重组大肠杆菌表达的Ber e1纯化工艺中去除内毒素效果研究

目的 去除重组巴西坚果过敏原蛋白Ber e 1(rBer e 1)溶液中的内毒素,为后续实验和重组过敏原蛋白的临床应用打下基础.方法 采用亲和层析法、超滤法和离子交换法联合应用以及Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用,比较这两个方案去除重组蛋白溶液中的内毒素效果.结果 亲和层析法、超滤法和离子交换法联合应用的内毒素去除率为99.99％,内毒素浓度为6.25 EU/ml,蛋白回收率为42.8％;Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用的内毒素去除率为99.99％,内毒素浓度为2.09 EU/ml,蛋白回收率为26.1％.结论 Triton X-114萃取法与亲和层析法联合应用蛋白溶液内毒素的去除效果较佳,且内毒素含量以及Triton X-114残留量均在《中国药典》的规定范围内.     

中药药物性口罩的制备及其对流感病毒H1N1的抑制作用

目的:制备不同组方的中药药物性口罩,并评价其对流感病毒H1N1的抑制作用。方法:组方1(射干、甘草)与组方2(金银花、甘草)分别乙醇提取,以提取液浸泡纯棉脱脂纱布口罩2 h,分别制备1号、2号口罩,烘干备用。用制备药物性口罩的原液作用于流感病毒感染的犬肾细胞(MDCK),取细胞上清液进行血凝试验,比较各组细胞上清液的血凝效价,Real-time PCR法测定细胞内流感病毒血凝素(HA)基因的mRNA表达;将流感病毒H1N1液分别过滤药物性口罩,收集口罩滤液,检测滤液中流感病毒HA的效价。结果:组方1作用于流感病毒感染的MDCK细胞后,上清液的血凝效价由210降为26,组方2的血凝效价由210下降为25;与模型组比较,药物组细胞内流感病毒HA基因的mRNA表达量均明显减少(P0.05)。1号口罩过滤流感病毒H1N1液后,HA的效价由2-12下降为2-5,2号口罩过滤后的效价由2-12下降为2-6。结论:中药组方醇提液可有效抑制流感病毒在MDCK内RNA的复制;中药药物性口罩能够有效破坏流感病毒包膜上的血凝素,可有效阻断流感病毒的传染。     

不同的固定及渗透方法对小鼠卵母细胞免疫荧光染色的影响

目的 探索有效的染色前固定及渗透卵母细胞的方法,以提高小鼠卵母细胞免疫荧光染色的效率.方法 采用4种不同的固定及渗透方法处理小鼠卵母细胞:①方案A:先用4%多聚甲醛(PFA)固定1 h,再用0,5%Triton X-100穿透10 min;②方案B:先用0.5% Triton X-100穿透10 min,再用4%PFA固定1 h;③方案C:用1%PFA+0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h;④方案D:用-20℃预冷甲醇固定15 min.分析10种核蛋白(TFⅡA、TFⅡB、TAF1、TAF4、polⅡ、BRF1、MeCP2、MBD2ab、HP1α及HP1β)在小鼠卵母细胞中的免疫荧光染色效果.结果 只有方案C能够完全检测出这10种蛋白质.结论 用1%PFA+0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h,可以在小鼠卵母细胞形态保持良好的同时检测出更多的蛋白质.     

脱细胞血管基质的制备方法研究

目的:通过不同脱细胞方法制备脱细胞血管基质材料,比较筛选出较为理想的血管脱细胞方法,为临床血管修复提供良好的组织工程生物材料。方法:1采用不同浓度的胰蛋白酶、Triton X-100、SDS组合,对牛血管进行脱细胞处理,制备脱细胞牛血管基质。2苏木素-伊红染色,观察细胞核残留情况,以比较脱细胞效果。3利用微量样品基因组DNA提取试剂盒提取脱细胞血管基质的DNA,超微量蛋白核酸分析仪检测DNA含量。结果:大体观察:各组血管经过不同脱细胞方法处理后,所得脱细胞血管基质呈乳白色。苏木素-伊红染色观察:光镜下观察,可见各组均有不同程度的细胞核残留,其中1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS组和0.1%胰蛋白酶Triton X-100+0.5%SDS所制备的脱细胞血管基质细胞核残余最少,每高倍视野中细胞核残留不大于3。DNA提取检测:所提取DNA的含量显示,0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS和0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+0.5%SDS的脱细胞效果较好,DNA残留量分别为0.22μg/mg和0.231μg/mg。结论:应用0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS和0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+0.5%SDS的方法来制备脱细胞基质的效果较好。     

