人血小板源性生长因子B基因转染对猫角膜内皮细胞增殖的影响冰

背景：许多研究显示外源性的人血小板源性生长B基因的转染可促进创伤的愈合。目的：用重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒转染和感染猫角膜内皮细胞，观察其对猫角膜内皮细胞增殖的影响。设计、时间及地点：分组对照观察细胞基因工程研究，于2007—01／11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：健康足月幼猫，体质量250-300g，雌雄不限。重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒由青岛大学医学院附属医院中心实验室自行构建。方法：常规显微镜下撕取内皮培养法，培养出原代猫角膜内皮细胞，传2代的细胞用于实验。脂质体法将重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体转染到猫角膜内皮细胞中，重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒采用直接感染法。实验分正常对照组、质粒对照组、重组质粒组、腺相关病毒对照组和重组腺相关病毒组。转基因24h和48h后收集细胞，Trizol试剂提取其总RNA。主要观察指标：通过荧光定量聚合酶链反应检测目的基因在细胞中的表达。四甲基偶氮唑盐法检测转基因48h后细胞的增殖活性。结果：①撕取内皮法可方便获取到原代猫角膜内皮细胞。②自行设计的针对目的基因及内参基因的探针引物经扩增后电泳验证及序列测定证明特异性高。③转基因24h和48h后荧光定量聚合酶链反应检测人血小板源性生长因子B基因mRNA发现：正常对照组、真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组间差异无显著性意义（P〉0．05）；重组人血小板源性生长因子B基因真核表达质粒转染组和重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒实验组与正常对照组相比差异显著（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测显示重组质粒转染和重组病毒感染均可促进细胞增殖，真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组与正常对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒可在角膜内皮细胞中高效表达并具有促进细胞增殖的活性。     

克隆人血小板源性生长因子B基因构建腺相关病毒载体及其病毒滴度测定

目的:克隆人血小板源性生长因子B基因于腺相关病毒载体中,以获得高感染滴度的重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒。方法:实验于2005-10/2006-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①健康足月产妇胎盘组织由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意。DH5α宿主菌由青岛大学医学院附属医院中心实验室制备保存。②Trizol试剂提取健康足月产妇胎盘组织总RNA,反转录-聚合酶链反应一步法克隆人血小板源性生长因子B基因全长开放读框。聚合酶链反应产物定向克隆于腺相关病毒载体,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体进行双酶切和测序鉴定。③采用磷酸钙转染法将重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体、腺相关病毒包装载体,腺相关病毒辅助载体共转染腺相关病毒293细胞,包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,显微镜下观察细胞及培养基的变化。④以携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒作为报告基因同重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体一样共转染相关病毒293细胞,对报告基因行X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度。结果:①重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶切鉴定及序列分析:聚合酶链反应产物经电泳证明大小正确,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶经双酶切和测序鉴定证实将血小板源性生长因子B基因正确插入。②腺相关病毒293细胞转染过程中病毒颗粒的产生:腺相关病毒293细胞转染6h后培养基底部出现无数小黑色颗粒,为加入的转染复合物颗粒。24h后腺相关病毒293细胞部分变圆,随着病毒增殖,细胞成串浮起,出现细胞病理效应。48h后细胞变形,逐渐从壁上脱落。72h后培养基的颜色从红色变化为橙色或黄色。③病毒滴度检测:通过携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒滴度为1×1010 L-1。结论:成功构建表达人血小板源性生长因子B基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究血小板源性生长因子B基因治疗角膜病和相关细胞系与组织的增殖提供实验基础。     

人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的:自行构建人血小板源性生长因子B(PDGF-B)真核表达载体,为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法:实验于2002-01/2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据Genbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列,设计合成一对附加BamHⅠ,XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段,将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。③经测序鉴定后,再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果:反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论:成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因,构建了基因重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究,在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染后人骨髓基质细胞的成骨分化

