TRAP—ELISA法进行端粒酶半定量检测

为了建立一种端粒酶（telomerase）半定量检测方法,以适合临床及科研需要,我们采用TRAP－ELISA法,并加以改良,对45例宫颈活检组织端粒酶进行了半定量测定。结果发现宫颈癌阳性检出率为92.0%,特异性90.0%,批内变异系数为9.6%,且发现宫颈活检组织中端粒酶性随着宫颈病变的发展而有增强趋势,实验结果表明,本法具有操作简便、快速、灵敏性高、特异强、重复性好的特点,且能进行半定量分析,适用于临床及科研。     

胸腹水细胞端粒酶活性定性和定量检测

目的探讨端粒酶活性定量检测在诊断良恶性胸腹水中的应用价值。方法采用TRAP-银染定性方法和rrRAP-PicoGreen定量方法,对102例已确诊患者的胸腹水细胞进行端粒酶活性分析。结果恶性胸腹水细胞端粒酶活性明显高于良性胸腹水细胞,其定性检测诊断率明显高于细胞病理学。乳腺癌患者胸腹水细胞的端粒酶活性明显高于卵巢癌、肝癌患者胸腹水细胞的端粒酶活性;肺癌患者胸腹水细胞端粒酶活性明显高于肝癌。在良性胸腹水中,感染性胸腹水细胞端粒酶活性高于非感染性胸腹水。结论恶性胸腹水细胞端粒酶活性明显升高。端粒酶活性定量检测较定性检测更敏感、简便,对良恶性胸腹水的诊断和鉴别诊断有一定应用价值。     

端粒酶活性检测方法

端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白,属于逆转录酶,以自身的RNA模板合成染色体末端的端粒重复序列,对细胞增殖、衰老、永生化和癌变起重要作用.目前端粒酶的检测方法有①基本方法.②TRAP法.③半定量TRAP法.④TRAP-银染法.⑤接近闪烁分析法.⑥ELISA法.⑦原位TRAP法.⑧原位杂交法.⑨免疫组织化学法.⑩端粒酶活性原位检测法.端粒酶与恶性肿瘤密切相关.端粒酶活性检测方法的不断发展为肿瘤的诊断和治疗提供了新途径.     

荧光定量PCR测定端粒长度

目的 应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)方法测定端粒长度.方法 选取9种人类细胞株,提取基因组DNA,采用Q-PCR方法测定相对T/S比率,DNA印迹法测定末端限制性片段(TRF)长度,进行二者之间的相关性分析.结果 定量PCR测定端粒长度相对T/S比率为0.68±0.57,DNA印迹法测量平均TRF值为8.57±2.34,两种方法测定结果的相关性分析R2=0.7807(P＜0.01).结论 采用荧光定量PCR方法测量端粒长度具有重复性好、省时、简便、可靠的特点,可高通量处理大量样品.     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的 在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法.方法 以噬菌体MS2 RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9 U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA.采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性.同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度.结果 将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值.不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7 U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112 bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl.结论 成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标.     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

实时荧光定量RT-PCR法定量检测手足口病病原体的探讨

目的了解北京市门头沟区手足口病患儿感染病毒的型别,探索用荧光定量RT—PCR法对手足口病患者咽拭子标本中肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A16（CoxA16）型病毒载量进行定量检测的可行性。方法采用实时荧光RT—PCR体外扩增法对81例手足口病患儿咽拭子标本提取的RNA进行检测。结果28例手足口病患者体内CoxA16病毒载量〉10^3 copies·ml-1。实时荧光定量RT—PCR法构建的标准曲线显示,样本阈值环数（Ct）值与病毒拷贝数的对数（10g10）之间的相关系数为0．9998,相关性良好。4例手足口病患者咽拭子标本中EV71型病毒载量〉10^3 copies·ml-1。实时荧光定量RT-PCR法标准曲线显示,Ct值与病毒拷贝数的对数之间的相关系数为0．9996,相关性较好。结论门头沟区手足口病病原谱以CoxA16型为主,34．6％的手足口病患儿CoxA16型病毒载量〉10^3 copies·ml-1,4．9％的患儿EV71型〉10^3 copies·ml-1。实时荧光定量RT-PCR法对咽拭子标本中CoxA16、EV71核酸定量检测比较简便快速、结果直观、稳定性强,为进一步探讨患者体内病毒载量与临床症状的关系打下了良好的基础。     