2种纯化流感病毒方法的比较研究

目的比较2种纯化浓缩鸡胚尿囊液中流感病毒方法。方法将流感病毒鸡胚尿囊液分别采用蔗糖密度梯度离心法(sucrose—density—gradient—centrifugation,SDGC)和红细胞吸附释放法(absorption and release-RBC,AR—RBC)进行纯化,收集纯化病毒测定血凝效价,比较2种纯化方法。结果SDGC法纯化病毒可在30％和45％蔗糖层面交界处的区带中检测到流感病毒,血凝效价为1：2560;用AR—RBC法纯化病毒过程中用新鲜鸡红细胞出现了溶血现象,而用甲醛处理过的鸡红细胞则无此现象,血凝效价均为1：2560。结论与SDGC法纯化病毒比较,AR-RBC法是一种经济实用、操作简便并有较高纯化效率的方法,尤以甲醛处理过的鸡红细胞纯化效果最好。     

鸡胚成纤维细胞培养抗肿瘤NDV疫苗的实验研究

目的用细胞培养法研制高效价人用抗肿瘤NDV。方法采用鸡胚成纤维细胞低血清培养法,在接种NDV之前的细胞培养中,少量使用优质小牛血清（2%）,让单层细胞基本铺满培养瓶底时,用无血清培养液多次洗涤单层细胞,以尽量降低残余牛血清含量。接种NDV之后,以人白蛋白代替小牛血清继续滋养细胞,培养病毒。结果NDV收获液LogPFU≥5.5,血凝效价1：640,经反向间接血凝试验检测,残余牛血清蛋白含量≤50ng/ml。结论NDV效价和活性符合人用疫苗要求。     

鸡胚成纤维细胞培养抗肿瘤NDV疫苗的实验研究

目的 用细胞培养法研制高效价人用抗肿瘤NDV.方法 采用鸡胚成纤维细胞低血清培养法,在接种NDV之前的细胞培养中,少量使用优质小牛血清(2 %),让单层细胞基本铺满培养瓶底时,用无血清培养液多次洗涤单层细胞,以尽量降低残余牛血清含量.接种NDV之后,以人白蛋白代替小牛血清继续滋养细胞,培养病毒.结果 NDV收获液Log PFU≥5.5,血凝效价1:640,经反向间接血凝试验检测,残余牛血清蛋白含量≤50 ng/ml.结论 NDV效价和活性符合人用疫苗要求.     

抗内毒素鸡蛋黄抗体F(ab′)_2制备

目的研究抗内毒素鸡蛋黄免疫球蛋白(IgY)用胃蛋白酶切后提取的F(ab′)2片段,探索防治内毒素血症的新途径。方法用内毒素(LPS)作抗原免疫25周龄leghorn鸡,改良水溶法提取抗内毒素IgY,胃蛋白酶切后提取IgY F(ab′)2段,光密度法测抗内毒素IgY F(ab′)2浓度和含量、ELISA检测抗内毒素IgY F(ab′)2效价,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量及纯度。结果抗内毒素IgY F(ab′)2含量为1.04mg/ml蛋黄液,效价为1∶25600,纯度为90%,相对分子质量为24000。结论抗内毒素IgY F(ab′)2产量大、效价高、特异性强。     

新城疫病毒在鸡胚中增殖影响因素探讨

目的探讨新城疫病毒(NDV)Ⅱ系弱毒株在鸡胚内增殖产生血凝素的最佳条件。方法将NDV按一定浓度稀释接种到鸡胚内孵育48～72h,收获鸡胚尿囊液,测定血凝效价。结果选择9～11日龄鸡胚,种子病毒稀释10^-2～10^-3、接种剂量为0.2～0．3ml;在36℃培养48～72h时,其鸡胚尿囊液量多且血凝效价高。弱毒系产生的NDV血凝效价高于强毒系和C30克隆系病毒。鸡胚培养较鸡成纤维细胞培养产生的NDV血凝效价高。结论鸡胚的病毒接种量和孵育温度对NDV的血凝效价的影响很大,在研究NDV的血凝能力时应注意到这些问题。     

