GITRL对肺癌移植瘤小鼠髓源性抑制细胞免疫抑制功能的调控及其分子机制

目的: 研究糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关配体（glucocorticoid induced TNF receptor ligand, GITRL）对Lewis肺癌移植瘤小鼠来源的髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）免疫抑制功能的调控作用,并探究其分子机制。方法: 采用C57BL/6小鼠构建Lewis肺癌移植瘤模型,分选荷瘤小鼠脾脏中MDSCs,采用流式细胞术检测其表面GITR的表达;GITRL（5 μg/mL）处理MDSCs 48 h后,流式细胞术检测MDSCs对羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的CD4⁺ T细胞增殖的影响,比色法检测MDSCs胞内精氨酸酶1（arginase-1, Arg-1）的活性,Griess偶联法检测效应分子一氧化氮的释放量,并通过蛋白质印迹法检测MDSCs胞内信号分子的表达变化。结果： Lewis肺癌移植瘤小鼠脾脏中MDSCs表达GITR分子;与对照组相比,GITRL处理的MDSCs对CD4⁺ T细胞增殖的抑制能力下降,Arg-1活性降低（P<0.05）,一氧化氮释放量减少（P<0.01）;GITRL蛋白下调了MDSCs胞内JAK2和STAT3 （P<0.05或P<0.01）信号的磷酸化蛋白水平。结论： GITRL蛋白通过抑制MDSCs胞内JAK2/STAT3信号通路,下调MDSCs的免疫抑制功能。     

敲减lincRNA-p21的巨噬细胞对结肠癌细胞CT26生物学功能的影响

［摘要］目的: 探讨巨噬细胞长链基因间非编码RNA-p21（lincRNA p21）的表达对肿瘤细胞及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响,为肿瘤的诊疗寻找新的靶点。方法: 用肿瘤细胞系（CT26）培养上清液刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,实时荧光定量PCR法检测IL-4、IL-6、IL-10、lincRNA-p21的表达;si lincRNA p21转染的巨噬细胞与CT26共培养,流式细胞术分析CT26的凋亡情况,Transwell小室和划痕实验检测CT26的迁移能力;构建小鼠CT26结肠癌移植瘤模型,观察输注转染si lincRNA p21的巨噬细胞对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。结果： CT26培养上清液刺激的RAW264.7较对照组巨噬细胞IL-6的表达下调（P<0.01）,而IL 4和IL 10的表达上调（P<0.01）,并且其lincRNA p21的表达增加（P<0.01）;转染si lincRNA p21的巨噬细胞lincRNA-p21的表达明显下调（P<0.01）。CT26培养上清液刺激转染si-lincRNA-p21的巨噬细胞,与对照组相比IL-6的表达上调（P<0.01）,IL-4和IL-10表达下调（P<0.01）;CT26与转染si lincRNA p21的巨噬细胞共培养后,其凋亡增多（P<0.01）且迁移能力减弱（P<0.05）。此外,体内注射转染si-lincRNA-p21的巨噬细胞能明显影响荷瘤小鼠的肿瘤体积和质量（P<0.05）。结论： 敲除巨噬细胞lincRNA p21可促进CT26的凋亡、抑制其迁移,进而延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长。     