荧光定量PCR法检测乙型肝炎病毒DNA

目的：了解不同乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血清HBV-DNA含量与乙肝血清免疫标志物的关系并探讨其临床意义。方法：用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法定量检测375例不同临床类型HBV感染者及70例正常人血清HBV-DNA含量。结果：血清HBsAg阳性组与HBeAg阳性组HBV-DNA的检出率及含量均明显高于HBsAg阴性组和HBeAg阴性组，且HBeAg即使阴性，不论HBeAb阳性组或阴性组均仍有较高的HBV-DNA检出率。不同临床类型HBV感染者中均有HBV-DNA的检出。结论：定量PCR可真实反映HBV感染、复制及病程变化，对乙型肝炎临床诊断及治疗均有一定的临床意义。     

人髂动脉粥样硬化斑端粒酶活性检测

目的:探讨动脉粥样硬化形成与血管平滑肌细胞端粒酶活性表达的相关性。方法:取20例肾功能衰竭患者髂动脉粥样硬化斑及5例脑死亡病人正常髂动脉组织, 刮去腔面内膜层及外膜结缔组织后, 用端粒重复序列扩增法(Telomericrepeatsequenceamplificationprotocol, TRAP)检测剩余组织端粒酶活性。结果:5例正常髂动脉组织均为端粒酶阴性, 20例动脉粥样硬化组织中, 有8例为阳性, 12例呈阴性。结论:端粒酶与血管平滑肌细胞增生及动脉粥样硬化形成可能存在一定相关性, 其作用待进一步研究。     

原发性肝癌端粒酶活性的检测及临床意义

为探讨端粒酶活性化在原发性肝癌发生发展中的作用，本文采用ＴＲＡＰ技术，对４２例手术切除的原发性肝细胞癌及癌旁组织的端粒酶活性进行检测。结果发现：４２例肝癌组织有３４例检出端粒酶活性，阳性率为８１．０％，４２例癌旁组织有１２例检出端粒酶活性，阳性率为２８．８％，端粒酶活性与肿瘤大小，组织学分级及肿瘤转移无显著相关，以上结果提示，检测原发性肝癌组织端粒酶活性对阐明原发性肝癌的发病机理，癌变危险性的预测     

乳腺良恶性病变组织端粒长度和端粒酶活性检测

目的　比较乳腺良恶性病变端粒长度改变及其在肿瘤发生发展中的意义 ;探讨端粒酶活性与临床病理参数的关系及其在乳腺癌诊断中的价值。方法　Southern印迹杂交检测TRF长度 ,端粒重复扩增分析 (TRAP)方法检测端粒酶活性。结果　乳腺癌组织平均TRF为 (5 2± 2 8)kb ,与正常组织比较明显缩短 (P <0 0 0 1) ,从正常乳腺组织到乳腺良性病变、乳腺原位癌及浸润性癌平均TRF呈递减趋势。 5 8例乳腺癌中 4 9例端粒酶阳性 (84 7% ) ,端粒酶活性与临床病理参数无相关性 ;癌旁组织端粒酶为阴性 ,而 7例乳腺增生症和 6例乳腺纤维腺瘤中分别有 1例端粒酶阳性 ,与乳腺癌比其差异有显著性 (P <0 0 0 1)。结论　端粒长度在肿瘤发生发展过程中渐进性缩短 ,并最终触发端粒酶的激活 ;端粒酶活性检测有望成为乳腺癌诊断的可靠标记物     

端粒及端粒酶活性的调控机制

广义的端粒由帽子、双链的串联重复序列的DNA核心部分及亚端粒构成,其结合蛋白是一个复合体,由TRF1、TRF2、TIN2、Pot1、TPP1、RAP1 6个亚单位组成;另外,还结合组蛋白的特定成分H3K9三甲基聚合体和H4K20三甲基聚合体.端粒酶主要由hTerc、hTert、dyskerin构成.端粒的功能主要受端粒酶的活性调控;而端粒酶活性主要受hTert及hTerc的转录水平和转录后的剪切、hTert的翻译等因素的调控.端粒与端粒酶结构和功能的异常与细胞衰老及肿瘤的发生、发展关系密切.     