不同的固定及渗透方法对小鼠卵母细胞免疫荧光染色的影响

目的探索有效的染色前固定及渗透卵母细胞的方法,以提高小鼠卵母细胞免疫荧光染色的效率。方法采用4种不同的固定及渗透方法处理小鼠卵母细胞:①方案A:先用4%多聚甲醛(PFA)固定1 h,再用0.5%Triton X-100穿透10 min;②方案B:先用0.5%Triton X-100穿透10 min,再用4%PFA固定1 h;③方案C:用1%PFA 0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h;④方案D:用-20℃预冷甲醇固定15 min。分析10种核蛋白(TFⅡA、TFⅡB、TAF1、TAF4、polⅡ、BRF1、MeCP2、MBD2ab、HP1α及HP1β)在小鼠卵母细胞中的免疫荧光染色效果。结果只有方案C能够完全检测出这10种蛋白质。结论用1%PFA 0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h,可以在小鼠卵母细胞形态保持良好的同时检测出更多的蛋白质。     

浊点萃取-高效液相色谱法同时测定水中多种二苯醚类除草剂残留

目的 建立同时测定水中多种二苯醚类除草剂残留的浊点萃取-高效液相色谱分析方法.方法 水样中8种二苯醚类除草剂(苯达松、氟磺胺草醚、三氟羧草醚、苯草醚、甲羧除草醚、乙羧氟草醚、除草醚、乙氧氟草醚)的残留经Triton X-114萃取,采用高效液相色谱法,用C_(18)色谱柱分离,以甲醇-三乙胺-盐酸溶液作流动相,梯度洗脱,在波长为300 nm处测定.采用Triton X-114进行浊点萃取,分别优化了影响萃取效率的表面活性剂浓度、水样pH值、盐浓度、平衡温度及时间等条件,并对待测物检测波长、流动相梯度洗脱、流动相pH值、流速和柱温等色谱条件进行了优化.结果 在优化的条件下,待测除草剂的质量浓度在0.05～2.00 mg/L范围内与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.9991～0.9998),水样的平均加标回收率,除苯达松较低以外,均在80.1%～100.9%之间,相对标准偏差(RSD)为2.70 OA～6.40%;对于50.0 mL水样,本方法 的检出限为0.10～0.50 μg/L.结论 本法简便、快速、准确、灵敏度高,能满足环境水样中多种二苯醚类除草剂残留分析要求.     

赖型017株钩体疏水外膜蛋白及其免疫特征的研究

采用低浓度非离子型去污剂ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４（ＴＸ－１１４）后提和分离问号状钩端螺旋体（钩体）黄疸出血群赖型０１７株（０１７），选择性地将钩体外膜蛋白分离为ＴＸ－１１４疏水相和亲水相两个部分。疏水相外膜蛋白含５条主要蛋白区带，其分子量分别为６６ｋｄ、３９ｋｄ、３５ｋｄ、２７ｋｄ和６ｋｄ，，ａｄｋｈｗｃｙ ３９ｋｄ外膜蛋白区带可特异地分别被抗全０１７血清，抗０１７外膜血清和抗０１７保护性单克隆抗体     

选择适宜的灌注去细胞方法应用于全肝脏去细胞支架的制备

目的：对比低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）和1％ Triton X-100对制备大鼠肝脏去细胞支架（DLBS）的影响,建立一种简单且适宜的DLBS的制备方法。方法将低浓度SDS（0．25％、0．50％）和1％ Triton X-100分别加入大鼠肝脏去细胞流程,通过免疫荧光及扫描电子显微镜观察支架结构,并对支架内成分进行定量分析,再通过四氮唑盐比色法（MTT ,Assay）观察支架对C3A的细胞毒性。结果 0．25％ SDS和0．50％ SDS处理组的DNA定量均小于50 ng／mg干质量,并且糖胺聚糖在0．25％SDS和1％ T riton X-100处理组的定量要高于0．50％ SDS处理组。同时,M T T 实验表明3种方法处理后的去细胞支架对于C3A细胞的生长无毒性作用。结论应用0．25％ SDS在5 mL／min灌注流速下去细胞能够制备更为理想且有效的DLBS ,从而为器官再生打下基础。     

单克隆抗体SZ—39识别的人脑胶质瘤细胞SHG—44膜蛋白的提取

目的：提取ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ－４４膜抗原蛋白,为其进一步研究作准备。方法：分别以两组去污剂（１）２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４;（２）１％ＳＤＳ、１％去氧胆酸钠、１％ＮＰ－４０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ裂解ＳＨＧ－４４细胞,提取细胞蛋白,再以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法分离蛋白,并以Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ法分析鉴定。结果：ＭｃＡｂ ＳＺ－３９识别的蛋白呈一条区带,分子量为６０ｋＤ     