PARG基因沉默对肿瘤局部B220+ DEC205+ DC的影响

目的： 探讨聚（腺苷二磷酸核糖）水解酶［Poly(ADP-ribose)glycohydrolase,PARG］基因沉默对肿瘤局部B220+ DEC205+ DC增殖分化的影响及其在大肠癌转移中的作用。方法：以PARG-shRNA慢病毒载体转染CT26细胞为实验组,未转染CT26细胞和空载体CT26细胞为对照组,分别在小鼠脾包膜下接种形成肝转移模型;Western blot法检测脾脏移植瘤中PARG、PARP、NF-κB蛋白的表达;免疫荧光双标法检测脾脏中B220+DEC205+DC的表达;ELISA法检测各组小鼠血清中IL-10、TGF-β的表达。结果：PARG基因沉默后,脾脏移植瘤体积缩小,肝脏转移癌结节数目减少,差异有统计学意义(P<0.05);脾脏移植瘤中PARG、PARP、NF-κB蛋白的表达量明显较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05);脾脏组织中的B220+ DEC205+ DC较对照组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;血清中IL-10、TGF-β的表达较对照组显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论： PARG基因沉默可抑制小鼠结肠癌CT26细胞肝转移,可能与PARG沉默后下调PARP,并下调NF-κB的活性,从而影响NF-κB依赖性因子IL-10、TGF-β的表达,进而影响B220+DEC205+DC的增殖分化有关。     

瑞戈非尼通过CSF1-R信号通路调节肿瘤相关巨噬细胞增强PD-1抗体在结直肠癌中疗效的研究[1]

目的 探讨瑞戈非尼（Regorafenib，Reg）通过CSF1-R信号通路调节肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）增强PD-1抗体（PD-1 antibody，anti-PD-1）在结直肠癌中的疗效，并分析其机制。方法 接种结肠癌细胞CT26于BALB/c小鼠，建立结直肠癌移植瘤模型，模型小鼠随机分为CT26组、CT26+Reg组、CT26+anti-PD-1组和CT26+Reg+anti-PD-1组，进行药物治疗后观察荷瘤小鼠移植瘤的生长情况。取肿瘤组织，通过Western Blot和免疫组化检测瘤内p-CSF1-R和CSF1-R表达，流式细胞术检测肿瘤单细胞悬液中TAMs并区分M1、M2表型。提取小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDMs），分别诱导成M1、M2型巨噬细胞，并用Reg处理细胞，qRT-PCR检测相关基因表达水平，Western Blot检测巨噬细胞表面CSF1-R蛋白表达。结果 相较于CT26组，药物处理后肿瘤体积和质量均显著减小，与单独使用Reg或anti-PD-1相比，Reg和anti-PD-1联合用药物使移植瘤的体积和重量进一步减小；Western Blot和免疫组化结果显示，Reg处理后，瘤内p-CSF1-R表达显著下调；流式结果显示Reg处理后，M2型巨噬细胞比例显著下降，M1型巨噬细胞比例显著增加；qRT-PCR结果也表明，Reg处理能增加BMDMs中M1表型比例并下调M2表型比例，同时Western Blot结果显示，Reg处理能显著下调M2型巨噬细胞表面p-CSF1-R蛋白的表达水平。结论 Reg通过CSF1-R信号通路调控TAMs，增强anti-PD-1在结直肠癌中的疗效。     

PARP抑制剂对小鼠结肠腺癌CT26细胞肝转移的影响

目的 探讨5-AIQ抑制小鼠结肠癌CT26细胞聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP]后对其肝转移的影响.方法 以小鼠脾脏接种小鼠结肠癌CT26细胞肝转移为模型,采用CT26细胞体外药物处理后脾脏接种和脾脏接种后直接腹腔给药两种方式,将36只BALB/c小鼠按随机区组设计分成6组,其中4组做实验组,2组做对照组,每组6只.观察脾脏原发肿瘤和肝脏转移肿瘤的变化.Western blot检测PARP在各组脾脏原发瘤组织中的蛋白表达量.结果 经过药物5-AIQ处理后,CT26细胞脾脏接种的小鼠和CT26细胞直接脾脏接种后腹腔给药处理的小鼠,脾脏肿瘤体积缩小和肝脏转移结节数目及分级减少,与对照组比较差别显著(P<0.05),但是不同剂量之间未见明显差异(P>0.05).各5-AIQ处理组小鼠脾脏组织PARP表达明显低于未给药处理小鼠脾脏原发瘤组织(P<0.05).结论 5-AIQ能抑制CT26细胞PARP表达,对结肠癌CT26细胞脾脏原发瘤的生长及肝转移具有一定的抑制作用.     

