siRNA介导垂体瘤转化基因沉默抑制人泌乳素型垂体瘤凋亡的研究

目的探讨垂体瘤转化基因(PTTG)对人泌乳素型垂体瘤(HPA)细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对PTTG的特异性siRNA序列,通过siPORTTM NeoFXTM转入原代培养HPA细胞,Western blot法检测siRNA作用后PTTG蛋白表达,DNA ladder和annexin V/PI染色法检测PTTG沉默对细胞凋亡的影响。结果siRNA转染组细胞内PTTG蛋白表达减弱;在CDDP诱导后,对照组和siRNA组均出现细胞凋亡,siRNA组DNA ladder形成不明显,Annexin V染色凋亡细胞数目减少,对照组细胞凋亡率为18.6%,而siRNA组仅为8.7%。结论垂体瘤转化基因对人泌乳素型垂体瘤细胞具有促进凋亡作用。     

川楝素提取物诱导 K562 细胞凋亡的实验研究

目的 探讨川楝素提取物对人白血病 K562 细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制。方法 采用 MTT 法检测川楝素提取物对 K562 细胞增殖的影响;Wright′s染色观察细胞的形态学改变;流式细胞技术检测细胞周期与凋亡率的变化;Annexin V/PI 双标记法检测细胞的早期凋亡变化;DNA 琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 片段化;比色法检测 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 相对活性的改变;RT-PCR 检测凋亡相关基因 p21、bcr/abl、H-ras mRNA 表达水平的改变。结果 川楝素提取物显著抑制 K562 细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖性,作用 72 h 的 IC50值为 20 nmol/L;处理组细胞可见典型的凋亡形态学改变;细胞周期和 Annexin V/PI 双标记检测表明川楝素提取物可诱导 K562 细胞凋亡,并呈剂量-时间依赖性;处理组细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳出现明显的 DNA ladder;处理组细胞 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的活性均显著增加;p21、H-ras mRNA 表达上调,bcr/abl mRNA 表达下调。结论 川楝素提取物对 K562 细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,其机制与 Caspase 信号途径的活化有关。     

单核细胞趋化蛋白-1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡

目的:研究单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)对人脐静脉内皮细胞(hUVEC)凋亡的影响.方法:培养并鉴定hUVEC;用不同浓度MCP-1(0.1,1.0,10,100μg/L)对其作用24,48h;Annexin V/PI双染细胞,流式细胞仪观察内皮细胞凋亡;琼脂糖凝胶电泳检测细胞染色体"DNA ladder"的形成.结果:MCP-1能诱导hUVEC的凋亡,其效应随浓度和时间的增加而增强(P＜0.01);Annexin V/PI显示凋亡细胞明显增加;细胞DNA呈明显的"DNAladder".结论:MCP-1能诱导hUVEC凋亡.     

颅咽管瘤中RARα及PPARβ/δ表达与RA作用的相关性

目的检测颅咽管瘤中RARα及PPARβ/δ的表达,分析其表达量与RA作用效果的相关性,探讨RA靶向治疗颅咽管瘤的分子机制.方法 RT-PCR法检测31例体外培养的颅咽管瘤细胞中PPARβ/δ、RARα的表达情况,MTT法测定RA对PPARβ/δ、RARα不同表达的颅咽管瘤细胞的抑制率,分析其表达情况与RA作用是否存在相关性.结果 RT-PCR结果显示,不同颅咽管瘤细胞中PPARβ/δ、RARα表达存在差别.31例原代培养的颅咽管瘤细胞按其核受体表达不同分为PPARβ/δ>RARα、RARα>>PPARβ/δ、RARα>PPARβ/δ3组;MTT结果显示在相同RA药物作用下RARα>PPARβ/δ组的抑制率明显高于RARα>PPARβ/δ组、PPARβ/δ>RARα和对照组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 PPARβ/δ、RARα的表达可作为评估RA治疗颅咽管瘤效果的有效指标.PPARβ/δ表达低的颅咽管瘤细胞对RA更敏感;靶向升高RARα或者靶向降低PPARβ/δ的表达都有益于颅咽管瘤的治疗.     