琼脂糖电泳法分离血清碱性肝型和骨型同工酶方法的改进

目的：介绍一种琼脂糖电泳法分离血清碱性磷酸酶肝型和骨型同工酶的改进方法。方法：将血清用神经氨酸苷酶处理,在此基础上选用四种缓冲液配制成０．７％的凝胶,加入１％的ＴｒｉｔｏｎＸ－１００电泳,并进行荧光扫描。     

流感病毒裂解方法优化研究

目的研究流感病毒的裂解剂及裂解灭活条件。方法使用两种裂解剂TritonX100和TritonN101以不同浓度对流感病毒单价纯化液作用,通过电镜进行裂解效果观察,确定最佳裂解时间,用单向免疫扩散法检测HA含量作为评价指标。同时,观察先灭活再裂解和先裂解再灭活对病毒裂解效果的影响。结果TritonX100的裂解效果较优越,0.5%~1%TritonX100作用90min可使流感病毒裂解完全;TritonX100与甲醛作用的先后顺序对病毒的裂解灭活效果影响不大。结论0.5%~1%TritonX100可得到流感病毒的最佳效果。     

Triton X-100 对Hodge和Carba NP试验检测产碳青霉烯鲍曼不动杆菌复合群效能影响

目的 探索快速、准确、简单、经济的表型检测方法,为产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌复合群流行病学调查及临床诊疗提供更好的手段和依据。方法 纳入四川大学华西医院分离的110株鲍曼不动杆菌复合群,以多重PCR扩增结果为金标准,比较Hodge试验、Carba NP试验与加入Triton X-100后改良的Triton Hodge试验及Carba NP-direct试验在检测鲍曼不动杆菌复合群是否产碳青霉烯酶中的敏感度、特异度及阳性效果。结果 Hodge试验在检测产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌复合群中敏感度和特异度分别为71.1%、100%,高于Carba NP试验（35.0%、86.7%,P<0.05）。加了Triton X-100试剂后改良试验的敏感度和阳性效果明显增高,Triton Hodge试验敏感度由71.1%提高到98.8%,Carba NP-direct试验敏感度由35.0%提高到85.5%,差异有统计学意义（P<0.001）,但特异性差异无统计学意义（P>0.05）。结论 改良后的Triton Hodge试验及Carba NP-direct试验在检测产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌复合群中具有更高的敏感性及阳性检测判断效果,特异度不变,因此更适用于临床常规操作。     

化学去细胞同种异体神经制备的改良及桥接周围神经缺损效果

目的:改良去细胞异体神经的制备方法,研制出一种理想的自体神经移植替代物. 方法:将用Sondell法(Triton X-100、脱氧胆酸钠)和改良法[Triton X-200,sulfobetaine-10(SB-10),sulfobetaine-16(SB-16)]两种方法制备的去细胞异体神经用HE染色、髓鞘染色、免疫组化染色、扫描电镜检查等进行组织学评价. 然后将制备的神经桥接大鼠坐骨神经缺损,从坐骨神经指数、神经电生理、运动终板染色等方面评价神经移植后的再生效果. 结果:改良法制备的神经细胞及髓鞘去除彻底、结构保存完好;移植后神经再生良好,优于Sondell法制备的神经,达到了与自体神经移植相当的再生效果. 结论:综合运用萃取剂Triton X-200,SB-10和SB-16的改良化学萃取方法是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法,其制备的异体神经移植物可望替代自体神经移植.     

TritonX-100对SDS处理后光系统I颗粒耗氧速率的影响

目的研究TritonX-100对SDS处理后光系统I颗粒耗氧速率的影响。方法采用Clark型氧电极测定经SDS和Tri-tonX-100处理的光系统I颗粒的耗氧速率。结果光系统I颗粒的相对耗氧速率与SDS浓度常用对数呈线性关系,SDS处理后光系统I颗粒的耗氧速率明显降低,而TritonX-100对经SDS处理后光系统I颗粒降低的耗氧速率具有恢复作用。结论TritonX-100对SDS处理后光系统I颗粒的耗氧活性具有恢复作用。     

高效液相色谱法测定毛支清口服液中黄芩苷含量

目的建立毛支清口服液中黄芩苷含量的测定方法。方法选用Venusil MP C18分析柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,甲醇-水-磷酸（60∶40∶0.2）为流动相,检测波长为280 nm,流速为1.0 ml/min。结果黄芩苷进样量为0.5~3.0μg时与峰面积具有良好的线性关系,回归方程为：Y=3.00×106X-415 373,r=0.999 6,平均回收率为103.0%,相对标准偏差为1.117%。结论所建立的高效液相色谱方法简便、准确、灵敏度高、分离效果好,可作为毛支清口服液的质量控制标准。