高压氧对小鼠CT26结肠腺癌细胞周期和荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

目的探讨高压氧(HBO)对小鼠CT26结肠癌细胞周期和荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。方法应用流式细胞仪检测对照组和HBO组CT26癌细胞的细胞周期;建立小鼠结肠癌移植瘤模型,观察0.2MPaHBO对CT26癌细胞移植瘤生长的影响。结果对照组细胞在G0G1期、S期、G2M期的比例分别为74.82%、20.38%、4.80%;而HBO后12h组为66.48%、33.16%、0.36%,HBO后24h组为55.89%、40.79%、3.32%。HBO组小鼠肿瘤的体积和重量较模型对照组降低,肿瘤体积抑制率为32.39%,重量抑制率为35.77%。结论HBO可使CT26细胞在S期积蓄,并抑制荷瘤小鼠移植瘤的生长。     

白藜芦醇通过诱导G MDSCs凋亡和M MDSCs分化延缓Lewis荷瘤小鼠肿瘤生长

目的: 探讨白藜芦醇对髓源抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)的影响及其抗肿瘤免疫的作用。方法: 建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,用白藜芦醇(白藜芦醇组,n=6)和PBS(对照组,n=6)分别灌胃处理,测量肿瘤体积和重量;用流式细胞术检测小鼠体内各群MDSCs细胞比率;用免疫磁珠分选技术分离出荷瘤小鼠脾脏粒系MDSCs(G MDSCs)及单核系MDSCs(M MDSCs),经白藜芦醇分别刺激12 h后,流式细胞术检测G MDSCs凋亡及M MDSCs分化情况。结果： 与对照组比较,白藜芦醇组荷瘤小鼠肿瘤体积显著减小(P<0.05),肿瘤重量减轻(P<0.01),脾脏中总MDSCs、M MDSCs比率无明显变化,G MDSCs比率下调;肿瘤组织中总MDSCs和G MDSCs比率均显著减少（P均<0.05）,M MDSCs比率无显著差异。白藜芦醇分别处理G MDSCs、M MDSCs后,早期和晚期凋亡的G MDSCs总数明显高于对照组,M MDSCs表面CD11c和F4/80的表达显著上调。 结论： 白藜芦醇可通过促进G MDSCs凋亡和M MDSCs分化抑制肿瘤生长。     

Compound K 对小鼠CT26结肠肿瘤模型中髓系抑制细胞的抑制作用

目的探讨人参皂苷Compound K（C-K）对髓系抑制性细胞（myeloid derived suppressor cell, MDSC）凋亡、免疫抑制及促
炎症细胞因子分泌的影响。方法流式细胞术分选得到CT26 肿瘤小鼠骨髓MDSCs,分别用C-K或PBS处理后,Annexin V/
7-AAD检测细胞凋亡;qRT-PCR检测Cox-2 和Arg-1 的mRNA表达水平;ELISA技术检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和IL-17
的水平。体内实验中,C-K 或对照PBS处理的MDSCs和结肠癌细胞系CT26共同皮下免疫Balb/c小鼠,21 d后,对两组小鼠肿
瘤的大小以及组织形态学进行鉴定。结果C-K促进了体外培养的MDSC的凋亡,表现为早期细胞凋亡率及晚期凋亡细胞或
坏死率均增加（P<0.01,P<0.05）;并显著下调了MDSC中免疫抑制作用相关基因Cox-2及Arg-1的表达（P<0.05,P<0.01）;同时
抑制了MDSC中促炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-17的分泌（P<0.05,P<0.001,P<0.05）。与对照组比较,C-K 处理后的MDSCs
在体内促进肿瘤细胞的增殖作用明显减弱（P<0.01）。结论C-K 能促进体外培养的MDSC细胞凋亡并拮抗其免疫抑制功能,
从而抑制肿瘤细胞的生长与增殖。
     