背景:现阶段诱导骨髓基质细胞分化成骨的方法大致分为在化学药物作用、细胞因子作用以及转基因作用下的分化等.目的:观察腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓基质细胞成骨能力的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和骨关节科完成.材料:人骨髓基质细胞取自健康成年男性自愿者.人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒、β半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒由课题组前期构建.方法:抽取健康志愿者髂前上棘骨髓,采用全骨髓法分离培养人骨髓基质细胞.体外扩增纯化后取50%融合的P2代细胞,随机分为4组:腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组向细胞培养液中加入人血管内皮生长因子165基因重组腺相关病毒1×1010OPU/mL,孵育24 h后换为普通完全培养液继续培养.β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组加入半乳糖酐酶基因重组复制缺陷性腺相关病毒,其余处理与前组相同.阳性对照组向培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠.空白对照组仅加入普通完全培养液,不进行特殊处理.主要观察指标:全自动生化分析仪检测培养上清碱性磷酸酶活性,免疫组化染色观察血管内皮生长因子的表达,Von Kossa染色检测人骨髓基质细胞中骨胶原结节形成.结果:处理后2周,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组与阳性对照组的培养上清碱性磷酸酶活性基本相似(P>0.05),而β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组的培养上清碱性磷酸酶活性均明显降低(P<0.01).血管内皮生长因子主要在骨髓基质细胞的胞浆内表达,腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组阳性细胞数明显多于其他3组.腺相关病毒介导人血管内皮生长因子组和阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,明显多于β半乳糖酐酶基因重组腺相关病毒组、空白对照组.结论:基因重组腺相关病毒人血管内皮生长因子165转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用.     

构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验

目的:构建携带人血管内皮细胞生长因子121cDNA的腺病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性。方法:实验于2003-05/2004-02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室(创伤烧伤复合伤国家重点实验室)完成。穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠。pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠。BamHI,XbaI,NcoIDNA限制性内切酶均购自Takara公司;鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司;用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中,与腺病毒质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre共同转染293细胞并反复扩增,构建携带目的基因的重组腺病毒,并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NTH3T3细胞,用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达。结果:①重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定:重组质粒经XbaI和NcoI酶切后,得到酶切片段长度为651bp的正向连接重组质粒。测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确。②Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定:pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdeltaE1,3Cre质粒共转染293细胞后7d,部分293细胞出现CPE,10d后出现CPE的细胞明显增多,约2周时绝大多数细胞出现CPE,而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象。最终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1.0×1010～4.3×1011PFU/mL。③血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达:重组腺病毒转染NIH3T3细胞48h后行细胞免疫组织化学染色,结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性,阳性染色主要位于细胞浆中,而未转染病毒的细胞染色极弱。结论:构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗。     

人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的：自行构建人血小板源性生长因子B（PDGF-B）真核表达载体，为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法：实验于2002-01／2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据GeIlbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列，设计合成一对附加BamHⅠ，XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段，将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。⑧经测序鉴定后，再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果：反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论：成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因，构建了基因重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究，在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测

背景:前期试验显示单个病毒载体介导的多基因共表达系统能够显著提高椎间盘退变转基因疗效。目的:构建人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒。方法:应用全基因合成技术,以"自剪切多肽2A"串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒Lenti-TGF-β3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果与结论:RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了3种目的基因,并于转染后48h左右达到峰值,"2A"结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%。说明成功构建了携带人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因的慢病毒多表达质粒。     

重组hVEGFl65腺相关病毒载体构建及体外感染骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

背景:目前用于基因治疗的病毒载体对机体具有一定免疫原性,且存在潜在感染危险,限制了临床的应用.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞,体外检测病毒生物学活性及功能.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养,取自成年新西兰大白兔;人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带,产妇对本实验知情同意.方法:从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.应用该重组病毒感染体外培养的兔骨髓基质干细胞主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率,感染AAV-HT1080测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.检测重组病毒的感染效率.ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子含量,人脐静脉内皮细胞管状血管形成试验检测血管内皮生长因子蛋白活性.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.重组病毒rAAV-VEGF165-GFP感染骨髓基质干细胞效率为40%,感染72h后骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子含量达(85.58±5.37)μg/L,分泌的血管内皮生长因子蛋白可以使人脐静脉内皮细胞拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP,该重组病毒能够高效感染兔骨髓基质干细胞并表达血管内皮生长因子,分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性,可有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖.