IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较北大核心CSCD

目的分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4^+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

负载乳腺癌细胞冻融抗原的DC对CTL体外特异性杀伤活性的影响

目的：研究乳腺癌患者腋下淋巴结单个核细胞来源的DC,经自体肿瘤细胞冻融抗原刺激后,对CTL体外特异性杀伤活性的影响。方法：以细胞因子分别诱导、培养乳腺癌腋下淋巴结单个核细胞中的DC及TDLNC,用自体癌细胞冻融抗原刺激DC,并和TDLNC共培养,诱导成为肿瘤抗原特异性CTL;检测特异性CTL对自体乳腺癌细胞及MCF-7细胞的体外杀伤活性。结果：DC-Ag-TDLNC、DC-TDLNC和TDLNC对自体乳腺癌细胞的杀伤率分别为67.64%、31.25%和26.36%,P〈0.001;三种TDLNC细胞对MCF-7细胞的杀伤率无明显差异（P〉0.05）。结论：乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞在细胞因子的诱导、活化及自体肿瘤抗原刺激下,可分化为成熟DC,DC可促进TDLNC增殖、分化为特异性CTL,后者对自体肿瘤细胞有较高的杀伤活性。     

氩氦刀冷冻处理的肺癌细胞增强树突状细胞诱导抗肿瘤效应

探讨氩氦刀冷冻处理的肺癌细胞致敏树突状细胞（DCs）后,激活T淋巴细胞的抗肿瘤效应。取肺癌细胞系NCI-H446经氩氦刀处理制备肿瘤粗抗原,在骨髓来源DCs的体外培养过程中,加入上述肿瘤粗抗原,观察细胞毒T淋巴细胞对NCI-H446的杀伤及诱导细胞凋亡的效应。结果表明,肺癌细胞经氩氦刀处理后可致敏DCs,并可诱导细胞毒T淋巴细胞对NCI-H446的杀伤效应,靶细胞凋亡增加。氩氦刀处理的肺癌细胞致敏DCs后,可增强DCs诱导CTLs的抗肿瘤效应（凋亡）。     

建立改良型人NK细胞体外扩增技术

目的建立一种改良型的NK细胞扩增技术。方法分离4名健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APC-mb IL-21和IL-2对NK细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较NK细胞的扩增倍数和NK细胞纯度,并采用CFSE/7-AAD法对肿瘤细胞K562和RPMI-8226进行细胞毒性实验检测杀伤效率。结果经过21 d的刺激培养,NK细胞平均扩增至409.4倍,细胞纯度最高可达95.86%。杀伤实验结果显示,扩增的NK细胞对K562细胞杀伤率高达85.2%。结论 p APC-mb IL-21工程细胞联合IL-2能够在体外高效的扩增出具有较高杀伤活性的NK细胞,可以为NK细胞免疫治疗奠定基础。     

转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞诱导个体化免疫治疗的体外实验

目的探讨转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞(DC)体外介导抗胃癌的免疫效应。方法制备短期培养的原代胃癌细胞。用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中DC的发育和成熟,并转染自体肿瘤细胞总RNA,激活自体T细胞产生CTL,用CCK-8试剂盒检测CTL的杀伤活性。应用流式细胞术及混合淋巴细胞培养技术检测DC的免疫功能状态。用ELISA法测定IL-12和INF-γ的水平。结果转染自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC,不仅可高表达MHC-I、II类分子及CD80、CD83和CD86协同刺激分子,并可获得高效刺激自体或异体T细胞增殖的能力。转染RNA的成熟DC,分泌IL-12的水平及其刺激产生的CTL培养上清液中INF-γ的水平显著高于单纯成熟DC及未成熟DC;且CTL对自体胃癌细胞的杀伤率显著高于异体组。结论转染自体胃癌细胞总RNA的成熟DC能够体外诱导产生对自体肿瘤细胞具有高度抗原特异性杀伤活性的CTL。     