黄芪多糖调节黑色素瘤小鼠PD-1/PD-Ls分子表达的研究

目的:研究中药黄芪提取物黄芪多糖在黑色素瘤B16-F10细胞荷瘤小鼠体内的抑瘤效应及对共刺激分子PD-1/PD-Ls通路的调节作用,阐明相关的抗肿瘤免疫调节机制。方法:对荷瘤小鼠进行黄芪多糖干预,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率;CCK-8法检测荷瘤小鼠外周T淋巴细胞增殖活性;ELISA法检测荷瘤小鼠外周血IL-2、IFN-γ的分泌水平;Real-time PCR法检测荷瘤小鼠脾脏PD-1及肿瘤组织PD-L1、PD-L2在mRNA水平的表达;Western Blot法检测荷瘤小鼠脾脏PD-1及肿瘤组织PD-L1、PD-L2在蛋白水平的表达。结果:黄芪多糖可显著抑制B16-F10细胞在C57BL/6小鼠腋部皮下移植形成肿瘤的生长(P0.01);促进荷瘤小鼠外周T淋巴细胞的增殖(P0.01);升高荷瘤小鼠外周血IL-2、IFN-γ的分泌水平(P0.01);抑制荷瘤小鼠脾组织PD-1mRNA和蛋白的表达(P0.05,P0.01);抑制小鼠肿瘤组织中PD-L2的mRNA表达和PD-L1、PD-L2的蛋白表达水平(P0.01)。结论:黄芪多糖能抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生长,其机制可能与黄芪多糖调节PD-1、PD-Ls分子的表达及相互作用,进而增强小鼠T淋巴细胞抗肿瘤免疫活性有关。     

PARG基因沉默对肿瘤局部B220~+DEC205~+DC的影响

目的:探讨聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶[Poly(ADP-ribose)glycohydrolase,PARG]基因沉默对肿瘤局部B220+DEC205+DC增殖分化的影响及其在大肠癌转移中的作用。方法:以PARG-shRNA慢病毒载体转染CT26细胞为实验组,未转染CT26细胞和空载体CT26细胞为对照组,分别在小鼠脾包膜下接种形成肝转移模型;Western blot法检测脾脏移植瘤中PARG、PARP、NF-κB蛋白的表达;免疫荧光双标法检测脾脏中B220+DEC205+DC的表达;ELISA法检测各组小鼠血清中IL-10、TGF-β的表达。结果:PARG基因沉默后,脾脏移植瘤体积缩小,肝脏转移癌结节数目减少,差异有统计学意义(P<0.05);脾脏移植瘤中PARG、PARP、NF-κB蛋白的表达量明显较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05);脾脏组织中的B220+DEC205+DC较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);血清中IL-10、TGF-β的表达较对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PARG基因沉默可抑制小鼠结肠癌CT26细胞肝转移,可能与PARG沉默后下调PARP,并下调NF-κB的活性,从而影响NF-κB依赖性因子IL-10、TGF-β的表达,进而影响B220+DEC205+DC的增殖分化有关。     

小鼠肺部肿瘤集聚髓源性抑制细胞实验研究

目的观察髓源性抑制细胞（MDSCs）在荷瘤小鼠肺部组织的表达情况。方法取12只C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组,每组6只。实验组：将体外培养的3LL细胞（0.3×106个）注射入小鼠尾静脉,成瘤后3周取小鼠肺组织,酶消化肺组织,制备肺组织单细胞悬液,采用流式细胞术检测MDSCs（GR1-FITC、CD11b-PE双染阳性）的表达量。对照组：在小鼠尾静脉注射PBS,其余步骤同实验组。结果实验组小鼠肺部组织高表达免疫抑制细胞MDSCs（GR＋CD11b＋双阳性）,表达量为（19.92±6.08）%;对照组MDSCs表达量为（7.06±2.67）%,两组比较差异有统计学意义（P〈0.001）。结论肺癌小鼠的肺组织高表达免疫抑制细胞MDSCs。     

