利用增强型绿色荧光蛋白体外表达探讨逆转录病毒转染软骨细胞的最佳条件

背景:增强型绿色荧光蛋白是目前最佳标记分子,具有荧光特异性高、易于检测等独特的优势,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染同种异体软骨细胞值得研究。目的:构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,探讨转染同种异体软骨细胞的最佳条件。设计:随机对照观察。单位:上海交通大学。材料:选用30只出生1周的新西兰白兔,雌雄不限,均购自中国科学院实验动物研究中心。双嗜性逆转录病毒包装细胞系PT67购自Clontech公司;小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞购自ATCC公司;DH5a大肠杆菌由本实验室保存;逆转录病毒载体pLNCX2购自Clontech公司;带有增强型绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒由中科院细胞所丛笑倩教授惠赠。方法:实验于2005-08在上海交通大学完成。分离提取并培养新西兰白兔软骨细胞,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染培养后的新西兰白兔软骨细胞,荧光显微镜观察转染的效果。于直径10cm的平皿接种6×105个软骨细胞,分别立即转染及接种12,24,48h后转染逆转录病毒-EGFP,1周后作流式细胞仪测定EGFP表达效率,观察逆转录病毒转染原代软骨细胞最佳时机。软骨酶消化后的软骨细胞接种24h后转染逆转录病毒,分别于第2,3,4,5,6天加250mg/LG418进行筛选。PBS洗涤后作流式细胞仪检测其效率,观察G418筛选的最佳时机。主要观察指标:①EGFP-pLNCX2转染效果。②逆转录病毒转染原代软骨细胞及G418筛选最佳时机。结果:①重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2转染原代兔软骨细胞,经G418初步筛选而获得的高表达格局,可见软骨细胞经过筛选和表达绿色荧光蛋白后,保持正常的形态学,细胞伸出伪足贴壁,基质分泌旺盛。②逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,第7天用流式细胞仪测定转染效率为19.14%,G418筛选的最佳时机为培养后第5天,第7天测定表达效率提升为55.75%。结论:重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2能有效地转染软骨细胞,逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,G418筛选的最佳时机为培养后第5天。     

增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。     

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力，利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK）基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN，采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞，G418筛选出抗性克隆，收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞，在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明；重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后，含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论：逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞，可作为介导T细胞基因转移的重要工具。     

重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

构建携带变异体二氢叶酸还原酶（mDHFR)和绿色荧光蛋白（GFP）融合基因的重组腺相关病毒（AAV）载体，并使其在NIH3T3细胞中表达，观察NIH3T3细胞的耐药性变化。先分别扩增mDHFR和GFP基因片段，并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起，插入T载体，酶切后插入AAV载体，包装成病毒后感染NIH3T3细胞，通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察，结果：PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFPcDNA，荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25％，MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强，结论：AAV载体可将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达，使其对MTX的耐药性增强，为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据。     

构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白.研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达.目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN.用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析.结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp.构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带.插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带.限制性内切酶法鉴定,750与6000 bp处有特异性条带.DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%.结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向.     

利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系

目的：利用重组慢病毒载体将绿色荧光蛋白基因（GFP）导入293T细胞,建立稳定表达GFP的细胞系,将GFP作为靶基因观察不同方法调节基因表达的效力的差异。方法：以载体质粒pHR＇-pCMV-GFP、包装质粒pCMV-ΔR8.2及包膜质粒pCMV-VSVG用磷酸钙共沉淀法共转染包装细胞系293T,收集病毒颗粒再次感染293T细胞,用克隆环筛选出荧光亮度较强的细胞克隆。多次传代后,流式细胞术检测细胞荧光表达的稳定性。同时进行靶向GFP的RNA干扰,观察GFP表达下调情况,验证该细胞系用于研究基因调控方法的有效性。结果：利用重组慢病毒载体可有效建立GFP稳定表达的新细胞系,此细胞系中GFP阳性细胞占99%以上,12次传代前后GFP表达无明显差异;靶向GFP的RNAi可以显著下调GFP表达。结论：成功建立了表达GFP的G4细胞系,并可有效地用于基因调节方法的研究。     

