骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

骨形态发生蛋白-7基因转染骨髓基质细胞后的表达

为了观察重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）后的表达及表达产物对BM-SCs增殖的影响，用脂质体介导法将rhBMP-7基因转染BMSCs，用逆转录PCR技术和免疫组化SABC法分别检测其瞬时表达和稳定表达；再用^3H-TdR掺入法检测基因表达产物对正常培养的BMSCs增殖的影响。结果表明：转基因细胞能高效表达外源基因，且表达时间长达4周；基因表达产物能明显促进BMSCs的增殖。该结果为基因增强的组织工程技术用于关节软骨缺损的修复提供了理论依据。     

重组骨形态发生蛋白—7基因转染软骨细胞的实验研究

目的：研究外源性人重组骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因在转染的软骨细胞中的表达情况。方法：用脂质体介导法将rhBMP-7转入兔关节软骨细胞,分别用免疫组化染色和逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）检测其表达,同时用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT法）检测了表达产物的活性。结果：48h后转染的软骨细胞有明显的pcDNA3-rhBMP7基因表达,转染细胞的表达产物对正常软骨细胞的增殖有显著的促进作用。结论：外源性rhBMP-7基因可在软骨细胞中获得高效表达,这为关节疾病的基因治疗提供了理论基础。     

骨形态发生蛋白2基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：评价携带骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2）转染人骨髓间充质干细胞（MSC）对其成骨分化的影响。方法：由健康青年男性髂骨抽取骨髓培养MSC，BMP-2基因转染后，用RT-PCR及免疫组化染色证实转基因MSC的BMP-2基因表达，原位杂交及免疫组化染色检测转染后细胞成骨活性，并进行透射电镜观察。结果：转染后细胞稳定表达BMP-2基因，核心结合因子a1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈阳性表达，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：Ad—BMP-2基因转染可以提高MSC的体外成骨能力。     

兔骨折骨痂中骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子基因的表达

兔骨折骨痂中骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子基因的表达李亚非李青马福成陈万录刘新平骨断端成骨细胞活性和血液循环状态与骨折愈合、预后密切相关。骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）有高度骨诱导活性，碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）也有促进成骨细胞增殖和毛细血管增...     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

骨形态发生蛋白基因真核表达质粒的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

【目的】克隆人骨形态发生蛋白(BMP4)基因,构建真核表达质粒,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达,为进一步研究以BMP4进行骨修复的基因治疗奠定基础。【方法】采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,从人的松质骨中扩增BMP4的环形脱氧核糖核酸(cDNA),插入pGEM-Teasy载体,测序证实后,将其亚克隆至质粒PCDNA3.1B(-)中构建BMP4真核表达载体;采用脂质体将重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,以RT-PCR和免疫组织化学方法鉴定转染细胞中BMP4基因的表达。【结果】经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,RT-PCR和免疫组化方法证明转基因CHO细胞克隆中存在人BMP4基因。【结论】成功获得了人BMP4的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

目的 提取牛骨形态发生蛋白，并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用，为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的缺损修复研究提供实验依据。方法 从小牛骨中的提取骨形态发生蛋白，配制条件培养液，并作用于培养状态的人骨髓基质细胞，染色检测细胞碱性磷酸酶，I型胶原表达情况，放免法测定培养液中骨钙素含量。结果 人骨髓基质细胞经衣导培养后，碱性磷酸酶，I型胶原，骨钙素表达明显增加。结论 体外培养时，天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化。     

骨形态发生蛋白-2在骨修复中的作用研究进展

骨修复是一个十分复杂的过程，受到多种因素的控制，其中骨生长因子对于局部成骨的重要作用已经实验证实，而骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是诸多因子中唯一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。在BMPs众多亚型中最重要的并且近年来研究较多的是骨形态发生蛋白-2（BMP-2），本文仅对BMP-2在骨修复过程中的作用研究进展综述如下。     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

表达人骨形成蛋白2的成纤维细胞系的建立与鉴定

目的:建立能稳定表达BMP2的成纤维细胞系.方法:运用阳离子聚合物转染试剂,将含有人BMP2基因的真核表达载体pcDNA3.1-B2导入NIH3T3细胞,通过G418筛选获得阳性细胞克隆,RT-PCR、免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BMP2基因的稳定转染和蛋白表达.结果:转染细胞内有BMP2mRNA的转录,胞内及胞外有BMP2蛋白的表达.结论:采用阳离子聚合物转染法可成功地将外源性hBMP2基因导入NIH3T3细胞,为进一步研究诱导牙周膜细胞骨化分化建立基础.     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