一种新的人脑颅咽管瘤细胞系的培养方法

目的建立颅咽管瘤(Craniopharyngioma,CP)的细胞体系,观察、研究并评估其生物学特点,为在细胞水平研究颅咽管瘤提供实验资料和理论基础。方法利用特殊培养基对人颅咽管瘤细胞体外原代培养,并进行传代培养,建立肿瘤细胞系,同时观察、检测细胞系的生物学特点。结果通过消化法并采用特殊的培养基可以成功进行颅咽管瘤细胞的原代培养,通过特殊的培养条件可以使细胞得到纯化并传代培养。原代颅咽管瘤细胞呈多角形,光镜下呈典型的铺路石样表现,胞浆丰富,并可进行传代培养,最多可达8代,免疫细胞化学检测显示角蛋白7阳性。肿瘤细胞生长曲线提示细胞生长稳定,倍增时间约为3天左右。结论利用CP患者的新鲜肿瘤组织,采用酶消化法并用特殊的培养基进行培养,可以成功地进行颅咽管瘤细胞的原代培养并可在特殊条件下进行传代培养。     

CRABP-Ⅱ、FABP-5在颅咽管瘤中的表达

目的检测颅咽管瘤中CRABP-Ⅱ、FABP-5的表达,分析其与颅咽管瘤关系,探讨维甲酸靶向治疗颅咽管瘤的分子机制.方法采用荧光免疫组织化学技术(Fluorescent Immunostaining)分别检测39例AE、10例SP两种亚型颅咽管瘤及20例正常脑组织中CRABP-Ⅱ、FABP-5蛋白表达情况,分析2种类型颅咽管瘤细胞及正常脑组织细胞中其表达有无差异.结果 (1)49例颅咽管瘤与20例正常脑组织中CRABP-Ⅱ,FABP-5的表达差异无统计学意义(P>0.05);(2)在颅咽管瘤亚型中CRABP-Ⅱ及FABP-5表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 CRABP-Ⅱ、FABP-5不能作为RA作用颅咽管瘤细胞的靶点,CRABP-Ⅱ/FABP-5稳态在本实验中不存在.     

颅咽管瘤中RARα及PPARβ/δ表达与RA作用的相关性

目的检测颅咽管瘤中RARα及PPARβ/δ的表达,分析其表达量与RA作用效果的相关性,探讨RA靶向治疗颅咽管瘤的分子机制.方法 RT-PCR法检测31例体外培养的颅咽管瘤细胞中PPARβ/δ、RARα的表达情况,MTT法测定RA对PPARβ/δ、RARα不同表达的颅咽管瘤细胞的抑制率,分析其表达情况与RA作用是否存在相关性.结果 (1)RT-PCR结果显示,不同颅咽管瘤细胞中PPARβ/δ、RARα表达存在差别.31例原代培养的颅咽管瘤细胞按其核受体表达不同分为PPARβ/δ>RARα、RARα>PPARβ/δ、RARα>>PPARβ/δ3组;(2)MTT结果显示在相同RA药物作用下RARα>>PPARβ/δ组的抑制率明显高于RARα>PPARβ/δ组、PPARβ/δ>RARα和对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 (1)PPARβ/δ、RARα的表达可作为评估RA治疗颅咽管瘤效果的有效指标.PPARβ/δ表达低的颅咽管瘤细胞对RA更敏感;(2)靶向升高RARα或者靶向降低PPARβ/δ的表达都有益于颅咽管瘤的治疗.     

酸性肽对硝普钠诱导体外培养SD大鼠海马神经细胞凋亡的保护作用

目的:观察不同剂量酸性肽(AP)对NO供体硝普钠(SNP)诱导的大鼠海马神经细胞凋亡的影响.方法:分离培养新生SD大鼠海马神经细胞,用终浓度为50 μmol/L的SNP诱导海马神经细胞凋亡.实验共设空白对照组、SNP处理组和AP实验组,AP实验组分别加入浓度为0.037 5、0.075 0、0.150 0 g/L的AP与SNP共培养24 h后,通过细胞形态学观察、MTT测定、吖啶橙荧光染色及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法检测细胞凋亡情况及细胞存活率.结果:SNP处理组海马神经细胞存活率降低至58.9%±4.5%,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).3个AP实验组海马神经细胞存活率均高于SNP处理组(P<0.05或0.01).SNP组凋亡细胞的形态学改变及细胞核固缩、核碎裂现象明显,DNA琼脂糖凝胶电泳图谱具有DNA ladder;各AP实验组凋亡细胞形态学改变不明显,DNA琼脂糖凝胶电泳图谱没有DNA ladder出现.结论:AP对SNP诱导的海马神经细胞凋亡具有保护作用.     