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的：探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法：实验于2003—09／12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体，麻醉处死后．切取关节软骨，系列酶消化分离软骨细胞，洗涤，37℃于体积分数为0．05的CO2中培养，传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞，将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周，再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果：实验共纳入4只日本大耳白兔，作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况：转染后3d，倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞，主要为三角形，少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加，绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主，少数细胞为三角形和椭圆形，体外培养8周，细胞增殖良好，荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87．3％。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果：软骨细胞三维接种支架后，细胞几乎全部种植于支架上，在支架材料内分布均匀，刚接种的细胞呈圆形，发出明亮的绿色荧光；3-4h细胞开始变形，2～3d即己基本完全变形，细胞的形态以长梭形为主，呈网状排列，随着培养时间延长，支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形，移植前（体外培养3周）支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周，细胞密度增加．荧光强度未见减弱，而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况：移植术后4周，大体观察可见移植组织有别于周围软骨，表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周，苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞，排列不规则，表层细胞体积较小，数量较多，深层细胞体积较大，细胞外基质较少，与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少，支架材料大部分降解吸收，修复区与周围组织分界清楚，连接处稍不平整，未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察，修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相，荧光充满整个细胞，荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中，与周围正常关节软骨分界清楚。结论：反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响，可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况，对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。     

人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体并进行鉴定.方法 参照PTEN基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从正常人胎盘组织中提取mRNA作为模板合成第一链,并扩增目的基因序列片段,经双酶切后定向克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,筛选阳性重组质粒,分别经双酶切、测序法对重组质粒进行鉴定.结果 双酶切和特异PCR结果表明克隆的基因片段约1.2 kb;测序法进一步证实该基因为PTEN编码基因,经NCBIBLAST分析与Gene Bank中基因序列完全相同.结论 成功构建了人PTEN绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1-PTEN,为研究在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体的构建及生物活性鉴定

本研究构建Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体,为探讨抑制Fas表达在再生障碍性贫血等疾病治疗中的意义、以及为促进RNA干扰技术的广泛开展奠定基础.用PCR方法获得小鼠U6＋27启动子盒及产生siRNA的相应DNA模板,然后连同增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因克隆入商业化逆转录病毒载体pLXSN,以获得逆转录病毒载体穿梭质粒pLXSN/EGFP-siFas.包装、滴定重组逆转录病毒载体,并感染P815细胞,检测绿色荧光蛋白表达情况及对细胞Fas表达的抑制情况.结果表明：构建的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-siFas能够有效被包装并感染靶细胞,在靶细胞内可同时表达siRNA、绿色荧光蛋白以及新霉素抗性.结论：成功构建了抑制小鼠Fas表达的RNA干扰逆转录病毒载体.     

肌动蛋白和Tau蛋白荧光蛋白融合载体的构建、表达及其细胞内定位

背景:肌动蛋白和Tau蛋白分别是微丝和微管的重要组成成分,肌动蛋白和Tau蛋白的分布能否作为微丝和微管的观察指标.目的:构建肌动蛋白和Tau蛋白的红色和绿色荧光蛋白融合表达载体并转染真核细胞,观察其在细胞内的表达和定位情况.设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2008-03/08在南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室共同完成.材料:克隆在pcDNA3载体上的肌动蛋白和Tau蛋白真核表达载体pcDNA3-actin和pcDNA3-Tau,以及红色荧光蛋白表达载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2、大肠杆菌株DH5α和小鼠NIH3T3细胞系由南方医科大学病理生理学教研室保存.方法:将克隆在pcDNA3上的肌动蛋白和Tau蛋白亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,然后转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察重组载体的表达和细胞内定他.主要观察指标:NIH3T3细胞转染24h后.利用Leica荧光显微镜观察上述重组载体在细胞中的表达和定位情况.结果:重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在NIH3T3细胞中可获得高量表达.融合蛋白发出的红色和绿色荧光均表明,肌动蛋白在细胞质中呈短丝状弥散分布,Tau蛋白以细胞核为中心呈放射状排列.结论:成功构建了肌动蛋白和Tau蛋白的不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,这为研究细胞骨架在信号分子移位中的作用提供了一个重要的工具.     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

含内部核糖体进入位点的逆转录病毒载体介导多药耐药基因的高效表达

为研究内部核糖体进入位点(IRES)引导多药耐药基因(MDR1)的表达效率,利用pSXLC/pHa载体系统构建双顺反子载体pHa-IRES-MDR1(HaiMDR),其中的MDR1基因翻译由脑心肌炎病毒IRES控制。通过脂质体法将载体HaiMDR转染入单嗜性包装细胞GP E86而得到滴度2.0×10～5CFU/ml的病毒;用单嗜性病毒重复感染GP env Am12细胞获得滴度约6.5×10~5CFU/ml的双嗜性病毒生产细胞,并命名为Am12/HaiMDR。两种病毒生产细胞均具经典MDR表型,与未转染的细胞相比,两者对长春新碱、柔红霉素和紫杉醇产生15—358倍耐药。采用聚合酶链反应,在两种生产细胞均证实有外源性MDR1基因的整合和转录,但同时也发现有异常剪接的转录本存在。利用P-糖蛋白(P-gp)特异性单克隆抗体UIC2结合流式细胞术分析,两种耐药细胞均表达高水平的P-gp。因而,MDR1基因可在IRES控制下以帽非依赖性方式进行有效表达,其在基因治疗研究中可有两种用途:在癌症患者化疗后用于保护干/祖细胞,或在双顺反子载体中作为体内显性选择性标志用于共表达治疗性基因。     