白细胞介素6促人脾NK细胞活性及其机制初探

本文采用~(51)Cr释放试验测定人重组白细胞介素6(HrIL-6)处理正常成人睥单个核细胞(MNC)24小时后,NK细胞抗K562靶细胞的杀伤活性。结果证实,IL-6能明显增强脾NK细胞的抗瘤活性(P<0.05,与对照组比较),且可诱导MNC产生IL-2,NK活性的增强效应和MNCIL-2的合成水平均与IL-6的处理剂量呈依赖关系,提示IL-6促人脾NK活性的机制可能是通过诱导脾细胞产生IL-2而实现的。     

IL-12依赖于TRAIL途径增强NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能

目的:探讨IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的相关机制。方法:纯化正常人NK细胞,分为加或不加IL-12两个刺激组,通过基因芯片筛选差异基因,并通过流式细胞术在单个细胞水平检测相关杀伤分子的表达。结果:基因芯片系统结果显示IL-12刺激组和未刺激组相比,17种基因具有显著性差异(fold change≥10),其中5种基因上调,12种基因下调。在IL-12的刺激作用下,TRAIL的表达在CD56+CD16+和CD56-CD16+NK细胞上显著增加。同时,Jurkat细胞亦高表达TRAIL受体TRAIL-R2(DR5)。TRAIL中和抗体RIK-2可以阻断IL-12诱导的NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能。结论:TRAIL是IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的主要途径之一。     

慢性肺心病患者NK细胞活性及其对IL-2、IFN-γ的反应

本文检测30例慢性肺心病患者外周血NK细胞活性,并探讨重组人IL-2、IFN-γ在体外对患者NK细胞活性的影响。结果发现肺心病患者NK细胞活性明显低于正常对照组(p<0.01),且在急性加重期NK细胞活性下降更为显著,IL-2、IFN-γ在体外能明显提高肺心病患者的NK细胞活性。     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较

目的 分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法 采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4~+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

R848联合Poly(I:C)促进DC抗原呈递和增强T细胞杀伤效果的研究

目的:研究R848联合聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]对树突状细胞(DC)成熟的影响及DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人肺腺癌A549细胞的杀伤作用。方法:分离人外周血单个核细胞,诱导其成为DC,用A549细胞裂解物即肿瘤细胞裂解物(TCL)作为抗原,R848(Toll样受体7/8激动剂)联合Poly(I:C)(Toll样受体3激动剂)作用于DC,流式细胞术分析DC表面共刺激分子;将抗原刺激活化后的DC与T淋巴细胞混合培养7 d,收集培养上清液和CTL,检测上清液中白细胞介素12(IL-12)p70、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;CTL与肺腺癌A549细胞共培养16 h,观察其杀伤效果。结果:DC-R848+Poly(I:C)组DC表面CD83和CD80的表达较DC-TCL组显著提高(P0.01);同时可明显刺激DC分泌IL-12 p70(P0.01);此外,DC-R848+Poly(I:C)组较DC-TCL组对肺腺癌A549细胞杀伤效果亦显著提高(P0.01);DC-R848+Poly(I:C)组IFN-γ和TNF-α的分泌水平较DC-TCL组均显著提高(P0.01)。结论:R848联合Poly(I:C)作用于DC可显著促进其成熟、活化,并增强其抗原呈递作用及CTL对肺腺癌细胞的特异性杀伤作用。     

白细胞介素18基因转染的肺癌细胞对树突状细胞免疫特性的影响

目的：研究IL-18基因转染的肺癌细胞对树突状细胞（DC）表型和免疫活性的影响。 方法：构建含IL-12 P40信号肽序列的分泌型人IL-18表达载体并转染NCI-H460肺癌细胞。从人外周血诱导DC，分为未转染组（NT）、空载体组（PV）、基因转染组（GT）和单纯DC组（PD），用流式细胞仪分别测定未经转染肺癌细胞、空载体转染细胞及基因转染细胞刺激的DC和单纯DC表面CD54、CD80、CD83及CD86的表达。用MTT法测定上述4组DC刺激T细胞增殖的作用。用ELISA法测定上述4组DC培养上清中IL-12的表达量。 结果：分泌型IL-18表达载体酶切及测序结果与预期结果一致。IL-18转染细胞表达IL-18融合基因及18 kD蛋白。GT组DC表面分子的表达、刺激T细胞增殖的作用及IL-12分泌量均高于其余3组。 结论：IL-18基因转染的肺癌细胞可促进DC表面分子表达，增强DC免疫刺激活性及其IL-12的分泌。     