硒对紫外线诱导HLF细胞凋亡的保护作用

目的：探讨紫外线诱导人HLF细胞凋亡时DNA降解特点，以及硒对紫外线诱导细胞凋亡的保护作用。方法：紫外线分别照射体外培养的人肺成纤维细胞3min和5min，同时添加亚硒酸钠（8ng/ml），设立对照组。利用吖啶橙荧光染料染色鉴定凋亡细胞，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。结果：紫外线可以诱导人肺成纤维细胞（28代）凋亡，作用存在时间效应关系。紫外线诱导人肺成纤维细胞凋亡时，未出现典型的DNA ladder现象。硒对于紫外线诱导的细胞凋亡有显著的抑制作用。结论：DNA ladder不能作为细胞凋亡的唯一的标志，紫外线诱导的细胞凋亡与DNA ladder的出现并不总是一致的。硒具有拮抗紫外线诱导的细胞凋亡作用。     

重组人生长激素对颅咽管瘤ADAMDEC1表达的影响研究

目的探讨重组人生长激素(rhGH)对颅咽管瘤ADAMDEC1表达的影响。方法颅咽管瘤细胞经培养24 h后分为实验组和对照组,实验组分别加入浓度为10 ng/ml、100 ng/ml和1 000 ng/ml的rhGH,对照组不加rh-GH,采用RT-PCR检测颅咽管瘤细胞ADAMDEC1 mRNA表达水平,Western bloting检测ADAMDEC1蛋白在颅咽管瘤细胞中的表达变化。结果随着rhGH浓度的增加,ADAMDEC1 mRNA的表达和ADAMDEC1蛋白的表达均增加,rhHG1 000 ng/ml组均为最高。且颅咽管瘤细胞ADAMDEC1 mRNA目的基因/内参照的吸光度比值和各组积分光密度(IOD)值比较(去除β-actin),rhHG 1 000 ng/ml组均为最高。结论 rhGH可使颅咽管瘤细胞ADAMDEC1表达增加,从而促进颅咽管瘤细胞的生长,这可能为颅咽管瘤患者的rhGH替代治疗提供一个临床指导依据。     

3,6-二羟基黄酮对多种肿瘤细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用

目的 观察3,6-二羟基黄酮对乳腺癌细胞株MCF-7(雌激素受体阳性ER+)、MDA-MB-231(雌激素受体阴性ER-)、直肠癌细胞株LoVo、DLD-1和前列腺癌细胞株PC3增殖和凋亡的影响.方法 MTT法检测3,6-二羟基黄酮对不同肿瘤细胞生长存活的影响,计算半数抑制浓度(IC50);DAPI染色观察3,6-二羟基黄酮对肿瘤细胞生长状态及形态的影响,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡变化.结果 增殖检测结果表明,3,6-二羟基黄酮对于MCF-7、MDA-MB-231、LoVo、DLD-1和PC3细胞增殖均表现出显著抑制作用,48 h IC50值分别为16.1、15.7、29.8、12.8和17.8μmol/L;细胞形态观察和凋亡检测结果表明,10 μmol/L的3,6-二羟基黄酮作用24 h,5种肿瘤细胞的生长状态和形态均发生显著变化,大量细胞表现出凋亡或死亡细胞的形态特征,细胞凋亡率均显著升高.结论 3,6-二羟基黄酮具有显著的抗肿瘤效应,对于多种肿瘤细胞具有很强的增殖抑制和凋亡诱导作用.     

半枝莲提取物诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的机制研究

目的探讨半枝莲提取物在体外诱导结肠癌HT-29细胞株凋亡的作用机制。方法采用人结肠癌细胞HT-29常规体外培养,随机设定对照组和不同浓度半枝莲提取物组,干预24 h。倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法测定不同浓度半枝莲提取物对HT-29细胞增殖的影响,DNA Ladder试剂盒检测药物作用后细胞凋亡情况,AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位变化,应用比色法分析Caspase-9和Caspase-3的活化情况。结果半枝莲提取物干预HT-29细胞24 h后,HT-29细胞密度明显减少、细胞变小,可明显抑制HT-29细胞增殖,细胞凋亡增加,线粒体膜电位丧失,具有显著地剂量依赖,并出现明显的DNA Lad-der条带;Caspase-9和Caspase-3的活化随着药物浓度的升高而增加。结论半枝莲提取物能通过线粒体通路诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。     