荧光定量PCR法与ELISA法联合检测乙型肝炎的临床价值探讨

目的研究荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)与ELISA法检测乙肝免疫学标志物(HBV-M)的临床价值。方法本研究选取2016年1月~2017年6月在西安高新医院检测的382例乙肝患者为研究对象,全部患者均采用荧光定量PCR法和ELISA法分别对HBV-DNA和乙肝两对半等免疫学指标进行检测,免疫学指标的检测顺序为乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)、乙肝病毒表面抗体(HBs Ab)、乙肝病毒e抗原(HBe Ag)、乙肝病毒e抗体(HBe Ab)、乙肝病毒核心抗体(HBc Ab)。比较不同HBV-M模式检测结果。结果模式1(大三阳组)HBV DNA阳性率最高,为94.6%,显著高于其他组,差异具有统计学意义(P0.05)。模式1(大三阳组)的HBV DNA表达水平为(6.57±1.51)lg copies/ml,明显高于其他模式的HBV DNA表达水平,差异具有统计学意义(P0.05)。结论采用FQ-PCR和HBV免疫学标志物检测相结合的方法,对临床乙型肝炎患者的早期诊断、病情判断、治疗方案的选择及预后具有重要指导价值。     

应用端粒酶原位杂交技术检测大肠癌端粒酶活性

笔者利用国产端粒酶原位杂交检测试剂盒在大肠癌组织的石蜡切片中检测端粒酶活性 ,获得满意结果。现将应用该方法的体会简要介绍如下。1　材料与方法1.1　观察对象　手术切除的新鲜大肠癌组织 2 0例 ,对离体组织立即液氮冷冻 ,- 80℃冰箱保存。标本分为 2份 ,1份在做 5 μｍ厚连续冷冻切片 ;另 1份经 10 %中性福尔马林或4 %多聚甲醛固定 ,石蜡包埋 ,做 5 μｍ厚石蜡切片。1.2　试剂　 (1)端粒酶原位杂交检测试剂盒为武汉博士德公司产品 ,购自天津ＴＢＤ公司 ,编号ＭＫ115 9。端粒酶逆转录成分 (ＴＥＲＴ )来源于人基因ＴＥＲＴ ＮＭ 0 0 32 …     

用荧光定量法检测Caspase—3的活性

目的,通过检测Caspase-3的活性反映Jurkat细胞凋亡。方法,用放线菌素D诱导Jurkat细胞8h,裂解细胞,荧光分光光度计测定Caspase-3的活性。同时,用Hoechst法进行检测,并进行闰行的方法学比较。结果Jurkat细胞经不同浓度（50μmol/L和100μmol/L)有放线菌素D诱导后,Caspase-3的活性显著增高,倍增值分别为10．091和10．818,相应的Caspase-3活性单位为0．641和0．659,而未经诱导的Jurkat细胞仅为0．061,加入Caspase-3抑制剂后,倍增值分别为0．101和0．119,Caspase-3的活性单位为0．006和0．007。而且Hoechst法染色时,可见Jurkat细胞仅出现早期凋亡的形态学改变。结论荧光定量法是一种良好的定量检测Caspase-3的方法,可用于检测早期的细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的影响