氩氦刀冻融的癌细胞激发骨髓树突状细胞的免疫效应

氩氦刀冻融可以杀灭肿瘤细胞 ,也是一种免疫治疗方法。抗原呈递能力最强的树突状细胞 (DCs)是机体免疫应答的重要启动和调节因素 ,经肿瘤抗原致敏的DCs通过细胞毒T淋巴细胞 (CTLs)有效激发特异性抗瘤免疫。本实验通过体外观察氩氦刀冻融的肺癌细胞对人骨髓DCs诱生的免疫效应。材料和方法氩氦刀冻融的肺癌细胞 :肺癌细胞 (NCI H4 46株 )为小细胞肺癌细胞 ,购自上海科学院细胞库。于含 10 %FCS的RPMI 16 40培养基、37℃ ,5 %CO2 、空气相对湿度 95 %条件下培养。待细胞进入对数生长期后 ,取 5× 10 9/LNCI H4 46细胞 ,用美国Endoc…     

人源白细胞介素21对外周血及脐血来源CIK细胞产生和抗肿瘤活性的作用研究

目的：研究新近发现的免疫调节因子——白细胞介素21（IL-21）对外周血及脐血来源的CIK细胞产生及抗肿瘤活性的体外作用。方法：采集分离正常人的外周血及脐血单个核细胞，加用细胞因子诱导培养CIK细胞，在有无人源IL-21（200ng／μl）培养条件下，检测CIK细胞表达及杀伤K562细胞和急性白血病患者肿瘤细胞活性的变化；检测培养上清IFN-γ的浓度及杀伤活性以及RT-PCR法检测培养细胞的IFN-γ RNA表达的不同。结果：在人源IL-21的作用下，培养14天时，①CIK细胞的产生由17．5％升至26．5％（外周血来源）；33．8％升至55．9％（脐血来源）。②CIK细胞对K562细胞的杀伤作用由24．0％升至52．2％（外周血来源）；35．1％升至79．7％（脐血来源）；脐血来源CIK细胞对13例急性白血病患者肿瘤细胞杀伤作用由27．4％升至58．3％。③外周血来源培养上清IFN-γ的浓度上升了近一倍，对K562的杀伤作用增加了近一倍；脐血来源培养上清IFN-γ的浓度上升了三倍多，对K562的杀伤作用增加了近二倍；④外周血和脐血来源培养细胞的IFN-γ RNA表达均明显增高。结论：人源IL-21可增加外周血及脐血来源CIK细胞产生及增强其抗肿瘤活性，通过增加IFN-γ的表达产生为其作用机制之一，提示IL-21在增强肿瘤免疫治疗中具有潜在的临床应用前景。     

IL—12以及IL—12P40对子宫内异症患者NK细胞功能的免疫调节

目的通过观察正常人及子宫内膜异位症(EM)患者外周血及腹腔液中IL-12、IL-12P40含量变化,分析其分子诱导NK细胞对子宫内膜细胞的细胞毒效应的影响,探讨IL-12、IL-12P40分子与EM患者NK细胞功能低下的相关性.方法ELISA酶联免疫检测IL-12、IL-12P40含量以及MTT释放法检测NK细胞毒活性.结果①EM患者腹腔上清液可使正常人外周血NK细胞杀伤活性(16.80%±3.6%)明显下降(8.37%±4.5% )(P＜0.05).② EM患者IL-12含量血清为66.38±12.6 pg/ml,低于对照组84.97±13.7 pg/ml(P＜0.05);腹腔液中为77.76±14.6 pg/ml,低于对照组106.92±10.7 pg/ml(P＜0.05).③EM患者IL-12P40含量血清为35.64±10.6 pg/ml, 与对照组无明显差异;腹腔液含量为79.76±12.6 pg/ml, 高于对照组40.54±10.0 pg/ml(P＜0.05), 并与疾病的程度呈负相关.④IL-12能增强NK细胞对子宫内膜细胞的杀伤,并呈剂量依赖.在10 ng/ml浓度诱导后杀伤率为31.90%,高于对照组的16.80%.⑤IL-12P40能拮抗IL-12对NK细胞活性的诱导,当加入IL-12P40后,使IL-12诱导的活性(29.3%)下降为19.36%.结论子宫内膜异位症患者腹腔液中IL-12P40含量的增高可能与NK细胞功能下降有关.     

