应用反向点杂交法检测α-地中海贫血点突变

目的建立一种临床上切实可行的非缺失型α-地中海贫血基因检测方法。方法中国人常见的非缺失α-地中海贫血为αCSα、αQSα、αWSα3种类型,针对此3个位点设计特异性带有生物素标记的引物进行PCR扩增,扩增产物与固定在膜条上的寡核苷酸探针进行杂交,并通过一系列显色反应分析结果。结果分别分析3种突变类型的正常及突变位点信号,明确检测样品在3个位点是否发生了突变,及是否为突变纯合子或杂合子,验证了该方法可诊断非缺失型!-地中海贫血点突变。结论该检测方法结果可靠,且简便易行,对实验室仪器设备要求不高,适合于在临床推广。     

应用反向点杂交法检测α-地海贫血点突变

目的 建立一种临床上切实可行的非缺失型α-地中海贫血基因检测方法.方法 中国人常见的非缺失α-地中海贫口血为αCSα、αQSα、αWSα 3种类型,针对此3个位点设计特异性带有生物素标记的引物进行PCR扩增,扩增产物与同定在膜条上的寡核苷酸探针进行杂交,并通过一系列显色反应分析结果.结果 分别分析3种突变类型的正常及突变位点信号,明确检测样品在3个位点是否发生了突变,及是否为突变纯合子或杂合子,验证了该方法可诊断非缺失型α-地中海贫血点突变.结论 该检测方法结果可靠,且简便易行,对实验室仪器设备要求不高,适合于在临床推广.     

寡核苷酸杂交检测c-Ha-ras癌基因的点突变

点突变是 c-Ha-ras 癌基因激活的常见途径之一,我们采用寡核苷酸杂交方法可以直接检测 c-Ha-ras 癌基因第十二位密码子的点突变,将其与体外基因扩增技术结合起来检测癌基因点突变,亦获满意结果,该方法的建立,有助于癌变机理、肿瘤的早期诊断等方面的研究。     

改进反向点杂交方法检测脑肿瘤基因突变

目的 探讨利用改进的的反向点杂交方法检测已知细胞因子及肿瘤相关基因在胶质瘤、听神经瘤及脉络丛乳头状瘤中表达及突变的可行性。方法 分别提取正常脑组织和胶质瘤、听神经瘤、脉络丛乳头状瘤组织听总ＲＮＡ,并反转录为ＣＤＮＡ,随机引物法标记探针,与点于特殊尼龙膜上的已以向杂交。结果 该方法可同时检测多种基因在四种组织中的表达,其中ＢＭＰ－６、ＧＨ,Ｓｉｓ,ｍｄｍ２在四种组织中均有较高水平表达,而ＢＭＰ－７,     

反向点杂交法检测β地中海贫血在产检中的应用

目的 探讨反向点杂交(RDB)法检测在产检中筛查β地中海贫血的应用价值.方法 采用RDB法,检测54例临床似诊为β地中海贫血患者.结果 在54例样本中,检出β地贫基因携带者17人.结论 ROD法在检测β地贫中,具有高通量、特异性强、操作简便无需接触放射性等优点.     

金黄色葡萄球菌反向线性杂交探针检测方法的建立

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌的简单、快速、灵敏、准确的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc 基因,设计一对通用引物及两条特异性探针,用生物素标记通用引物的5′端,将两条特异性探针固定于硝酸纤维膜上,使PCR产物与探针杂交。结果建立的反向线性杂交探针方法,其检测限为2 ng/μL,检测特异性和准确性均为100%。结论建立的反向线性杂交检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测。     

乙肝病毒突变位点的寡核苷酸与肽核酸阵列杂交检测

目的：比较利用寡核苷酸阵列和肽核酸阵列检测乙肝病毒突变位点。方法：针对乙肝病毒常见的1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、 1896G-A 3个突变位点,设计寡脱氧核苷酸和肽核酸检测探针,探针经固定后分别与不对称PCR荧光标记的靶DNA杂交,扫描分析荧光信号强度,DNA序列分析3位点的变异情况。结果：对于寡核苷酸芯片,1762与1764联合位点、1858以及1896位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为1.44、1/1.24、1.05。对于肽核酸芯片,相应位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为2.8、1/3.02、1.71。DNA序列分析结果表明该样本中1858位点为突变位点,1896以及1762与1764联合位点不存在突变。结论：与寡脱氧核苷酸探针相比,肽核酸与靶DNA杂交结合能力和识别单碱基错配能力均高于相应的寡脱氧核苷酸,二者杂交结果与测序结果一致。     

