荧光定量RT-PCR 检测神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA的表达

目的：MYCN基因表达对神经母细胞瘤的治疗及预后评估有指导意义,目前国内对于MYCN基因mRNA的定量检测未见报道,该研究拟采用SYBR 绿色荧光染料Ⅰ(SYBR GREEN Ⅰ) 实时检测的逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法,检测神经母细胞瘤细胞系LA-N-5细胞 MYCN基因mRNA的表达,并对其可行性及实用性进行研究,力争探索出微量瘤标本的MYCN基因mRNA定量检测的可行方法。方法：提取神经母细胞瘤细胞系LA-N-5 细胞总RNA,采用SYBR GREEN I 实时检测的RT-PCR检测其MYCN基因mRNA的表达,并用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照,将MYCN基因的mRNA拷贝数与GAPDH的拷贝数相除,结果为单细胞MYCN基因mRNA的表达水平。结果：反应标准曲线有良好的相关性( R2>0.99), PCR 产物特异, 神经母细胞瘤细胞系LA-N-5 MYCN基因mRNA的表达水平为17.4±1.2。结论：只要严格控制PCR 反应条件,SYBR GREEN Ⅰ定量RT-PCR 法可以作为一种良好的定量PCR方法对神经母细胞瘤细胞系LA-N-5 MYCN基因mRNA的表达进行检测,此方法为临床微量神经母细胞瘤瘤组织的MYCN基因mRNA的定量检测提供了可能。［中国当代儿科杂志,2007,9（1）：47-50］     

熊果酸对神经母细胞瘤细胞增殖凋亡及MYCN表达的影响

目的实验研究熊果酸作用于体外培养的神经母细胞瘤细胞株（SH—SY-5Y）,对肿瘤细胞增殖、凋亡及MYCN基因mRNA表达的影响,探讨熊果酸对儿童神经母细胞瘤的治疗的作用。方法以终浓度为4uM／L、8uM／L、12uM／L的熊果酸作用于神经母细胞瘤细胞SH—SY-5Y,WST-1法检测SH—SY-5Y细胞增殖情况,流式细胞术检测SH—SY-5Y细胞凋亡情况,采用RealtimePCR方法检测MYCNmRNA的表达情况。结果熊果酸对SH—SY-5Y细胞增殖的抑制呈明显的剂量、时间依赖性,随剂量的增加,作用时间的延长,抑制效果逐渐加强;熊果酸对SHSY-5Y细胞凋亡的促进呈明显的剂量依赖性,随剂量的增加,促进凋亡效果逐渐加强;熊果酸对SH—SY-5Y细胞MYCN表达有抑制作用并有明显的剂量依赖性,随剂量的增加,抑制效果逐渐加强。12uM／L作用72h后神经母细胞瘤细胞增殖抑制效率达98．3％,MYCN基因mRNA表达抑制率达52．37％。结论应用熊果酸在体外环境作用SH—SY-5Y细胞,可以有效抑制该细胞的增殖、促进细胞凋亡、抑制原癌基因MYCNmRNA的表达。     

RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因的初步研究

目的对RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞（LAN-5）MYCN基因表达进行初步研究。方法体外化学合成针对MYCN基因的小干扰RNA（siRNA），经脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染神经母细胞瘤细胞，以无关siRNA和未转染的细胞为对照，采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ的实时荧光定量RT-PCR检测siRNA的抑制效果。结果脂质体转染siRNA效率可达84.83％，化学合成的siRNA可抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA表达，转染72h后抑制率达58．3％。结论化学合成的siRNA可以有效抑制神经母细胞瘤MYCN基因的表达，为神经母细胞瘤基因治疗开辟了新的途径。     

Foxp3在神经母细胞瘤LA-N-6细胞的表达及化疗药物对其影响

目的：研究神经母细胞瘤细胞是否表达免疫逃逸相关分子Foxp3及其对化疗药物的敏感性。方法：体外培养神经母细胞瘤细胞株LA-N-6;MTT试验明确化疗药物环磷酰胺（CTX）、盐酸吡柔比星(THP)对LA-N-6的效应剂量,流式细胞术(FACS)及实时定量PCR（RT-PCR）测定Foxp3在LA-N-6中的表达和CTX、THP对LA-N-6中Foxp3表达的影响。结果：FACS结果显示LA-N-6细胞高表达Foxp3,加入 CTX、THP后显著降低了LA-N-6上Foxp3的表达（P<0.05）;RT-PCR显示CTX显著降低了LA-N-6细胞中Foxp3的表达（P<0.05）,THP加药组与对照组比较差异无统计学意义。结论：肿瘤逃逸相关转录因子Foxp3高表达于神经母细胞瘤细胞LA-N-6;CTX、THP能分别在蛋白或基因水平降低Foxp3分子在LA-N-6的表达,提示CTX、THP可能通过抑制Foxp3分子的表达而抗肿瘤的作用。 ［中国当代儿科杂志,2010,12（5）：386-389］     

