hPOT1基因正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人端粒保护蛋白（human protection of telomeres，hPOT1）基因的正、反义真核表达载体，以进一步研究hPOT1蛋白的功能及作用机制。方法用限制性内切酶将hPOT1 cDNA从pLPCNMyc POT1质粒上切下来，经适当改造后以正、反方向插入到质粒pcDNA3．1（-）中，构建hPOT1基因的正、反义真核表达载体；用PCR、酶切及DNA测序的方法鉴定hPOTI基因正、反义表达载体序列和方向的正确性。结果PCR、酶谱分析及DNA测序结果表明hPOT1正，反义真核表达载体序列和方向正确。结论成功地构建了hPOT1正、反义真核表达载体，为进一步研究hPOT1在端粒保护，细胞衰老和凋亡中的作用奠定了基础。     

肝内胆管癌hTR反义RNA及锤头状核酶基因真核表达载体的构建

用反转录PCR法 ,调取肝内胆管癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因 ,并针对其序列设计反义RNA封闭基因及锤头状核酶切割基因序列 ,将其构建入真核表达载体pTriEx 4内。根据hTRcDNA序列设计引物 ,经RT PCR法从体外培养的肝内胆管癌细胞内调取hTR模板区基因 ,根据其测序结果 ,合成反义RNA基因及核酶基因 ,与经相应酶切的真核表达载体连接 ,酶切鉴定重组体的正确性。经RT PCR从细胞内调出 68bp序列 ,与hTRcDNA比较 ,与模板区域碱基序列一致 ,反义RNA与核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。肝内胆管癌细胞内端粒酶的活性明显增高 ,RT PCR法可调出其hTR基因有效片段 ;成功构建了针对hTR模板区的反义RNA基因和核酶基因的真核表达载体     

人miR-205真核表达载体的构建及鉴定

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,并使其在肾上腺皮质癌细胞SW-13中稳定表达。方法依据miRbase数据库中pre-miR-205序列设计引物,PCR扩增pre-miR-205基因并将其克隆至线性化的pcD-NA3.1(+)质粒中,获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,经双酶切及测序分析后,将其及对照空载体转染肾上腺皮质癌SW-13细胞,采用实时定量RCR法鉴定miR-205在SW-13细胞中表达。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1(+)-205重组质粒构建成功,经实时定量RCR检测表明转染pcDNA3.1(+)-205的SW-13细胞中miR-205阳性高表达。结论真核表达载体pcDNA3.1(+)-205在SW-13中稳定转染,为进一步研究miR-205在肾上腺皮质癌细胞SW-13中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。     

人STIM1基因真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的: 构建人STIM1基因真核表达载体, 并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法: 提取HL-7702细胞总RNA, RT-PCR扩增,经纯化回收后将片段克隆至pGM-T载体, 酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并测序, 最后用重组质粒转染HL-7702细胞, 通过PCR-电泳和Western blot法检测STIM1基因的表达.结果: PCR扩增的片段长度为342 bp, 测序结果以及重组质粒pGM-T-STIM1的酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果均证明STIM1基因成功克隆到真核表达载体中. PCR-电泳和Westernb l o t实验结果分别显示转染重组质粒后的HL-7702细胞在基因与蛋白水平表达STIM1均有所增强.结论: 成功构建了人STIM1基因的真核表达载体pGM-T-STIM1, 并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达, 为研究STIM1蛋白在人肝细胞内Ca2+浓度调控方面及其对人肝细胞分泌功能的影响奠定了良好的实验基础.     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体的构建

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控FADD的特异表达载体.方法 利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,FADD基因片段,并将其插入带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达载体中.结果 hTERT基因启动子调控FADD表达载体经酶切鉴定含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列.结论 hTRET基因启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因启动子调控FADD表达载体可能是一种新型、有希望的肿瘤治疗的途径.     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的 构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达.方法 根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆.对经PCR、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的 片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证.脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT-PCR验证该基因的表达.结果 PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT-PCR的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达.结论 成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备.     

肝细胞生长因子受体靶向shRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建和鉴定人肝细胞生长因子受体（cMet）的shRNA的真核表达载体。方法：人工合成针对cMet的4对shRNA序列并定向克隆到siRNA（small interference RNA）真核表达载体RNAi-Ready pSIREN-DNA-DsRed-Express Vector上；采用双酶切和测序法鉴定。结果：酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。结论：成功构建肝细胞生长因子受体靶向shRNA的真核表达载体。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

FasL基因siRNA真核表达载体的构建及意义

目的构建针对细胞凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于肺间质纤维化基因治疗的可行性。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasL mRNA为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达载体pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR法检测细胞FasL mRNA水平变化。结果成功构建发卡样FasL siRNA真核表达载体;其转染人肺腺癌A549细胞后,细胞FasL mRNA的表达水平显著下降。结论FasL siRNA真核表达载体能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasL mRNA的表达;本研究为肺间质纤维化的基因治疗奠定了基础。     