目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对端粒酶活性的影响,以探讨HCV NS3蛋白在HCV致癌中的作用,并观察端粒酶活性原位检测法的应用价值.方法利用HCV NS3真核细胞表达质粒pRcHCNS3-5′(表达HCV NS3 N端多肽),pRcHCNS3-3′(表达HCV NS3C端多肽)和空白质粒pRcCMV转染NIH3T3细胞,分别获得11、11和8个阳性克隆;采用链霉素抗生物素-过氧化物酶法(SP)免疫组织化学方法检测转染的NIH3T3细胞中HCV NS3蛋白表达,并通过端粒酶活性原位检测法和端粒酶聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附反应(ELISA)技术分别检测转染前后NIH3T3细胞端粒酶活性的定位和定量变化.结果 HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-5′或pRcHCNS3-3′转染的NIH3T3细胞均表达HCV NS3蛋白,HCV NS3蛋白阳性信号均位于细胞质中,并以前者表达的阳性信号为强(χ2=6.667,P<0.05),各组细胞端粒酶活性存在显著差异(F=143.083,P<0.01),其中质粒pRcHCNS3-5′转染的NIH3T3细胞端粒酶活性最强,11个克隆均呈阳性,质粒pRcHCNS3-3′转染的细胞次之(P<0.05),空白质粒pRcCMV转染细胞和未转染NIH3T3细胞最弱;HCV NS3蛋白的表达水平和端粒酶活性强度之间具有显著相关性(rs=0.808 4,P<0.01);采用端粒酶活性原位检测方法和端粒酶PCR ELISA技术检测结果具有较好的一致性(rs=0.501 96,P<0.01).结论 (1) HCV NS3蛋白可能是通过内源性机制激活细胞端粒酶导致宿主细胞恶性转化;(2) HCV NS3蛋白 N端多肽对宿主细胞端粒酶的激活作用强于C端多肽;(3) 进一步证实端粒酶活性原位检测法是一种适合于病理形态与功能研究的技术.     

AML患者端粒酶逆转录酶mRNA的表达与端粒酶活性的检测

目的:建立一种实时荧光RT-PCR方法,定量检测急性髓细胞白血病(AML)患者外周血单个核细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达水平,观察其与AML发生及复发的关系,探讨hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性的相关关系。方法:采用实时荧光RT-PCR与Lightcycler荧光PCR仪定量检测hTERT mRNA的表达水平,采用PCR-ELISA检测端粒酶活性。结果:①AML首治患者、复发患者、完全缓解期患者以及健康体检者NhTERT分别为299.2±292.8、550.1±441.3、14.0±9.2和12.3±6.7,与健康体检者和完全缓解期患者比较,AML首治患者、复发患者hTERT mRNA表达水平显著升高,而且AML复发患者hTERT mRNA的表达水平显著高于首治患者;②AML首治患者、AML复发患者、AML完全缓解期患者以及健康体检者端粒酶的活性分别为32.8%±24.3%4、8.6%±31.4%、7.4%±5.1%和7.6%±3.6%,AML首治患者、复发患者端粒酶活性显著升高,而且AML复发患者端粒酶活性显著高于首治患者;③hTERT mRNA表达水平与端粒酶的活性呈现良好的相关性,相关系数为0.78。结论:hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性的上调是AML发生与复发的一个重要因素,且hTERT mRNA表达水平与端粒酶活性呈良好的正相关。     

端粒酶活性的定量分析方法

端粒酶是目前已知最为广谱的肿瘤分子标记物,并可能成为今后肿瘤诊断和预后判断的新指标以及肿瘤治疗的新靶点。对端粒酶活性的测定.在TRAP法的基础上发展建立了各种定量和半定量方法。     

端粒酶活性抑制的研究进展

端粒、端粒酶具有特殊结构和功能，近年来已成为分子生物学研究的热点。资料证实，端粒酶激活见于大多数恶性肿瘤中，是恶性肿瘤形成的早期关键事件，而在大部分正常组织中无端粒酶活性。因此，端粒酶抑制剂被认为是一类潜在的高选择性的抗肿瘤药物，抑制剂的开发研究为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计以及基因治疗开辟了一个新的方向。本阐明了有关端粒酶抑制剂的研究进展，并讨论了其应用前景和可能面临的问题。