反义寡核苷酸抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞血管内皮生长因子mRNA表达及其生物效应的研究

摘要 目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）转染对神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF mRNA表达的影响以及对肿瘤细胞增殖、分化的影响。方法 用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸（MSODN）转染LA-N-5细胞，半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF165和VEGF121 mRNA转染前后不同时间表达的变化；MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率。结果 半定量RT-PCR检测结果显示，在转染后72 h VEGF165和VEGF121 mRNA的表达：ASODN组为0.346±0.029和0.227±0.036，ASODN+LipofectamineTM2000组为0.275±0.035和0.165±0.017。ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组均显著抑制VEGF mRNA的表达，ASODN+LipofectamineTM2000组抑制作用较ASODN组更强（P<0.05）；转染后ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组细胞增殖显著受抑，在48 h时抑制率最高，分别为（39.92±2.74）%及（55.80±2.52）%,ASODN+LipofectamineTM2000组对细胞增殖的抑制作用较ASODN组更为明显（P<0.05）。MSODN组、MSODN+LipofectamineTM2000组对LA-N-5细胞增殖抑制作用与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 VEGF ASODN可抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF在mRNA水平的表达，并能抑制神经母细胞瘤LA N 5细胞的增殖和分化，LipofectamineTM2000能明显增强VEGF ASODN的抑制效果。     

Eg5蛋白靶向抑制剂S-Trityl-L-Cysteine对神经母细胞瘤增殖和分裂的影响

目的 研究驱动蛋白Eg5在神经母细胞瘤中表达及其靶向抑制剂S-三苯甲基-L-半胱氨酸(S-Trityl-L-Cysteine,STLC)对神经母细胞瘤的诱导作用.方法 通过免疫荧光及Western-blot检测Eg5蛋白在神经母细胞瘤中的表达水平,通过相差显微镜观察STLC对细胞形态学的影响,采用CCK-8法、流式细胞术检测STLC对细胞增值、凋亡及周期的影响,采用FISH法检测STLC对原癌基因MYCN扩增的影响,并经DAPI细胞核染色实验观察STLC对细胞核形态变化的影响.结果 免疫荧光及Western-blot结果显示Eg5蛋白在神经母细胞瘤中稳定表达.细胞形态学观察结果表明,细胞经不同浓度的STLC诱导,当浓度≥5μmol/L,诱导时间为72 h时,细胞形态变圆,出现大量凋亡样小体.CCK-8细胞增殖能力检测及流式细胞术分析结果显示,STLC具有促进细胞凋亡,抑制细胞分裂与增殖的作用,将细胞周期阻滞在G2/M期,且其诱导作用呈时间剂量依赖性.FISH实验证实STLC对MYCN基因扩增无影响.结论 神经母细胞瘤组织及细胞株中均表达Eg5蛋白,STLC通过抑制Eg5,影响神经母细胞瘤细胞的分裂及增值,从而促进细胞凋亡.结果表明Eg5有望作为神经母细胞瘤分子治疗的靶点.     

短链RNA抑制神经母细胞瘤MYCN基因表达诱发肿瘤细胞凋亡的研究

目的 探讨MYCN高扩增神经母细胞瘤肿瘤细胞中MYCN基因的表达改变对肿瘤细胞凋亡、增殖的影响.方法 采用RNA干扰抑制MYCN基因表达,荧光定量PCR法及Westernblot法检验基因表达受抑制情况;ELISA法检验肿瘤细胞凋亡情况,Western-blot法检验神经元特异性烯醇酶表达变化.结果 siRNA转染12 h、24 h MYCN mRNA表达,相对灰度值分别为0.53±0.10(对照组为1)、0.28±0.09(对照组为1.12±0.31),表达显著降低(P＜0.05);Western-blot结果显示转染12 h、24 h MYCN蛋白表达,相对灰度值分别为0.76±0.13,对照组为1.25±0.21、0.44±0.07,对照组为1.39±0.29,表达显著降低(P＜0.05);MYCN基因表达抑制后肿瘤细胞凋亡增加,抑制组DNA碎片值1.90±0.12,对照组1.13±0.09,P＜0.05;神经元特异性烯醇酶表达增高,抑制组相对灰度值为1.04±0.14,对照组相对灰度值为0.47±0.10,P＜0.05.结论 抑制MYCN基因的表达可以促进神经母细胞瘤细胞凋亡及分化.     