玄胡索散通过下调粒细胞集落刺激因子抑制脾脏髓源抑制细胞分化发挥抗乳腺癌作用

目的:探讨玄胡索散抑制乳腺癌小鼠脾脏髓源抑制细胞(MDSC)分化的作用机制。方法:4～5周龄BALB/c雌性小鼠48只,其中6只为正常对照组,其他42只采用小鼠左侧第二对乳腺皮下脂肪垫接种4T1细胞构建乳腺癌荷瘤小鼠模型,分为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对照组、G-CSF敲减组、模型对照组、玄胡索散小剂量组、玄胡索散中剂量组、玄胡索散大剂量组和环磷酰胺组,每组6只。其中G-CSF对照组和G-CSF敲减组分别采用shRNA慢病毒转染联合嘌呤霉素构建相应4T1稳转细胞模型。各组造模48 h后,玄胡索散小剂量组、玄胡索散中剂量组、玄胡索散大剂量组分别按2、4、8 g·kg^-1·d^-1玄胡索散灌胃,每天一次;环磷酰胺组按30 mg/kg腹腔注射环磷酰胺,隔天一次;其他组给予等体积0.5%羟甲基纤维素纳。各组连续给药25 d。苏木精-伊红染色观察脾脏组织病理学改变,流式细胞术测定脾脏MDSC亚群比例,免疫荧光法检测脾脏CD11b、Ly6G共表达,酶联免疫吸附测定外周血G-CSF浓度。在体外,建立荷瘤小鼠脾脏与4T1稳转株共培养体系,玄胡索散(30μ...     

复方麦鹿芪人参制剂主要成分变化及其在肝癌H22荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用

目的：分析复方麦鹿芪人参制剂配伍后主要成分的变化,探讨其对肝癌H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用。方法：采用HPLC法测定复方麦鹿芪人参制剂中人参皂苷和氨基酸的含量,苯酚硫酸法测定复方麦鹿芪人参制剂中多糖的含量。将144只雌性昆明小鼠随机分为正常对照组,模型组,阳性药组,低、中、高剂量复方麦鹿芪人参组,人参羹组,人参原粉组和鹿角脱盘原粉组,每组16只。除正常对照组外,其余8组构建肝癌H22荷瘤小鼠模型,造模后次日给药,连续给药10d后测定各组小鼠瘤质量,计算各组小鼠肿瘤抑制率、脾脏指数和胸腺指数,HE染色法观察肿瘤组织和脾脏组织的形态表现,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率。结果：以人参和鹿角脱盘单味生药量计,复方麦鹿芪人参制剂中人参皂苷、多糖和氨基酸含量明显高于单味药（P<0.05）。与模型组比较,各剂量给药组小鼠肿瘤抑制率明显增加（P<0.01）,各剂量复方麦鹿芪人参组小鼠脾脏指数和胸腺指数明显升高（P<0.01）,肿瘤细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。与模型组比较,各剂量复方麦鹿芪人参组小鼠肿瘤组织被破坏,细胞排列疏松,形状不规则,可见坏死灶;脾脏组织白髓结构逐渐趋于正常,边缘区可辨,淋巴细胞排列密集。结论：复方麦鹿芪人参制剂中皂苷、多糖和氨基酸含量与单味药相比均明显增加,且其抗肿瘤作用较单味药更强。     

