survivin启动子的克隆及在HeLa细胞中控制GFP特异性表达

目的: 扩增survivin基因启动子并构建带有survivin启动子的pEGFP-N1真核表达载体 ,检测survivin基因启动子在HeLa细胞中的特异表达活性.方法: ①以HeLa细胞基因组DNA为模板,PCR 扩增survivin启动子,回收扩增产物并插入pGEM-TEasy载体(T/Surp),测序鉴定.②分别双酶切 T/Surp载体和不含CMV启动子的pEGFP-N1载体,回收survivin启动子酶切片段及pEGFP-N1酶切线性化片段,连接回收产物构建携带survivin启动子pEGFP-N1真核表达载体(pEGFP-N1/ Surp),酶切鉴定 .③转染HeLa细胞及正常血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下观察GFP的表达.结果: 酶切及测序证实成功扩增survivin基因启动子,并构建了携带有survivin基因启动子的pEGFP-N1真核表达载体.转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见HeLa细胞发出较强的绿色荧光,而在ECV304细胞未见绿色荧光. 结论: 成功克隆的肿瘤特异性survivin启动子在HeLa细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础.     

几种肿瘤特异性启动子在人肝癌细胞系中的活性比较

目的 克隆甲胎蛋白(AFP)、survivin(SUR)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子,检测并评价其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法 采用PCR法扩增获得AFP、SUR、hTERT基因的启动子片段,将之克隆到表达虫荧光素酶基因的报告质粒上,检测AFP、SUR、hTERT基因启动子在肝癌细胞系和正常组织中的转录活性,评价其转录活性水平和肿瘤特异性.结果 成功克隆了AFP、SUR、hTERT启动子,证实AFP、SUR、hTERT启动子在肝癌细胞中具有肿瘤特异性转录活性,SUR启动子活性最高,其活性水平为AFP启动子的52～98倍;hTERT启动子次之,其活性水平为AFP启动子的14～30倍;AFP启动子活性最低.结论 hTERT和SUR启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性和显著的肿瘤特异性,可望开发成为新型的肝癌靶向性基因治疗工具.     

hTERT启动子特异性调控炭疽毒素致死因子表达以杀伤人肺腺癌A549细胞的研究

目的观察人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)靶向调控炭疽毒素致死因子(LF)表达对人肺腺癌A549细胞活力及凋亡/坏死的影响。方法构建含hTERTp或CMV启动子(CMVp)且表达LF的真核质粒表达载体(phTERTp-LF或pCMV-LF),分别转染人肺腺癌A549细胞株和正常人胚肺成纤维MRC-5细胞株。针对A549、A549hTERTp-LF、A549CMVp-LF、MRC-5、MRC-5hTERTp-LF、MRC-5CMVp-LF六组细胞,分别采用RT-PCR和Western blot检测LF mRNA和蛋白表达,用MTT分析检测细胞活力,用流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死。结果与A549组比较,A549hTERTp-LF组、A549CMVp-LF组均出现明显的LF mRNA和蛋白表达,以及细胞活力降低和凋亡/坏死率上升;与A549hTERTp-LF组相比,A549CMVp-LF组LF mRNA和蛋白表达更高,细胞活力降低和凋亡/坏死率上升更明显。与MRC-5组比较,MRC-5hTERTp-LF组也不能测出LF mRNA和蛋白表达,细胞活力和凋亡/坏死率亦无明显变化,但MRC-5CMVp-LF组的LF mRNA和蛋白表达上升,细胞活力降低和凋亡/坏死率增加。结论 hTERTp能特异性地驱动LF表达并杀伤人肺腺癌A549细胞,但避免了对MRC-5细胞的毒性,可望提供一种针对肺腺癌细胞且不良反应小的靶向治疗策略。     