原因不明习惯性流产患者主动免疫前后IL-4、IL-12变化的研究

目的:探讨原因不明习惯性流产（UHA）患者主动免疫治疗前后外周血IL-4和 IL-12mRNA水平的变化。方法:用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,检测30例正常非孕妇女和30例UHA妇女的外周血单个核细胞内IL-4和IL-12mRNA表达水平的相对含量（％）。结果:①UHA组妇女外周血单个核细胞上IL-4mRNA的相对含量,明显低于正常非孕组妇女（P<0.01）。而IL-12　mRNA的相对含量明显高于正常非孕组妇女（P<0.05）。②主动免疫治疗后,UHA组妇女外周血单个核细胞上IL-4 mRNA的相对含量较治疗前明显升高（P<0.05）,而IL-12mRNA的相对含量较治疗前明显降低（P<0.01）。③主动免疫治疗后,UHA组妇女上述细胞因子mRNA的相对含量与正常非孕组妇女相比无显著差异。④主动免疫治疗后,妊娠成功者其外周血单个核细胞上IL-4　mRNA的相对含量较治疗前明显升高（P<0.05）,IL-12　mRNA的相对含量较治疗前明显降低（P<0.05）;而妊娠失效者IL-4和IL-12　mRN的相对含量与治疗前无显著差异。结论:IL-4和IL-12的表达异常与UHA的发生密切相关,主动免疫治疗可上调IL-4的表达及下调IL-12的表达,可能进一步诱导TH2分化和抑制TH1分化,从而促使TH1/TH2型细胞因子平衡向TH2为主的模式转换,并使妊娠获得成功。     

γ射线辐照外周血单个核细胞联合ApoG2体外杀伤PC-3细胞的效应

目的：观察低剂量辐射外周血单个核细胞联合棉酚衍生物ApoG2对体外培养人前列腺癌PC-3细胞的杀伤作用。方法：采用1Gyγ射线照射人外周血单个核细胞,辐射剂量率为17Gy／min,实验设对照组、照射及未照射的外周血单个核细胞与PC．3细胞共培养组、ApoG2处理组及照射的外周血单个核细胞与ApoG2联合作用组。利用吖啶橙／溴化乙啶（AO／EB）荧光双染色法及MTT法,观察外周血单个核细胞和／或ApoG2对肿瘤细胞的杀伤情况。结果：辐照的外周血单个核细胞及ApoG2处理组对PC-3的杀伤作用明显增强,杀伤活性明显高于未辐照组（P〈0．05）,而联合作用组的杀伤活性明显高于辐照组及Ap0G2处理组（（P〈O．01）。结论：低剂量辐射外周血单个核细胞联合ApoG2可以明显提高其体外的抗肿瘤效应。     

冻融抗原负载树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤急性白血病细胞的实验研究

我们应用基因重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,基因重组人粒 /单细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)联合培养体系自健康志愿者骨髓单个核细胞诱导产生DC ,使其负载急性髓系白血病 (AML)细胞冻融抗原 ,体外诱导细胞毒性T细胞 (CTL) ,观察负载AML细胞冻融抗原后DC的状态对所激发的T淋巴细胞表型及功能的影响及CTL对AML细胞特异性杀伤活性。我们发现负载AML冻融抗原后DC的CD1a、CD83、CD86、CD11C、HLA DR表达率为较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,且负载AML冻融抗原的DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例 ,较诱导前明显增高 (P <0 .0 1) ,而负载AML细胞冻融抗原的DC诱导CTL对AML细胞有较强的杀伤作用 ,明显强于加或不加IL 2培养的T细胞对照组 (P <0 .0 1) ,而对K5 6 2细胞无明显的杀伤活性。通过以上实验我们认为经rhGM CSF ,rhIL 4培养产生的DC为CD14CD1a DC ,能诱导CTL对AML细胞产生明显的特异性杀伤作用 ,另外 ,负载AML细胞冻融抗原DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例明显增高 ,提示CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中具有极其重要的作用。     

