阳性表达率比较差异有显著意义（P=0.024,P〈0.05）.40例胰腺导管腺癌组织中MUC1阳性表达40/52（76.9%）, MUC1阳性表达与性别、肿块大小无关（P〉0.05）,与侵袭状况、淋巴结转移、肝转移有关（P〈0.05）;结论 MUC1可作为胰腺癌早期辅助诊断指标, 有可能成为胰腺癌免疫治疗的靶抗原.     

Rap1GAP1在人胰腺癌组织中的表达及意义

目的通过检测Rap1GAP1在人胰腺癌中的表达情况及rap1GAP1在三种人胰腺癌细胞系中的突变情况,探讨其在人胰腺癌发生发展过程中的作用。方法(1)采用免疫组织化学Envision两步法,检测73例人胰腺癌组织及其癌旁胰腺组织中Rap1GAP1的表达情况,并分析其与胰腺癌临床病理特征之间的关系;(2)采用RT-PCR和测序法检测三种人胰腺癌细胞系中rap1GAP1的突变情况。结果(1)Rap1GAP1在癌旁胰腺组织、胰腺上皮内肿瘤(pancreatic intraepithelialneoplasia,PanIN)1a、1b、2及3级和浸润性胰腺癌中的阳性率分别为100%、93.8%、92.3%、70.0%、57.9%和13.7%。癌旁胰腺组织、各级PanIN与浸润性癌之间的表达差异有统计学意义(P<0.01);Rap1GAP1在高、中和低分化胰腺癌中阳性率分别为26.9%、7.1%和0,显示Rap1GAP1的表达与胰腺癌的分化程度有关(P<0.05)。而Rap1GAP1的表达与患者的年龄、性别、淋巴结转移情况和临床分期无关。(2)Panc-1、MiaPaCa-2细胞系中存在rap1GAP1关键区域(催化结构域)的大片段缺失,而Aspc-1细胞系含有完整的编码rap1GAP催化结构域的外显子。结论相比于癌旁胰腺组织和各级PanIN,浸润性胰腺癌中 Rap1GAP1的表达显著降低。另外,Rap1GAP1在低分化胰腺癌中的表达显著降低。提示Rap1GAP1可能是胰腺癌发生发展过程中的一个晚期事件。三种人胰腺癌细胞系中的突变分析结果提示其表达降低可能与遗传学上的大片段缺失有关。     

TGF-β1长期诱导胰腺癌细胞发生上皮间质变而增加其侵袭性

目的：研究TGF-β1对胰腺癌细胞侵袭性的的影响以及上皮间质变（EMT）在其中起的作用。方法：以TGF-β1长期刺激胰腺癌细胞BxPc-3，从形态学动态观察癌细胞变化，同时以RT—PCR动态测定与侵袭性有关的指标E—caderin，N—caderin等的表达，以明确TGF-β1诱导癌细胞上皮间质变的能力及探索引出的条件，同时以Transwell侵袭试验验证上皮间质变对胰腺癌细胞侵袭性的作用。结果：TGF-β1（10ng／m1）长期刺激下（约7天后）胰腺癌细胞发生上皮间质变，细胞形态由上皮形转为单个分散的梭样间质细胞形，同时E—caderin表达逐渐下降，而N—caderin表达未见明显变化；transwell侵袭试验也证实胰腺癌细胞侵袭性和所受TGF—β1刺激时间呈正比，不同刺激时间的癌细胞侵袭率之间有显著差异，证明TGF-β1影响时间越长，胰腺癌细胞侵袭性越强。结论：TGF-β1有增加胰腺癌细胞侵袭性的作用，该作用很有可能是通过上皮间质变而产生，而这一作用需要较长时间的持续刺激。同时钙粘连蛋白的变化是重要的分子学机制之一。     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53cDNA真核细胞表达载体pEGFP-p53(RS)和pEGFP-p53(AS)。用Lipofectin介导转染801D细胞。PCR检测外源p53和neo基因，荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白，免疫组化染色检测突变蛋白表达。比较pEGFP-p53(AS)-801D和pEGFP-p53(RS)-801D的集落形成试验和裸鼠移植试验，用流式细胞术分析细胞周期。结果 PCR检测出外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，免疫组化检测示pEGFP-p53(AS)-801D突变蛋白呈阴性，母系为阳性，表明反义p53能封闭突变p53蛋白表达，pEGFP-p53（RS）-801D和pEGFP-p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤性均降低，pEGFP-p53(RS)-801D更为明显。pEGFP-p53(AS)-801D细胞周期阻滞于G1期。结论 在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要的作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可恢复重建其功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

Syk在不同组织来源的人腺上皮恶性肿瘤中的表达

目的：探讨不同组织来源的人腺上皮恶性肿瘤细胞中Syk的表达,分析其临床意义。方法：应用免疫组织化学染色法分别检测7种人腺上皮恶性肿瘤细胞株、30例人乳腺癌组织及其35例人胰腺癌组织中Syk的表达。结果：人乳腺癌细胞株MCF-7中Syk表达阳性,MDA-MB-231则表达阴性；人胰腺癌细胞株PANC-1、SW1990和Canpan-2,人肺腺癌细胞株GLC-82和肝癌细胞株SMMC-7721中Syk均表达阳性。30例乳腺癌组织及其癌旁正常组织中Syk表达阳性率分别为60% (18/30)和90%(27/30),两者之间有显著性差异(P＜0．01)。22例胰腺癌组织及其癌旁正常组织中Syk表达阳性率分别54．5%(12/22)和86．3%(19/22),两者之间有显著性差异(P＜0．01)；13例经术前化疗的胰腺癌组织及其癌旁正常组织中Syk表达阳性率分别为69．2%(9/13)和92．3%(12/13),两者之间有显著性差异(P＜0．01)。结论：Syk在所检测的不同组织来源的人腺上皮恶性肿瘤细胞株中绝大部分(6/7)呈阳性表达；Syk蛋白在乳腺、胰腺正常组织中高表达,在相应肿瘤组织中低表达或不表达的特性,Syk有可能成为乳腺癌患者的预后判定、治疗计划的制定等较为特异性指标。