重组BCG联合抗痨药物对小鼠结核病治疗作用的实验研究

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（Granulysin，GLS）和小鼠IL-12基因的重组BCG与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果。方法：将结核分枝杆菌H37Rv感染的BALB／c小鼠40只随机分成4组。感染4周后分别用生理盐水、重组卡介苗（BCG）、INH＋PZA和重组BCG联合INH＋PZA治疗，于第一次治疗后3个月，处死小鼠，检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-7．肺、脾组织中GLS表达，同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果：重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量（10gCFU／g）比重组BCG和INH＋PZA治疗组显著降低；重组BCG和INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低。重组BCG组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组BCG联合INH＋PZA治疗组和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组。重组BCG组用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。重组BCG和INH＋PZA组病变轻且局限，生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主，病变广泛。重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺组织病变最轻。结论：GLS／IL-12重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用；重组BCG联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效。     

GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌的构建及其在小鼠体内的表达

目的 构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌,并经鼻黏膜免疫观察其在小鼠体内的表达.方法 将人GLS和小鼠IL-12基因及分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化耻垢分枝杆菌,再将该重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,第1次免疫后4周,处死小鼠,用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达,用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平.结果 得到可表达GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌;在Balb/c小鼠肺、脾组织中均检测到重组耻垢分枝杆菌的分布,以及GLS的表达,并有血清IL-12水平升高和黏膜特异性SIgA的产生.结论 成功构建GLS和IL-12修饰的重组耻垢分枝杆菌,该重组菌经鼻黏膜免疫小鼠后,可引起呼吸道黏膜特异性抗菌免疫,以及GLS和IL-12的体内表达,为新型疫苗的研究奠定了基础.     

GLS和IL-12偶联重组耻垢分枝杆菌免疫效果的观察

目的：研究携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠IL-12基因质粒（pZM03）偶联重组耻垢分枝杆菌（ATCC607）经鼻黏膜免疫小鼠后,小鼠体内的免疫状况.方法：BALB/c小鼠36只,随机分为生理盐水、pZM03、ATCC607、卡介苗（BCG）、重组ATCC607（即携带pZM03的ATCC607）、灭活重组ATCC607组;采用滴鼻法免疫小鼠,BCG组0、14天各1次,其它组0、4、14天各1次,第0天免疫后4周处死小鼠,用ELISA检测血清中IFN-γ、IL-12、IgG2a、lL-4的分泌水平和淋巴细胞PPD诱导的IFN-γ分泌水平以及肺泡灌洗液特异性SIgA的水平,用MTS法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况.结果：重组ATCC607血清中IFN-γ、IL-12水平与BCG组无明显差异但明显高于其他组（P＜0.05）,IgG2a水平重组ATCC607组高于BCG组和其他组（P＜0.05）,各组间IL-4水平差异无统计学意义.重组ATCC607、BCG、灭活重组ATCC607及ATCC607组用PPD均可诱导小鼠脾淋巴细胞增殖,各组间差异无显著意义,但与生理盐水和pZM03组间差异有显著意义（P＜0.05）.重组ATCC607组PPD诱导淋巴细胞IFN-γ明显高于其它组（P＜0.05）,与BCG组比较无显著差异.重组ATCC607等含菌组经鼻黏膜免疫可产生黏膜特异性SIgA.结论：重组ATCC607经鼻黏膜免疫小鼠后,机体特异性免疫特别是细胞免疫和黏膜免疫增强,为重组ATCC607治疗结核病的研究奠定了基础.     

IFN—γ与TNF联合治疗结核菌感染小鼠疗效及机理的研究

目的 研究IFN-γ和TNF对结核分枝杆菌感染小鼠的疗效及作用机制。方法 小鼠感染结核分枝杆菌后第5d给予IFN-γ和/或INF治疗,观察治疗后半数死亡时间、一定时间内的死亡率、脾脏内活菌数,检测脾细胞分泌IFN-γ和IL-4水平（ELISA法）及Mφ产生NO水平（用Griess试剂）。结果 与单纯攻毒组比较,联用IFN-γ和TNF组感染小鼠半数死亡时间明显延长、35d内的死亡率从100%降低到20%、脾脏内活菌数显著减少,脾细胞IFN-γ分泌水平明显升高,IL-4分泌水平显著降低,Mφ产生NO水平明显增加。结论 IFN-γ和TNF联合诱导Mφ产生NO,促进TH1细胞反应,抑制TH2细胞反应,改变了TH1/TH2平衡,对结核分枝杆菌感染小鼠产生保护效应。     