两种白血病细胞抗原负载DC的体外诱导特异性CTL应答的比较

目的: 比较树突状细胞 (DC)与白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC两种白血病DC疫苗诱导抗原特异性CTL应答的能力。方法: 采用羟乙基淀粉 Ficoll两步法分离外周血单个核细胞(PBMC), 通过贴壁 2h获得黏附的单核细胞, 用GM- CSF加IL- 4诱导培养 5d收获细胞。将细胞分为 4组: A组将K562细胞或原代慢性粒细胞白血病(CML)细胞在 500g/LPEG 100mL/LDMSO诱导下与DC融合; B组加入相应细胞数量的白血病细胞冻融抗原; C组将K562细胞或CML细胞与DC共培养; D组: 单独DC培养组。融合前以红色荧光染料PKH26标记K562细胞, 采用流式细胞仪(FCM)检测PKH26 /FITC 抗HLA ABC抗体双标细胞并评估融合率。培养的第 6天, 加入TNF -α诱导DC成熟, 然后分别与自体T细胞共培养, 用MTT比色法检测各组CTL对靶细胞的杀伤活性。结果: GM- CSF加IL -4和TNF- α依次诱导成熟的DC具有经典的DC的形态和表型特征, 在PEG -DMSO的介导下, DC与白血病细胞的融合率为 ( 17. 33 ~29. 94 )%。两种抗原负载方案激活的CTL均对表达K562抗原的细胞具有特异性的细胞毒作用。在效靶比相同时, 融合组诱导CTL的杀伤活性强于冻融抗原致敏DC组。结论: 与冻融抗原致敏的DC相比, DC与白血病细胞融合细胞递呈抗原的效率更高, 体外诱导的CTL特异性杀伤靶     

卡介苗(BCG)通过诱导IL-12产生和受体表达促进人NK细胞功能

目的:研究卡介苗(BCG)对人自然杀伤细胞(NK)功能的作用及其机制.方法:分离抗结核抗体阴性志愿者外周血PBMC、纯化NK细胞, 分别与BCG、 IL-12、 BCG+IL-12、 BCG+抗IL-12Rβ1 mAb(2B10)培养.利用ELISA方法检测培养上清液IFN-γ、 IL-12p40含量;利用ELISpot方法检测IFN-γ、颗粒酶B产生细胞的频率;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定杀伤功能.利用流式细胞术检测NK细胞IL-12Rβ1的表达.结果:BCG呈剂量依赖的方式诱导PBMC产生IFN-γ.在BCG刺激条件下, PBMC颗粒酶B分泌细胞数明显高于不加任何刺激剂组(P<0.05).BCG增强PBMC杀伤活性.BCG不能诱导纯化NK细胞产生IFN-γ, 但与IL-12同时刺激则表现出协同作用.纯化NK细胞经BCG刺激后杀伤活性与未刺激相比差异无统计学意义.BCG呈剂量依赖方式诱导PBMC产生IL-12、并促进NK细胞不同亚群表达IL-12Rβ1.2B10抗体抑制BCG对PBMC产生IFN-γ和分泌颗粒酶B的诱导作用.结论:BCG间接地促进NK细胞的生物学活性, 其部分机制是通过诱导单核细胞产生内源性IL-12、并上调NK细胞表达IL-12R.     

慢性乙型肝炎病人HBcAg特异性CTL的体外诱导及活性

目的 从慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞（PBMC）中诱导和扩增乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。方法 含乙型肝炎病毒重组逆转录病毒载体转染病人自身永生化B细胞作为抗原递呈细胞，联合重组HBcAg和IL-2，从病人PBMC中诱导和扩增HBcAg特异性CTL，^51Cr释放法检测其细胞毒活性。结果 此方法诱导的TCL可以有针对性的杀伤靶细胞，而不能够杀伤空载体转染及未经转染的B细胞。结论 所建立的方法可以在慢性乙型肝炎病人的PBMC中诱导出HBcAg特异性CTL活性。