Survivin基因启动子的克隆及在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性研究

目的 研究Survivin基因启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性.方法 采用非限制酶方法获得具有酶切黏性末端的Survivin最小启动子,将其克隆到含有报告基因增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的载体pEGFP-1和含有荧光素酶Luciferase的质粒载体pGL3-Basic,经脂质体分别转染人正常乳腺上皮细胞系HBL-100和乳腺癌细胞MCF-7,荧光显微镜下观察EGFP 的表达情况,同时测定2种细胞中荧光素酶表达的差异.结果 Survivin启动子在MCF7细胞中呈现高转录活性; 而在HBL100细胞中转录活性极低.结论 Survivin启动子在肿瘤细胞MCF7中具有很强的特异性,为进一步开发肿瘤特异性基因治疗奠定了实验基础.     

端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的克隆及在人肝癌细胞的肿瘤特异性分析

目的:克隆hTERT基因启动子并检测其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法:采用PCR法扩增获得hTERT基因的启动子片段,将之克隆到表达虫荧光素酶基因的报告质粒上,通过测定荧光素酶报告基因的表达,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系和正常组织中的转录活性,并将之与甲胎蛋白(alpha-fetal-protein,AFP)基因启动子活性相比较,评价其作为肝癌基因治疗中应用的肿瘤特异性启动子的可行性.结果:成功克隆了hTERT启动子,证实hTERT启动子在肝癌细胞中具有相当强的转录活性,其活性水平为AFP启动子的14～30倍;在原代培养的成纤维细胞中其启动子未表现转录活性.结论:hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性和显著的肿瘤特异性,可望开发成为新型的肝癌靶向性基因治疗工具.     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

人端粒酶逆转录酶单位启动子和存活因子启动子在肿瘤靶向性基因治疗中的作用

目的 通过体内外研究人端粒酶逆转录酶单位(hTERT)启动子和存活因子启动子在实现肿瘤基因治疗靶向性中的作用并探讨其应用前景.方法 PCR方法扩增hTERT启动子片段和存活因子启动子片段,并构建包含重组可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)的重组腺相关病毒载体.体外转染四株肝细胞癌细胞株及人原代正常肝细胞(PHH),通过EGFP表达及MTT检测启动子活性.体内建立SMMC-7721皮下移植瘤模型,观察瘤内注射rAAV病毒对肿瘤生长的影响.结果 两启动子驱动的外源基因表达具有肿瘤细胞特异性,且它们驱动的TRAIL表达能降低HCC的存活率,而不能降低PHH存活率.以rAAV为载体,hTERT启动子驱动的TRAIL能显著抑制皮下肿瘤生长.结论 肿瘤特异启动子是实现以rAAV为载体的肿瘤靶向基因治疗的潜在手段.     

hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的研究hTERT启动子调控下CD137L表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞系中的表达,探讨CD137L靶向基因治疗的可行性。方法采用RT-PCR法从K562细胞中克隆CD137L全长基因, 将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建的质粒为pcDNA3-hCD137L,用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ双酶切后将CD137L再定向插入pBTdel-279中,构建成hTERT启动子调控下CD137L表达载体pBTdel-279-hCD137L,采用酶切法和测序法鉴定。用Fugene6转染试剂盒将两种重组质粒分别瞬时转染人卵巢癌细胞株OVCR3和人胚肺成纤维细胞株HELF,RT-PCR和流式细胞仪检测CD137L的表达。结果测序证实所克隆的CD137L基因序列与GENEBANK中的序列相符。经限制性内切酶酶切,电泳后显示片段插入正确,证实构建成功。pcDNA3-hCD137L转染后OVCR3细胞和HELF细胞均可检测到CD137L的表达,但pBTdel-279-hCD137L转染后仅在OVCR3细胞中检测到其表达,在HELF细胞中无表达。流式细胞显示pBTdel-279-hCD137L转染效率低于pcDNA3-hCD137L。结论hTERT启动子调控下CD137L表达载体构建正确,并可在卵巢癌细胞中较高表达,为探讨靶向基因治疗提供了实验依据,但hTERT启动子活性仍低于CMV启动子     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