利用反向点杂交膜片检测结核杆菌多耐药基因的研究

目的:探讨反向点杂交膜片试剂盒在结核杆菌耐药性检测中的作用.方法:利用5种耐药基因检测试剂盒,对20株耐药的结核杆菌临床分离菌株、5例非结核病患者痰标本进行检测,结果与传统药敏试验结果进行比较.结果:20株耐药的临床分离菌株,膜片试剂盒检测19株判为耐药,总体耐药符合率为95.0%;其中3株膜片检测的耐药种类与药敏试验耐药种类完全一致;l株检测结果与药敏结果不同;5例非结核病患者痰标本膜片检测结果为阴性.结论:反向点杂交膜片试剂盒检测5种结核杆菌的耐药基因快速、简便,但检测出的耐药种类与传统药敏的符合率较低.     

反向线性点杂交技术在肺炎链球菌分型中的应用

目的 探讨反向线性点杂交技术在肺炎链球菌分型中的应用.方法 对临床诊断为肺炎的16例5岁以下患儿,从呼吸道吸取物、血和胸水培养分离获得的30株肺炎链球菌菌株应用反向线性点杂交技术进行分型,并与传统的血清学分型方法-夹膜肿胀实验进行比较.结果 反向线性点杂交技术和血清学方法对30株临床分离获得的肺炎链球菌菌株的分型结果完全一致,其分布情况为:血清型19A(n=9),14(n=5),23F(n=4),19F(n=4),6B(n=3),7F(n=2),15B(n=2),9V(n=1).16例肺炎患儿的肺炎链球菌血清型分布情况为血清型19A、14、23F及19F各来自3例患儿,血清型6B、7F、15B及19V各来自1例患儿.其中10例(62.5％)肺炎患儿分离获得的肺炎链球菌菌株涵盖在7价肺炎链球菌结合疫苗中,所有患儿获得的菌株均包含在23价多糖疫苗中.结论 对于肺炎链球菌,反向线性点杂交技术是一种可靠的分子生物学分型方法;在本组研究中,7价肺炎链球菌结合疫苗的涵盖率为62.5％,所有菌株均包含在23价多糖疫苗中.     

帕金森病患者线粒体DNA突变位点G1719A、G4580A、C7028T分析

目的研究有关线粒体DNA（mtDNA）点突变与我国人群散发性帕金森病（Parkinson disease,PD）的关系。方法采用经典的酚／氯仿抽提法对88例PD患者（研究组）和60例健康体检者（对照组）的全血基因组DNA进行抽提,针对与PD发病有关的mtDNA突变位点G1719A、G4580A、C7028T设计特异的引物,经过PCR鉴定和基因测序,在NCBI基因库上进行BLAST比对分析,发现突变位点。结果PD患者有10例在C7028T位点发现突变,8例在G1719A位点发现突变,3例在G4580A位点发现突变,对照组未发现突变位点。结论散发性PD患者存在线粒体基因的点突变,线粒体基因的点突变可能参与PD的发病过程。     

反向膜杂交技术检测结核分枝杆菌耐药株的临床价值研究

目的评价反向膜杂交技术对于肺结核病患者的结核分枝杆菌耐药基因检测的临床应用价值。方法利用反向膜杂交技术检测了40株耐药结核分枝杆菌培养分离株、10株非结核分枝杆菌培养分离株、240例肺结核患者痰标本的rpoB、katG,、inhA突变基因。240例痰标本同时进行结核菌培养。106株膜芯片检测阳性样本测序验证。结果特异性方面：膜芯片检测40株结核分枝杆菌培养分离株,均为阳性;10株非结核分枝杆菌培养分离株,均为阴性。灵敏度方面：膜芯片检测240例临床痰标本中,66例结核分枝杆菌阳性,占27.5%。耐药基因准确性方面：106例膜芯片检测阳性的样本进行测序验证,两者结果完全一致。结论反向膜杂交技术可快速检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药突变基因,与常规结核分枝杆菌培养、测序检测耐药基因的结果相符,可应用于临床。     