苦参碱对人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞趋化因子受体4表达的影响

目的探讨苦参碱对体外培养人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法体外培养人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞分对照组,0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml苦参碱干预组,应用四甲基偶氮蓝比色法、流式细胞术检测苦参碱对SK-NEP-1细胞抑制率、凋亡率的影响,逆转录聚合酶链反应检测SK-NEP-1细胞的趋化因子受体4(CXCR4)mRNA表达。结果不同浓度苦参碱干预组及对照组SK-NEP-1细胞的抑制率、凋亡率以及CXCR4 mRNA表达差异均有统计学意义(P0.01);随苦参碱浓度增加,SK-NEP-1细胞的抑制率和凋亡率呈上升趋势,而CXCR4 mRNA表达呈下降趋势,差异均有统计学意义(P0.01)。结论苦参碱可以抑制SK-NEP-1细胞增殖并诱导凋亡,该作用可能与下调CXCR4的表达有关。     

神经母细胞瘤骨及骨髓转移模型的建立

目的建立一种裸鼠神经母细胞瘤骨及骨髓转移模型,探讨其在靶向给药系统中的应用价值。方法 4～6周龄雌性BALB/c裸鼠,从股骨远端向骨髓腔注人神经母细胞瘤LA-N-5细胞悬液5μl(约1×105个细胞)制备神经母细胞瘤骨、骨髓转移模型,观察小鼠生存率、肿瘤局部生长及远处转移情况。结果模型成瘤率100%,LA-N-5细胞进入骨髓腔后抑制正常骨髓细胞生长,向骨皮质侵袭性浸润,形成骨溶解灶,并向淋巴结、肝、肾转移。结论股骨内注射人神经母细胞瘤LA-N-5细胞悬液可以成功制作裸鼠神经母细胞瘤骨、骨髓转移模型,后者能较好模拟人神经母细胞瘤在骨骼微环境中的生长及转归情况,是研究神经母细胞瘤骨髓、骨转移及评价临床前靶向给药的适宜模型。     

MYCN基因表达抑制促TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的神经母细胞瘤(NB)为小儿常见恶性肿瘤。MYCN基因高扩增NB细胞对TRAIL诱导凋亡多有抵抗。我们以MYCN基因高扩增NB细胞株为研究对象,抑制其MYCN基因的表达,探讨其对TRAIL诱导凋亡有无增强作用。方法构建MYCN siRNA,转染NB细胞株SK-N-BE(2),抑制MYCN基因表达后,Western-blot法检测SK-N-BE(2)细胞Bcl-2、Bcl-xL、Bid、DR4、DR5表达的变化,ELISA法检测细胞凋亡。结果转染MYCN siRNA的SK-N-BE(2)细胞中MY-CN基因表达显著降低(P<0.05)。MYCN基因表达抑制后,SK-N-BE(2)细胞DR5、Bid表达增高(P<0.05),Bcl-2、Bcl-xL表达降低(P<0.05),DR4表达无变化(P>0.05),TRAIL诱导细胞凋亡显著增强(P<0.05)。结论 MYCN基因表达抑制后,可调控Bcl家族中相关蛋白、DR5的表达,促进TRAIL诱导NB细胞凋亡。     

苦参碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用及机制

目的 探讨苦参碱(matrine,Ma)对人神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB) SH-SY5Y细胞的作用及机制。方法 取对数生长期的细胞,分为对照组(含细胞无Ma)及4个浓度组（Ma的作用浓度）分别为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml和3.0mg/ml,每组5个复孔。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测凋亡率;RT-PCR方法检测TrkA mRNA的表达。最后采用SPSS 16.(0统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果 MTT比色法检测对照组及各浓度组增殖抑制率分别为(7.25±1.55)％、(12.56±1.94)％、(17.22±0.90)％、(22.39±0.78)％和(25.35±1.38)％;流式细胞仪检测对照组及各浓度组凋亡率分别为(5.30±0.60)％、(10.04±1.18)％、(14.34±1.79)％、(21.36±0.96)％和(24.80±1.53)％;RT-PCR方法检测TrkA mRNA的表达,对照组及各浓度组的灰度值分别为：0.502±0.043、0.584±0.032、0.644±0.052、0.836±0.056和0.948±0.030。以上检测各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 苦参碱在体外环境下作用神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,可以有效抑制该细胞的增殖、诱导调亡并促进TrkA mRNA的表达,这为临床上神经母细胞瘤的治疗开拓了新的思路。     