survivin启动子有效片段的克隆及其在胃癌细胞AGS中的转录活性研究

目的 克隆survivin启动子的有效片段，并检测它在人胃癌细胞株AGS和人正常胃上皮细胞GES-1中的转录活性，为该启动子在胃癌的靶向性基因治疗中奠定基础。方法 用PCR扩增survivin基因的启动子片段，克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic，构建pGL3-sur-pro重组质粒，用脂质体法瞬时转染AGS及GES-1中，检测survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3-CMV-pro重组质粒作为阳性对照。结果 琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增的survivin启动子片段长约440bp，测序结果与GenBank中survivin启动子序列一致。成功构建了pGL3-sur-pro重组质粒。荧光素酶活性检测显示，survivin启动子片段在细胞株AGS中有较高转录活性，而在GES-1中几无转录活性。结论 本实验克隆的survivin启动子有效片段在胃癌细胞株AGS中有转录活性，在正常胃上皮细胞中无活性。其有可能作为调控元件用于胃癌的靶向性基因治疗。     

survivin启动子的克隆及其在前列腺癌细胞系中的活性鉴定

目的克隆survivin启动子片段,并检测其在人前列腺癌细胞中的转录活性,为该启动子在前列腺癌靶向基因治疗中的应用提供实验依据。方法PCR方法扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro,克隆入pGL3-Basic,分别构建重组质粒pGL3-S1pro和pGL3-S2pro,脂质体转染前列腺癌细胞和Changliver肝细胞,检测survivin启动子在细胞中的转录活性。结果survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,其中S2pro活性明显高于S1pro,达到CMV启动子活性的三分之一。结论survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,有可能成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。     

川陈皮素诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的研究

目的:探讨川陈皮素(5,6,7,8,3′4-′hexamethoxyflavone)促非小细胞肺癌A549细胞凋亡的作用。方法:以不同浓度的川陈皮素作用于A549细胞,分别用细胞生长曲线、集落形成抑制实验研究川陈皮素对A549的增殖抑制作用,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,流式细胞术观察细胞周期改变。结果:生长曲线提示川陈皮素对A549细胞的抑制作用呈明显的时效和量效关系;集落形成抑制实验表明:药物浓度10μg/mL~40μg/mL对A549集落形成抑制率为10%~50%。Hoechst 33258染色后细胞、细胞核出现明显的凋亡形态学变化;DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型DNA梯状条带。流式细胞仪检测到细胞周期阻滞于G2/M期,G0/G1期细胞明显减少;随着剂量的增加凋亡率明显增高。结论:川陈皮素可以诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡。     

槲皮素对肺腺癌A549细胞生长的影响

目的 观察槲皮素对肺腺癌A549细胞生长及对hTERT基因表达的影响. 方法以台盼蓝拒染法计数肺腺癌细胞的生长抑制率,透射电镜和DNA Ladder实验了解A549细胞凋亡的发生;PCR-TRAP法检测端粒酶活性,实时RT-PCR检测hTERT mRNA表达.结果 台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制肺腺癌A549细胞增殖的作用明显,且呈剂量和时间依赖性,槲皮素处理48 h后的IC50为22.5 μmol/L.DNA Ladder实验和透射电镜形态学检测显示出细胞凋亡的特征性变化,细胞呈现核固缩、染色质边集、凋亡小体形成等典型凋亡表现.经槲皮素处理后肺腺癌A549细胞hTERT mRNA表达降低,端粒酶活性受抑制. 结论槲皮素能抑制肺腺癌细胞的生长,呈时间、剂量依赖性,能诱导A549细胞凋亡,其抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调hTERT 基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关.     