溶血血清中病毒基因的核酸斑点杂交法检测

本文采用缺口翻译法对克隆化HBV DNA作α-~(32)P-dCTP标记,所标记的HBVDNA具有较高比放射活性(7×10~7cpm/μg DNA)。以其作为基因探针及家鹅血清和健康人血清作为样品,采用两种常用的核酸斑点杂交法及一种改良的方法对人为制造的溶血血清中HBVDNA进行检测。结果显示,前两种方法会产生假阳性信号而后一种方法不会。出此,对血清进行预处理的改良方法适用于溶血血清中病毒基因的特异性检测。     

铜绿假单胞菌oprI基因的反向斑点杂交检测法

目的 建立一种早期快速检测铜绿假单胞菌的方法。方法 根据铜绿假单胞菌特异的oprI基因设计引物,聚合酶链反应合成特异探针,光敏生物素标记细菌DNA,应用反向斑点杂交法检测铜绿假单胞菌。结果 所合成的探针具有高度特异性,能鉴别铜绿假单胞菌,与其他细菌、病毒、真菌间无交叉反应。该方法能检测出100 ng细菌DNA。结论 反向斑点杂交法具有快速、特异的优点,对铜绿假单胞菌的早期检测具有重要意义。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

B19微小病毒70-mer寡核苷酸探针的设计

目的　设计B19微小病毒诊断基因芯片的寡核苷酸探针。方法　以微小病毒B19为例 ,利用BLAST软件对其序列进行比对并获得特异序列 ;利用软件Oligo 6设计特异性高、Tm值接近、长度均一的寡核苷酸探针。 结果　获得 12条 70 mer寡核苷酸探针 ,用于芯片打印及病毒检测。结论　利用BLAST系统和生物学软件Oligo 6可简便而有效地设计诊断芯片探针     

地高辛配基标记DNA打点杂交和原位杂交...

DNA of Leptospira interrogans sv. lai strain 017 was labelled with digoxigenin or alpha 32P or biotin and used as probes to detect DNA of leptospires. Probes labelled with digoxigenin were able to detect 0.1-1 pg of homologous DNA and 10(2) of L. interrogans sv. lai strain 017. Probes alpha 32P and biotin detected 1 pg and 10 pg of homologous DNA and 10(3), 5 x 10(3) of L. interrogans sv. lai strain 017 respectively. These three probes couldn't detect L. biflexa sv. patoc strain Patoc I, L. illini strain 3055, Escherichia coli. Bacillus aerogenes capsulalus, Salmonella anatis, K-DNA of Leishmania, and of human WBC. Comparison of digoxigenin-, alpha 32P- and Biotin-labelled probes in the dot-blot hybridization assay on different serogroup sv. of leptospires revealed that digoxigenin-labelled probes were more sensitive than alpha 32P and biotin-labelled probes. The results indicate that digoxigenin-labelled probes DNA can be used for detection of leptospires in field and clinic. We also report procedures in situ hybridization with leptospira in tissues smear and plasma sediment of an experimentally infected guinea pig. It offers the advantage of recognizable of leptospiral morphology in combination with a hybridization signals. The results indicate that digoxigenin-labelled DNA probes of 017 strain might provide tool for routine diagnosis and classification in cases of leptospiral interrogans infection.     

线粒体脑肌病患者骨骼肌mtDNA点突变与发病类型的关系

目的：探讨线粒体脑肌病患者骼肌mtDNA在3243及8344位点的点突变与发病类型的关系,方法：提取5例患者骨骼肌中的总DNA,对2对寡核苷酸为引物行PCR扩增,分别应用BglI和Apal酶酶切后,琼脂糖电泳判定,结果：2例患者nt3243位点出出A→G点突变,座中样发病型（MELAS）和不整红边纤维型9MERRF）各1例,2例MERRF患者nt8344位点出现A→G点突变,其中1例同时存在着3243位点突变,结论：nt3243及nt8344位点突变分别与MELAS和MERRF的发病有关,1例MERRF中层得同时在上述2个位点的突变,这可能与线粒体脑肌病临床表现的多样化有关。