苦参碱对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨苦参碱（matrine, Mat）对体外人横纹肌肉瘤RD细胞增殖和凋亡的影响,以及Mat诱导RD细胞凋亡的相关机制。方法：采用MTT比色法检测终浓度为0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL Mat对RD细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测上述4种不同浓度Mat对RD细胞的凋亡作用;RT-PCR法检测终浓度为0.5、1.0和1.5 mg/mL Mat对RD细胞Cyclin D1及Survivin mRNA表达的影响。结果：各浓度实验组RD细胞的增殖抑制率和凋亡率均高于未经Mat处理的对照组（均P<0.01）,且随着药物浓度增加,细胞增殖抑制率逐渐增高,呈剂量依赖性。RT-PCR检测Cyclin D1 及Survivin mRNA在各组RD细胞中均有表达,两者的表达水平在各浓度处理组中与对照组相比均有明显下降（P＜0.01）。其中Cyclin D1在各浓度组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,而Survivin仅在0.5 mg/mL 和1.5 mg/mL组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：Mat能明显抑制RD细胞的增殖,并诱导其凋亡;其抗肿瘤机制可能与下调Survivin和Cyclin D1 mRNA的表达有关。     

Polyphyllin D,a steroidal saponin in <Emphasis Type="Italic">Paris polyphylla</Emphasis>, induces apoptosis and necroptosis cell death of neuroblastoma cells

Purpose

Neuroblastoma is a refractory pediatric malignant solid tumor. The previous studies demonstrated that Polyphyllin D, the main constituent of Paris polyphylla, a traditional Chinese medicine, exerts an anti-tumor effect on many tumors. However, its effects against neuroblastomas are unclear.

Methods

We examined the anti-tumor effect of polyphyllin D in human neuroblastoma using IMR-32 and LA-N-2 cells, which exhibit MYCN gene amplification, and NB-69 cells, which do not exhibit MYCN gene amplification.

Results

All cell lines showed reduced cell viability in response to polyphyllin D treatment. No caspase-3/-7, -8, and -9 activity was observed in IMR-32 and LA-N-2 cells treated with polyphyllin D. In contrast, activation of caspase-3/-7, and -8 activity was observed in NB-69 cells. When polyphyllin D and specific inhibitors of RIPK3 involved in necroptosis were added to IMR-32 and LA-N-2 cell lines, polyphyllin D-induced cell death was inhibited.

Conclusion

Together, this indicates that the underlying mechanism of polyphyllin D-induced cell death in NB-69 cells is apoptosis, whereas the cell death of IMR-32 and LA-N-2 cells occurs by necroptosis. We continue research on this topic and look forward the discovery of a new therapeutic agent for neuroblastoma.

     

苦参碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用机制

目的 探讨苦参碱对人神经母细胞瘤( NB) SH-SY5Y细胞的作用机制.方法 取对数生长期的细胞,分为对照组(含细胞、无苦参碱)及药物处理组(苦参碱质量浓度为2.0g·L-1,对细胞的作用时间分别为16 h、24 h、32 h)共4组,每组5个复孔.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测NB SH-SY5Y细胞增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率;比色法检测Caspase-8的相对活性.采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析.结果 MTT检测对照组及各时间点药物处理组增殖抑制率分别为(4.98±1.20)％、(11.01±0.85)％、(15.22±0.71)％和(22.31±1.45)％;FCM法检测对照组及各时间点药物处理组细胞的凋亡率分别为(5.23±1.19)％、(10.74±1.65)％、(14.00±0.98)％和(17.81±1.06)％;比色法测定各组Caspase-8的相对活性分别为(4.25±1.00)％、(10.69±1.10)％、(14.80±1.44)％和(19.80±0.97)％;以上检测各组间比较差异均有统计学意义(Pa＜0.05).结论 苦参碱可抑制人NB SH-SY5Y细胞增殖,并可通过上调Caspase-8的活性诱导NB SH-SY5Y细胞凋亡,其作用随时间的延长逐渐增强.     

苦参碱联合顺铂对人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞PDCD4表达的影响

目的探讨苦参碱及苦参碱联合顺铂对人肾母细胞瘤SK—NEP-1细胞存活及凋亡的影响,以及可能的作用机制。方法苦参碱、顺铂单独及联合作用SK-NEP-1细胞,实验分对照组、顺铂干预组、苦参碱干预组、苦参碱联合顺铂干预组。应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测SK-NEP-1细胞的存活率,用流式细胞仪检测其凋亡率,逆转录聚合酶链反应法检测其PDCD4mRNA的表达。结果各组SK—NEP-1细胞的存活率及凋亡率与对照组比较、相同浓度的苦参碱干预组与苦参碱联合顺铂干预组比较及苦参碱联合顺铂组与J顿铂干预组比较,SK-NEP-1细胞的存活率及凋亡率差异均有显著性（P〈0．05）。各实验组均能提高PDCD4mRNA的表达,与对照组比较,差异有显著性（P〈0．05）。苦参碱联合顺铂组与苦参碱干预组及顺铂干预组比较,SK—NEP-1细胞PDCD4mRNA表达均显著提高（P〈0．05）。结论苦参碱可浓度依赖性的抑制SK-NEP-1细胞的增殖并诱导其凋亡,从而提高对顺铂化疗的敏感性,该作用可能与提高细胞内PDCD4mRNA的表达有关。