Effects of secretive bone morphogenetic protein 2 induced by gene transfection on the biological changes of NIH3T3 cells

Background Bone morphogenetic proteins (BMPs), which belong to the transforming growth factor beta superfamily, are powerful regulators of cartilage and bone formation. This study investigated the biological changes of NIH3T3 cells incubated with secretive BMP2 that was induced by gene transfection through transwell. Methods Eukaryonic expression vector (pcDNA3.1-B2) was transfered into NIH3T3 cells with Sofast™,a positive compound transfection agent. The positive cell clones were selected with G418. The cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 were determined by immunohistochemical stain and enzyme-linked immunosorbent assay. NIH3T3 cells were co-cultured with hBMP2 gene transfecting cells through transwell, and the ultrastructure, alkaline phosphatase activity and the expression of osteocalcin (the marker of osteogenetic differentiation) changes were observed. Results There were cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 in transfecting NIH3T3 cells. The ultrastructural changes, the high activity of alkaline phosphatase and the positive stain of osteocalcin suggested the osteogenetic differentiation tendency of NIH3T3 cells co-cultured with transfecting NIH3T3 cells. Conclusion Secretive BMP2 that is induced by gene transfection could promote the osteogenetic differentiation of fibroblast cells.     

BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究

目的 观测体外培养的兔骨髓间充质干细胞生物学特性,并转染重组腺病毒Ad5-EGFP-BMP7,观察BMP7与EGFP的表达情况.方法 通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、纯化间充质干细胞;流式细胞仪检测细胞周期和表面标记;体外诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定.转染后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测外源基因的表达.结果 原代及传代间充质干细胞为成纤维细胞样细胞;87%以上处于G0/G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶染色阳性,并有矿化结节形成;经成脂肪细胞诱导后,细胞内出现大量脂滴.转染Ad5-EGFP-BMP7后,荧光显微镜下可见EGFP表达阳性;免疫细胞化学染色显示细胞内BMF7表达阳性.结论 成功分离、纯化间充质干细胞,并鉴定其具有成体干细胞特性;重组腺病毒介导BMP7和EGFP体外成功转染间充质干细胞,并稳定表达BMP7、EGFP,为下一步实验奠定了基础.     

昆虫杆状病毒表达系统中人骨形成蛋白3的表达及鉴定

探索人骨形成蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达规律。方法将ｈＢＭＰ３全长ｃＤＮＡ克隆入转移载体ＢａｃＰＫ８中,酶切鉴定后,将此载体与病毒ＤＮＡ经脂质体包裹转染昆虫细胞,重组病毒经蓝白选后,提取其ＤＮＡ进行ＰＣＲ反应,鉴定目的基因。收集重组病毒感染５ｄ的细胞进行免疫荧光及电子显微镜观察。结果克隆了目的基因的重组载体经内切酶消化后,琼脂糖电泳示有相应大小的目的基因片段切下,ＰＣＲ电泳结果见有目的基因片段的     

BM P-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法 根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用One step RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。结果 琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示一长约451bp的条带。阳性克隆质粒经双酶切可切出约451bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论 利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的：在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因,方法：由人成骨细胞中提取细胞总RNA,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA;将获得基因片段重组到pCI质粒中,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果：质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实,获得的基因片段为人BMP2全编码序列,结论：克隆获得人骨形成蛋白2基因,为表达骨形成蛋白2奠定了基础。     

牛骨形态发生蛋白异位诱导小鼠成骨的超微结构观察

目的：牛骨形态发生蛋白（ｂＢＭＰ）植入小鼠肌袋后可诱导血管周围的间充质细胞分化形成软骨和骨组织．但ｂＢＭＰ诱导异位成骨过程的超微结构研究报道甚少．本研究的目的是利用透射电子显微镜（ＴＥＭ）观察ｂＢＭＰ植入区间充质细胞向生骨细胞分化及成骨的超微结构变化．方法：将牛骨中提取的ｂＢＭＰ５ｍｇ植入小鼠股部肌间隙内，术后５，９，１４和２１ｄ取材，制备光镜及电镜标本，镜下观察组织超微结构的变化．结果：ｂＢＭＰ植入后５ｄ，植入区内发现大量肥大的间充质细胞及纤维母细胞样细胞聚集；术后９ｄ，成熟的软骨细胞出现并可见丰富的细胞外软骨基质；术后１４ｄ，软骨细胞变性，基质钙化明显，骨母细胞功能活跃；术后２１ｄ，骨母细胞深陷于钙化基质中形成骨细胞，骨髓腔出现，原始骨髓形成．结论：ｂＢＭＰ能诱导具有分化潜能的间充质细胞进行分化，产生一个完整的骨发育过程．