榄香烯对K562细胞株的体内外抑制作用

目的：探讨榄香烯对慢性粒细胞白血病急变的细胞K562株的体内外作用。方法：不同浓度榄香烯体外作用K562细胞不同时间,CCK-8法检测体外增殖抑制作用,Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡,DAPI染色进行细胞核形态学分析,动物实验观察榄香烯对K562的体内抑制作用。结果：榄香烯对K562细胞生长具有明显的抑制作用,呈量效和时效关系;榄香烯能诱导K562细胞凋亡,呈量效关系;DAPI染色显示榄香烯诱导K562细胞并显示特征性的凋亡细胞核形态;榄香烯明显抑制K562细胞在SCID小鼠体内增殖。结论：榄香烯主要通过诱导细胞凋亡,发挥对K562细胞明显的增殖抑制作用。     

IL-17A/IL-17RA通过上调自噬降低卵巢癌SKOV3细胞对顺铂敏感性

目的 探讨白细胞介素（IL）17A通过调控细胞自噬对卵巢癌细胞顺铂（DDP）化疗敏感性的影响。方法 体外培养卵巢癌SKOV3细胞并分别用不同浓度DDP（1、2、4、6、8、10、15、20 μg/mL）处理,MTT法测定细胞增殖活性以及IL-17A（100 ng/mL,处理24 h）对DDP 诱导SKOV3细胞凋亡的影响;流式细胞术检测人卵巢癌细胞SKOV3中IL-17A受体（IL-17RA）的表达水平;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测细胞早期凋亡情况;IL-17RA 中和抗体（IL-17RA mAb）进行IL-17RA阻断实验;合成针对IL-17RA基因的siRNA片段（siRNA-IL-17RA）,转染SKOV3细胞,沉默IL-17RA表达;3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制细胞自噬水平;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白（Bcl2、Bax、Cleaved Caspase3）、自噬相关蛋白（P62、Beclin-1）表达。结果 DDP可以增加卵巢癌SKOV3细胞IL-17RA表达水平;IL-17A降低SKOV3细胞对DDP的敏感性（P<0.05）;DDP诱导SKOV3细胞内自噬相关蛋白Beclin-表达增强,自噬降解底物P62蛋白减少;IL-17A/IL-17RA增强了DDP自噬诱导作用（P<0.05）;3-MA 阻断自噬后,SKOV3细胞凋亡率较干扰前明显升高,细胞抗凋亡蛋白Bcl2表达水平降低、凋亡蛋白Bax表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 IL-17A/IL-17RA可能通过上调DDP诱导的自噬水平降低人卵巢癌SKOV3细胞化疗敏感性。     

PEP-1-CAT抑制氧化应激条件下大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

目的:研究PEP-1-CAT融合蛋白转导入大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,MSC)的能力,以及其预处理对MSC在氧化应激损伤条件下凋亡的影响及其机制。方法:采用流式细胞仪检测MSC表面标记物CD29、CD90、CD45、CD34,并检测成脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化能力。采用免疫荧光染色和Western blot检测融合蛋白His-CAT和His-PEP-1-CAT转导入MSC的能力。DAPI染色和流式细胞仪检测细胞的凋亡率,采用相应的试剂盒分别检测丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性的改变和线粒体膜电位的变化。结果:MSC低表达CD34(1.78%)、CD45(1.41%),高表达CD29(94.3%)、CD90(95.5%),具有成脂、成骨多向分化的潜能。PEP-1-CAT转导入MSC中呈现时间和剂量依赖性特征,而His-CAT不能进入细胞内。与His-CAT组相比较,PEP-1-CAT融合蛋白预处理组MSC的凋亡率明显降低,LDH和MDA含量明显下降,减轻了因氧化应激引起的线粒体膜电位的下降。结论:PEP-1-CAT融合蛋白通过清除活性氧,维持线粒体膜电位的稳定,显著抑制了MSC在氧化应激损伤情况下的凋亡。     

腺病毒介导过表达ANT1基因诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的利用腺病毒载体转染体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶1(adenine nucleotide translocase 1,ANT1)对大鼠VSMCs凋亡的影响。方法用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)感染VSMCs,采用激光共聚焦观察Hoechst33258染色后细胞凋亡情况,流式细胞术检测Annexin V标记细胞凋亡率。Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达。结果激光共聚焦观察转染Ad-ANT1后48 h细胞出现凋亡,且凋亡率[(13.40±1.14)%]与转染空载体对照组[(1.80±0.84)%]相比较差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术检测转染Ad-ANT1后48 h细胞凋亡率[(10.66±1.75)%]明显高于转染空载体组细胞[(3.13±0.37)%](P<0.05)。Western blot结果显示转染Ad-ANT1后Bax蛋白表达明显高于转染空载体组,Bcl-2蛋白表达2组比较无明显差异。结论腺病毒介导过表达ANT1可诱导大鼠VSMC的凋亡,其机制可能通过上调Bax实现。     