重组耻垢分枝杆菌制剂预防幽门螺杆菌感染的作用机理的初步探讨

目的探讨重组耻垢分枝杆菌实验制剂（recombinant Mycobacterium smegmatis，rMs）预防幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的作用机理。方法实验制剂免疫BLAB／c小鼠4周，用Hp攻击后4周，取血清、胃、脾组织，RT-PCR检测小鼠胃黏膜和脾组织的TH1型细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）与TH2型细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）；用ELISA检测针对唧的特异性血清IgG、IgG1、IgG2a和IgA水平；用免疫组化方法检测胃黏膜固有层IgA表达；用MTT检测脾淋巴细胞增殖。结果免疫后BALB／c小鼠特异性抗体显示rMs制剂诱导Hp特异性血清IgG、IgA水平都升高，以IgG2a占优势。用Hp抗原刺激后各免疫组小鼠脾淋巴细胞均有明显增殖。免疫组化显示各免疫组小鼠胃黏膜固有层IgA阳性标记腺体数明显高于对照组。RT-PCR证实，跏攻击之前，各免疫组胃和脾组织已出现了IFN-γ、IL-12、IL-2表达而无IL-4、IL-6、IL-10表达。PBS对照组和单纯耻垢分枝杆菌（Ms）组胃黏膜和脾组织各细胞因子均无表达；Hp攻击后，PBS和单纯Ms组胃组织出现以TH1细胞IFN-γ为主的增生，IFN-γ水平显著高于rMs组（P〈0．05）；而3个rMs制剂组脾脏则出现以TH2细胞（IL-4）为主的增生，IL-4水平显著高于对照组（P〈0．05）。提示该制剂的作用机制是诱导TH1，TH2平衡型免疫应答。结论成功地建立了BALB／c小鼠的Hp感染模型，对rMs制荆的免疫保护机理研究结果显示，rMs能产生以TH1细胞和TH2细胞协同作用的保护性免疫应答。     

小鼠psIL-12质粒抗结核分枝杆菌感染的研究

目的观察、评价小鼠白细胞介素12真核表达质粒psIL-12对结核分枝杆菌感染小鼠细胞因子水平的影响及疗效.方法结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠随机分成生理盐水、pcDNA3.1对照组,psIL-12治疗组,每组各6只.感染4周后分别予以生理盐水、pcDNA3.1、psIL-12,第1次治疗后8周处死检测器官活菌数,脏器重量指数(WI),脾淋巴细胞特异性IFN-γ、IL-4细胞因子分泌水平,并观察肺、脾组织病理改变情况.结果 psIL-12治疗组肺组织活菌数(每mg log10CFU/ml)为7.41±0.50,与对照组(8.15±0.37、8.19±0.29)比较显著降低(P＜0.05);脾组织荷菌量(每mg log10 CFU/ml)为5.31±0.21,与对照组(5.76±016、5.88±0.21)比较显著降低(P＜0.05).psIL-12治疗组脾脏重量指数为0.58±0.05,与对照组(1.02±0.08、1.10±0.02)比较显著降低(P＜0.05).脾淋巴细胞IFN-γ(pg/ml)为478.0±10.1,与对照组(134.5±15.7、125.1±8.2)比较显著升高(P＜0.05).各组间IL-4水平差异无显著性.对照组肺组织病理改变以变质、渗出为主,而psIL-12治疗组以增生改变为主.对照组与治疗组间比较脾脏病理改变不明显.结论 psIL-12真核表达质粒对小鼠结核分枝杆菌感染有一定的治疗作用,可能通过诱导促进IFN-γ产生,调节TH1/TH2应答类型,起到抗结核分枝杆菌感染的作用.     

结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性.方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数.结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用.结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选.     

pBudCE4.1/PPE68DNA疫苗诱导Balb/c小鼠产生Th1免疫应答

目的构建结核分枝杆菌PPE68 DNA疫苗,并探讨其在小鼠体内诱导的Th1免疫应答。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和复制子OriM基因亚克隆入真核表达质粒pBudCE4.1中构建穿梭质粒,并用其免疫Balb/c小鼠,于第3次免疫后2周处死小鼠,分别检测免疫小鼠血清IgG2a水平、IFN-γ和IL-12水平;特异性蛋白刺激后淋巴细胞增殖状态;小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果 PPE68 DNA疫苗免疫小鼠后血清中的IgG2a水平、IFN-γ和IL-12均有意义的提高,脾淋巴细胞增殖显著。脾肺未见明显病理改变。结论 PPE68DNA疫苗可有效诱导小鼠Th1免疫应答,为进一步研究其抗MTB的免疫保护作用奠定了基础。     