靶向survivin的siRNA联合顺铂抑制肺腺癌A549细胞增殖的实验研究

目的:研究靶向survivin的siRNA和顺铂联用对肺癌细胞A549的增殖抑制作用.方法:将A549细胞分为空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-Nc转染组,顺铂处理组,pSileneer2.0-SVV2转染组,pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组.转染采用脂质体法.MTT法检测靶向survivin的siRNA和顺铂对A549细胞增殖的抑制作用;RT-PCR法检测A549细胞survivinmRNA转录水平变化情况;流式细胞术和TUNEL.法检测A549细胞凋亡情况.结果:MTT法示:pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组增殖抑制率为51.38%±1.35%,与其它各组相比抑制率明显增高,具有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测显示空白对照组,阴性对照质粒pSilencer2.0-NC转染组,顺铂处理组survivinmRNA表达无明显变化(P>0.05).pSilencer2.0-SVV2转染组、pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组survivin mRNA表达明显下降(P<0.05);流式细胞术和TUNEL法检测pSilencer2.0-SVV2转染+顺铂处理组凋亡率分别为42.48%±2.28%和40.65%4±3.53%,与其它各组相比凋亡率明显增高,具有统计学意义(P<0.05).结论:将靶向survivin的siRNA和顺铂联合应用可以协同抑制A549细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用.     

人肺癌细胞γ-干扰素基因的转染及特性分析

目的:建立转基因A549细胞株,从特性上进行分析,探讨其作为抗肿瘤瘤苗的可能性.方法:将pLXSN质粒与人IFN-γ基因体外重组,转染入人肺腺癌细胞株A549中,经筛选获得稳定表达γ-干扰素的A549-IFN-γ细胞株,对其生长特性、细胞表面MHC分子表达变化、IFN-γ的分泌量及致瘤性等方面进行了探讨.结果:转基因细胞株与原细胞株相比较,生长状态没有明显的变化,转基因细胞株可稳定表达并向细胞外分泌γ-干扰素;而且其细胞表面MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达明显增加,提示其免疫原性增强;裸鼠实验表明其致瘤性下降.结论:该转基因细胞株有可能成为治疗肺癌的转基因瘤苗.     

人肺癌细胞系A549中肿瘤干细胞样细胞的分离及鉴定

目的 从人肺癌细胞系A549中分离并鉴定肺癌干细胞.方法 将A549细胞置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,采用平皿克隆形成实验、MTT细胞增殖实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术,检测并比较A549细胞和A549细胞球的增殖能力及干细胞相关标记的表达水平,鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性.结果 利用无血清条件培养基从A549细胞中分离出肿瘤干细胞样细胞;相比A549细胞,细胞球呈悬浮生长,增殖能力和克隆形成数目(104±7)高于贴壁细胞[(37±3)(P＜0.05)],且干细胞相关标记Sox2(2.68±0.39)和Oct4( 1.23 ±0.12)表达水平明显提高[贴壁细胞Sox2(0.05 ±0.02)、Oct4(0.10±0.02),P＜0.05].结论 运用无血清条件培养基可以从A549细胞系中有效富集肺癌干细胞样细胞.     

Isolation and identification of lung cancer stem like cells from human lung cancer cell line A549

目的 从人肺癌细胞系A549中分离并鉴定肺癌干细胞.方法 将A549细胞置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,采用平皿克隆形成实验、MTT细胞增殖实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术,检测并比较A549细胞和A549细胞球的增殖能力及干细胞相关标记的表达水平,鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性.结果 利用无血清条件培养基从A549细胞中分离出肿瘤干细胞样细胞;相比A549细胞,细胞球呈悬浮生长,增殖能力和克隆形成数目(104±7)高于贴壁细胞[(37±3)(P＜0.05)],且干细胞相关标记Sox2(2.68±0.39)和Oct4( 1.23 ±0.12)表达水平明显提高[贴壁细胞Sox2(0.05 ±0.02)、Oct4(0.10±0.02),P＜0.05].结论 运用无血清条件培养基可以从A549细胞系中有效富集肺癌干细胞样细胞.