L-精氨酸经一氧化氦途径对人结肠癌细胞株LS174的作用及其机制

目的探讨L-精氨酸(L-Arg)经一氧化氮途径对人结肠癌细胞株LS174的作用及其机制。方法LS174细胞在不同浓度L-Arg干预后,采用MTT法检测细胞增殖活性;光镜和电子显微镜观察细胞形态和结构的变化;AnnexinV/PI标记染色测定凋亡细胞;Western blotting和免疫细胞化学染色SP法检测VEGF、COX-2、p53、bcl-2和bax的表达。结果低浓度(0.125mmol/L)L-Arg对LS174细胞的生长有促进作用,高浓度(0.5、2、8、32mmol/L)L-Arg对LS174细胞的生长有抑制作用;在高浓度L-Arg组作用48h后引起了细胞核和细胞质一系列超微结构改变,电子显微镜可见LS174出现细胞缩小、染色质边集、固缩等细胞凋亡的形态改变;对照组凋亡细胞百分比为2.84%,低浓度L-Arg组凋亡细胞百分比为2.29%,随着L-Arg浓度增加,凋亡细胞百分比增加明显,分别为26.88%、28.95%、63.36%、84.51%;VEGF和COX-2在低浓度L-Arg组表达较对照组有增加趋势;p53和bcl-2在高浓度L-Arg组表达较对照组有明显降低趋势;bax在高浓度L-Arg...     

汉防己甲素联合紫杉醇对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究汉防己甲素(tetrandrine,TET)联合化疗药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)对人胃癌细胞增殖和凋亡的影响?方法:MKN-45细胞常规培养于RPMI-1640培养液中,细胞长至亚单层后加TET和 (或)PTX,连续培养48 h?四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分析细胞增殖情况,DAPI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡情况?结果:TET和PTX单药或联合均呈剂量依赖性地抑制MKN-45细胞增殖,两药联合时IC50较两药单用时显著降低(P < 0.05)?DAPI染色和流式细胞仪显示TET和PTX联合用药组细胞凋亡率显著高于单药组(P < 0.05)?结论:TET联合PTX对胃癌细胞的增殖抑制及凋亡诱导有良好的协同效应?     

黄酮类化合物GL-V9对人胃低分化黏液腺癌细胞株的凋亡作用及其机制

探讨黄酮类化合物GL-V9对人体低分化胃黏液腺癌细胞系MGC-803和BGC-823的凋亡作用及其机制。采用MTT法观察不同浓度的GL-V9作用于两种胃癌细胞后对其细胞活力的影响。采用Annexin V-FITC/PI双染法、DAPI染色法观察GL-V9对MGC-803细胞株凋亡率和细胞核形态的影响。采用免疫印迹法观察GL-V9对MGC-803细胞株中主要凋亡蛋白caspase-9,caspase-3的影响。应用钙离子荧光探针Fluo-3 AM检测GL-V9对MGC-803细胞株内钙离子浓度变化的影响。实验结果表明,GL-V9可以抑制胃癌细胞株MGC-803,BGC-823细胞活性,改变MGC-803细胞核形态,激活caspase-9,caspase-3蛋白,诱导细胞凋亡。同时,GL-V9可以显著上调MGC-803细胞中钙离子水平,这可能与GL-V9作用下的胃癌细胞株中线粒体凋亡通路的激活相关。     

人羊膜上皮细胞的体外培养及标记

目的 改良人羊膜上皮细胞的培养方法,检测生长特性,观察DAPI标记HAECs的效率。 方法 取足月剖宫产术后羊膜经胶原酶和胰蛋白酶消化获得上皮细胞。MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞的生长周期,免疫组化对细胞角蛋白进行鉴定。并用DAPI标记,测1、2周荧光阳性率。 结果 培养的HAECs多角形,生长分为缓滞期、对数增长期和平台期,约80%处于细胞周期的静止期G0。细胞角蛋白keratin阳性表达。DAPI标记1周标记率为100%;2周细胞形态好,标记率不变,荧光强度减弱。 结论 本实验方法成功培养人羊膜上皮细胞。DAPI短期标记效果理想。