VEGF165正反义表达载体的构建及其对人胃癌细胞VEGF表达的调节

目的构建VEGF165(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞VEGF在mRNA和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将VEGF165 cDNA从pGEM-hVEGF165克隆载体上切下来,以正、反方向插入质粒pCDNA3中,构建VEGF165正、反义真核表达载体;用限制性内切酶和Sanger双脱氧终止DNA测序法证明VEGF165正、反义表达载体目的基因的序列和方向的正确性;用脂质体将VEGF165正、反义表达载体转染人胃癌细胞,用RNA斑点杂交及免疫荧光流式细胞仪检测VEGF mRNA和蛋白质的表达水平.结果酶谱分析及DNA测序表明VFGF165正、反义真核表达载体目的基因的序列及方向正确;转染正义表达载体后VEGF mRNA和蛋白质表达水平增加(蛋白免疫强度为75.4%;P＜0.05vs对照组,31.6%),转染反义表达载体后VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(蛋白免疫强度为8.9%;P＜0.05vs对照组).结论成功地构建了VEGF165正、反义真核表达载体;构建的载体能在胃癌细胞内有效表达,调节血管内皮生长因子的水平.     

MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物．进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)．先将扩增产物克隆至pGEM—T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中．然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3．1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamHⅠ和HindⅡ)鉴定．证实其中有目的片段完整插入．插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

Construction of human Wnt-5a sense gene and RNAi eukaryotic expression vector

ObjectiveWnt-5a is important in the physiological development and differentiation of lung, and is also involved in the regulating proliferation, differentiation and invasion of tumor cells. However, very little is known about the roles of Wnt-5a in the development of lung cancer. The porpus of this study was to explore the role of Wnt-5a in the development of the non-small cell lung cancer, through constructing plasmids containing Wnt-5a sense gene siRNA.MethodsWe constructed the plasmids containing the Wnt-5a sense gene and siRNA eukaryotic expression vector and transfected it into the human lung squamous carcinoma cell line H157 and adenocarcinoma cell line A549. Expressions of Wnt-5a RNA and protein and proliferation of the cells were measured.ResultsExpression of Wnt-5a protein significantly stimulated cell proliferation, and transfection with siRNA plasmids suppressed Wnt-5 expression and cell proliferation.ConclusionThe human plasmids containing Wnt-5a sense gene and siRNA eukaryotic expression vector was successfully constructed, and transfection to human cancer cells induces cell proliferation. siRNA actively suppressed Wnt-5a expression.     

人子宫颈癌基因HCCR-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其反义真核表达载体。方法从人肝癌细胞株HepG2提取RNA，利用RT-PCR方法，克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1kb的片段，并将其与T载体连接，测序证实无误后，用SalⅠ、SacⅡ双酶切重组T载体，然后将该片段反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点，最后对重组真核表达载体进行双酶切鉴定。结果RT-PCR扩增出一长约1kb的HCCR-2片段，琼脂糖凝胶电泳显示目的片段成功反向连接到pIRES2-EGFP载体上。结论成功克隆了HCCR-2基因并构建了其反义真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2（-）。     

新布尼亚病毒真核表达载体的构建及表达

目的 探究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用,通过构建SFTSV-NSs真核表达载体SFTSV-NSs-FLAG,并将其转染进293细胞内,为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能奠定基础。方法 利用RT-PCR 扩增SFTSV-NSs基因序列并测序,并将纯化得到的SFTSV-NSs cDNA 片段连接到pFLAG-CMV-3载体,通过EcoRI/BamHI双酶切鉴定重组质粒。将重组表达体pSFTSV-NSs-FLAG导入293细胞中,共聚焦显微镜下观察SFTSV-NSs在细胞中的定位、 Western Blot 检测SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中的表达情况。结果 成功克隆测序SFTSV-NSs基因;成功构建SFTSV-NSs真核表达载体pSFTSV-NSs-FLAG,并将其转染到293细胞中。在293细胞中的表达检测结果显示共聚焦显微镜下观察重组体主要集中在细胞质中,并形成类包涵体样结构;且Western Blot 检测结果显示SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中表达。结论 为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用提供新思路。     

人硫氧还蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人硫氧还蛋白基因的重组真核表达载体。方法人硫氧还蛋白的cDNA克隆至pGEM-TEasy载体,经DNA测序证明后,将其克隆至真核表达载体pShttle构建重组pShttle-hTRX,pShttle-hTRX转染Hela细胞系进行瞬时表达,通过Westernblot、免疫组化、活性测定、酶切、PCR扩增等方法证实构建载体的正确性。结果构建携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体pShttle-hTRX,转染HeLa细胞后可检测到hTRX的转录和表达。结论正确构建了携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体,本结果可用于探讨硫氧还蛋白的生物学作用。     

反义DNA甲基化酶3b基因片断真核表达载体的构建及鉴定

目的构建反义DNA甲基化酶3b（DNMT3b）基因片断真核表达载体,为研究DNMT3b基因功能提供工具。方法根据DNMT3b基因cDNA序列中编码序列设计PCR引物,在上下游引物5′端分别添加XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点,RT—PCR从胆管癌细胞QBC-939中获得485bp的DNA片断;将该片断反向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）的多克隆位点,构建反义DNMT3b基因片断真核表达载体,并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果PCR鉴定得到467bp特异条带,双酶切鉴定得到471bp片断和5．4kb载体片断,DNA测序说明插入片断序列正确。结论本研究构建的反义DNMT3b基因片断真核表达载体可为进一步研究DNMT3b基因功能提供实验工具。