反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达

将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经PA317细胞包装后 ,感染靶细胞COS 7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为 (2 .2± 0 .7) μg/ml,且具有良好的生物学活性 ,能明显抑制抗 Fas(CH 11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡。这一结果为探讨Fas和FasL途径在白血病发生中的作用奠定了基础     

绿色荧光蛋白及其应用

源于水母（Aepuorea vietoria）等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是一种极具潜力的标记物。其内源荧光其团在受紫外光或蓝光激发时可高效发射清淅可见的绿光,且荧光性质稳定,与现在的标记物相比,GFP具有无可比拟的优势。因而自GFP被发现以来,一直作为一个监测完整细胞和组织内基因表达及蛋白定位的理想标记。广泛应用于转基因动物的研究、融合标记、基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化,病原菌侵入活细胞的分子过程等。表明GFP是一类能在现代细胞生物学和分子生物学研究与临床检测中发现重要作用的较理想的基因表达标记物。     

IRES序列连接的D-氨基酸氧化酶与绿色荧光蛋白基因导入K562e细胞的表达

内部核糖体进入位点 (IRES)序列来源于脑心肌炎病毒 ,它可翻译一条mRNA上的两个开放读框 ,由其连接的两个基因的表达率相同。本实验应用以IRES序列连接D 氨基酸氧化酶 (DAAO)和绿色荧光 (GFP)基因构建的逆转录病毒载体 ,转染K5 6 2e细胞获得稳定表达GFP的单克隆细胞KDfGC和KDfGd,测定转基因细胞的荧光阳性率以及荧光强度 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。结果表明 ,KDfGC和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .6 4 % ,96 .31% ;2× 10 4细胞的荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。GFP荧光强度与H2 O2 的产量间呈指数相关。结论 :IRES序列调控的双基因可同时表达 ,GFP的荧光强度可以间接地反映DAAO基因的表达水平 ,为了解目的基因表达水平高低提供了新的方法。     

小鼠microRNA302a逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:为进一步研究microRNA在细胞重编程机制中的作用,构建microRNA302a(miR-302a)逆转录病毒载体。方法:从小鼠基因组DNA扩增pri-miR302a,克隆至pMx-IRES-GFP逆转录病毒载体上,测序鉴定,转染PLAT-E细胞包装逆转录病毒颗粒,并进行病毒滴度测定。结果:成功构建表达miR-302a的逆转录病毒载体pMx-miR302a-IRES-GFP,阳性克隆测序结果与目标基因序列完全一致。结论:pMx-miRNA302a-IRES-GFP载体构建成功。     

小鼠白细胞介素-1cDNA的克隆及逆转录病毒载体的构建

目的：克隆小鼠白细胞介素-1cDNA(IL—1cDNA)，构建小鼠IL-1cDNA逆转录病毒载体。方法：利用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)，从小鼠胸腺细胞中扩增出小鼠IL-1cDNA，克隆到测序载体pBluseript中．测序后．再亚克隆到逆转录病毒载体pLNCX中。结果：RT-PCR扩增出约518bp片段，经酶切鉴定显示小鼠IL-1cDNA逆转录病毒载体(IL-1pLNCX)构建成功。结论：小鼠IL-1cDNA与已发表的其他种小鼠的序列相同，IL-1cDNA可能无种间差异。为进一步研究IL-1在中枢神经系统病理状态下的作用机制提供了有利的研究工具。     

逆转录病毒介导转导的人粒-巨噬系集落刺激因子基因在哺乳动物细胞中的表达(英文)

利用多聚酶链反应(PCR)方法,从活化的人外周血单个核细胞中克隆了人粒-巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)的cDNA。DNA序列测定证实此片段为完整的GM-CSF cDNA。应用DNA重组技术,将此cDNA重组于逆转录病毒载体pDORneo上,以Lipofectin介导转染病毒包装细胞PA317,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。选取高滴度病毒上清感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经G418筛选获抗性克隆,PCR方法鉴定重组载体整合于CHO细胞的基因组DNA中。用CFU-GM集落形成实验检测GM-CSF活性,证实转染后的CHO细胞有GM-CSF的稳定、高效表达。