细胞因子IL-2、IL-12及IL-18增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的免疫保护作用

目的探讨白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)以及白细胞介素-18(IL-18)对结核分枝杆菌ESAT-6DNA疫苗免疫保护作用的影响。方法 50只雌性Balb/c小鼠随机分为IL-2-pcDNA-ESAT-6、IL-12-pcDNA-ESAT-6、IL-18-pcDNA-ESAT-6、pcDNA-ESAT-6以及PBS对照组,分别于0、2、4周共免疫3次。末次免疫2周后各组处死5只小鼠,ELISA检测小鼠血清IgG、IgA,并分别检测0、2、4、6周小鼠阴道灌洗液中sIgA水平。CCK-8法检测免疫小鼠脾细胞的增殖情况,并测定脾细胞上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10的分泌水平。末次免疫2周后,腹腔注射结核杆菌H37Rv感染小鼠,感染后4周取小鼠肺组织进行菌落培养计数;同时通过HE染色以及肺组织炎症因子检测评估其炎症情况。结果细胞因子IL-2、IL-12以及IL-18均能够显著增加小鼠血清IgG、IgA以及阴道灌洗液sIgA的分泌(P0.05),并促进免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖(P0.05);IL-2、IL-12及IL-18还能够显著增加脾细胞中IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌水平;此外,相较于ESAT-6真核疫苗组以及PBS对照组,IL-2、IL-12及IL-18均能够显著降低小鼠肺组织菌体载量以及炎性侵润,并减少炎性因子分泌。结论细胞因子IL-2、IL-12及IL-18均能不同程度的增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的体液以及细胞免疫应答水平,并显著提高其免疫保护效果。     

毒蕈碱3型受体胞外区第二环多肽诱导NOD-scid小鼠体内IL-17和IFN-γ的分泌

目的:观察用毒蕈碱3型受体(M3R)胞外区第二环多肽免疫NOD-scid小鼠(nonobese diabetic mice CB17.Prkdcscid/J,非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠)后,小鼠体内IL-17和IFN-γ分泌水平的变化.方法:200 μg的M3R胞外区第二环多肽和不完全弗氏佐剂(IFA)以1∶1的比例配制而成后,皮下免疫NOD-scid小鼠.免疫后1、7、14、21 d尾部采血检测血清中的抗M3R第二环多肽抗体,血清中IL-17和IFN-γ含量的变化,同时测定每星期每只小鼠的饮水量.21 d给予小鼠安乐死,取小鼠脾脏细胞与抗M3R第二环多肽共同培养,观察细胞上清中IL-17和IFN-γ含量的变化.同时取小鼠泪腺做免疫荧光观察IL-17和IFN-γ的变化.结果:用M3R胞外区第二环多肽免疫NOD-scid小鼠14 d后,小鼠体内的抗M3R第二环多肽抗体显著高于对照肽组和PBS组(P＜0.05),血清中IL-17和IFN-γ含量在第14天和第7天显著升高,具有统计学意义(P＜0.01).脾细胞多肽共培养后细胞上清中的IL-17的含量维持在一定的水平,而对照肽组和PBS组则显著下降(P＜0.01).组织免疫荧光显示泪腺中的IL-17和IFN-γ的含量也显著提高.每只小鼠的饮水量3组没有显著差别(P＞0.05).结论:用M3R胞外区第二环多肽免疫NOD-scid小鼠后成功诱导出抗M3R第二环多肽抗体,并且促进了NOD-scid小鼠体内IL-17和IFN-γ的分泌.     

Richard M. Goodman,M.D.

We describe 3 young children with Hallermann–Streiff syndrome, 2 with typical manifestations and 1 with the facial changes without the eye abnormalities but with a cleft palate and with complete syndactyly of fingers IV and V. The latter case represents overlap of the Hallermann–Streiff syndrome and oculodentodigital dysplasia. “Dwarfism” as a possible clinical risk marker of mental retardation is discussed. As cause, a mendelian autosomal dominant mutation seems most probable.     

Thin-layer chromatography systems for the identification of Mycobacterium tuberculosis, M. bovis BCG, M. kansasii, M. gastri and M. marinum.

Knowledge of mycobacterial glycolipid antigens and the study of their specificity have resulted in their utilization as species markers. We describe a thin-layer chromatography method which could serve as a useful adjunct for the identification of Mycobacterium tuberculosis, M. bovis BCG, M. kansasii, M. gastri and M. marinum.