荷瘤小鼠髓系来源抑制性细胞对哮喘小鼠气道炎症的影响

目的初步探讨髓系来源抑制性细胞（MDSC）对哮喘小鼠气道炎症的影响。方法将6周龄SPF级BALB/c雄鼠5只制成4T1乳腺癌细胞成瘤小鼠,用于制备MDSC。6周龄SPF级BALB/c雌鼠30只随机分为正常对照组、哮喘模型组和细胞移植组。采用免疫磁珠技术分选肿瘤小鼠骨髓中的MDSC,在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的诱导下外扩增培养,光学显微镜观察其体外培养过程中的形态特征,流式细胞仪（FACS）分析其表型特征。哮喘模型组和细胞移植组予卵白蛋白（OVA）腹腔注射致敏,OVA雾化诱发哮喘。细胞移植组在诱导哮喘的第10 d经尾静脉注入MDSC。HE染色观察小鼠肺部病理改变,检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数及分类。结果肺组织病理观察显示正常对照组支气管周围基本无炎症细胞浸润;哮喘模型组支气管周围大量炎症细胞浸润,杯状细胞增生;细胞移植组支气管、血管黏膜下和周围肺组织炎症较哮喘模型组减轻。哮喘模型组和细胞移植组BALF细胞总数、嗜酸粒细胞和中性粒细胞计数均显著高于正常对照组（P〈0.05）,而细胞移植组嗜酸性粒细胞计数则明显低于哮喘模型组（P〈0.05）。结论静脉输注荷瘤小鼠MDSC可一定程度上抑制哮喘小鼠气道炎症。     

半相合细胞移植对CT-26结肠癌荷瘤小鼠的抑瘤作用

目的:探讨半相合细胞移植的移植物对CT-26结肠癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及潜在机制。方法:取C57BL/6小鼠的脾细胞和骨髓细胞作为供体细胞;取18只CB6F1小鼠(受体),随机分成对照组、环磷酰胺组和移植组,每组6只,皮下种植小鼠结肠癌CT26细胞建立荷瘤小鼠模型;然后分别于尾静脉注射0.2 mL生理盐水、环磷酰胺、环磷酰胺+脾细胞+骨髓细胞,连续4周;于不同时间点检测3组小鼠肿瘤体积变化;于2周时取3组小鼠肿瘤、肝脏、小肠和皮肤组织,HE染色观察组织变化;ELISA法检测肿瘤组织中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β含量;流式细胞术检测移植组3 d、2周、4周时小鼠外周血细胞(H-2Kd/b)嵌合率;结果:2周时,环磷酰胺组和移植组小鼠肿瘤体积明显小于对照组(P均<0.01);与对照组和环磷酰胺组相比,移植组肿瘤组织中IL-2、IL-10、IFN-γ与TNF-α含量明显增高(P均<0.05),IL-4和TGF-β含量明显降低(P均<0.05);与移植3 d时相比,2、4周时移植组小鼠外周血中H-2Kb所占比例显著增加(P均<0.01...     

Phosphatase and Tension Homolog Overexpression in Insulin Resistant Diabetic Adipose Tissue

Objective To investigate the expression of phosphatase and tension homolog （PTEN） in adipose tissue of KKAy diabetic mice, a mouse model of type 2 diabetes. Methods KKAy diabetic mice were fed with high fat diet for 4 weeks. After blood glucose met the criteria of diabetes （over 16.7 mmol/L）, mice were randomly divided into 3 groups： a control group （without any treatment）, a rosiglitazone group （treated with rosiglitazone 12.5 mg/kg·d once per day）, and a metformin group （treated with metformin 3 g/kg·d twice daily）. After 4 weeks, we then determined the expression of PTEN and phosphoserine 473-Akt （pS473-Akt） in the epididymal adipose tissue with Western blots. The mice in each group were further divided into the insulin （-） subgroup and insulin （＋） subgroup, which were intraperitoneally injected with saline and insulin （5 mU/g body weight）, respectively. Results The expression of PTEN was elevated in the epididymal adipose tissue obtained from KKAy diabetic mice compared with that from the C57BL/6J mice （P〈0.001）. In accordance with the enhanced expression of PTEN, the level of pS473-Akt stimulated by insulin was decreased in the adipose tissue of KKAy mice compared to the C57BL/6J mice （P〈0.001）. Treatment with the insulin-sensitizing agents, rosiglitazone and metformin did not inhibit the elevated expression of PTEN in adipose tissue of KKAy diabetic mice. Conclusion PTEN may play an important role in the development of insulin resistance in adipose tissue of type 2 diabetes mice model.