运用于embB 285 codon点突变的分子探针设计及检测研究

目的探讨单碱基靶点分子探针设计模型,并应用设计的分子信标探针检测结核杆菌耐乙胺丁醇embB 285 codon点突变,并与测序结果比较以验证。方法运用软件Beacon designer设计embB基因包含285codon的分子信标,应用荧光分光光度计检测embB 285 codon扩增片段与探针杂交后荧光信号,同时对扩增产物测序并作比较。结果通过荧光分光光度计观测到结核标准株及耐乙胺丁醇embB 285 codon PCR产物与分子信标杂交后荧光信号差异存在统计学意义;33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐乙胺丁醇组embB 285 codon突变检出率为15％,测序法突变检出率为15％。结论分子信标技术对单碱基靶点突变具有较高的检出率;应用荧光分光光度计直接检测液相杂交荧光具灵敏、简单、准确等优点。     

EmbB303codon突变检测的液相荧光观测研究

目的设计针对结核杆菌耐乙胺丁醇embB303codon的分子信标,尝试运用荧光分光光度计直接观测液相中分子信标与embB303codon扩增产物杂交后的荧光信号,从而检出该位点突变。方法运用软件Beacondesigner设计embB基因包含303codon的分子信标,应用荧光分光光度计检测embB303codon扩增片段与探针杂交后荧光信号,同时对扩增产物测序并作比较。结果通过荧光分光光度计观测到结核标准株及耐乙胺丁醇embB303codonPCR产物与分子信标杂交后荧光信号存在显著差异;33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐乙胺丁醇组embB303codon突变检出率为6％,测序法突变检出率为6％。结论embB303codon点突变不是结核杆菌耐乙胺丁醇的主要原因;应用荧光分光光度计直接检测液相杂交荧光具有简单、灵敏等优点;分子信标技术可以有效检测单碱基靶点突变。     

耐乙胺丁醇结核杆菌embB基因突变检测及意义

目的探讨应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇(EMB)分离株embB基因突变情况，研究其应用价值。方法采用PCR—SSCP分析68例结核菌株embB。结果以H37Rv标准株为对照，30株药物敏感株的embB基因SSCP泳动均正常，38株耐EMB分离株中25株embB基因SSCP泳动异常，异常检出率占66％。结论部分分枝结核杆菌耐EMB是由于其embB基因突变引起，PCR—SSCP可成为检测部分结核杆菌耐EMB耐药基因的有效方法。     

运用荧光分光光度仪观测结核杆菌耐链霉素耐药rpsL 43密码子发夹探针液相杂交信号

目的 设计针对结核杆菌耐链霉素(SM)rpsL 43密码子的发夹型DNA探针,尝试运用荧光分光光度仪直接观测液相中发夹探针与rpsL 43密码子扩增产物杂交后荧光信号,从而检出该位点突变.方法 运用软件Beacon designer 设计针对rpsL 43密码子的发夹探针,应用荧光分光光度仪检测rpsL 43密码子扩增片段与探针杂交后荧光信号,并比较扩增产物测序结果.结果 通过荧光分光光度仪观测到结核杆菌标准株及SM耐药rpsL 43密码子扩增产物杂交荧光信号存在显著差异;20株SM耐药组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,SM耐药组rpsL 43密码子突变检出率为70%,测序法突变检出率为65%,发夹探针杂交法假阳性株1例(504S).结论 应用荧光分光光度仪直接观测发夹探针液相杂交荧光信号具有简单、灵敏等优特点;rpsL 43密码子点突变是重庆地区SM耐药的主要因素之一.     

套式PCR及测序法检测痰中结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变

目的应用套式PCR及测序法直接检测痰中结核分枝杆菌相关的embB基因突变，以期建立一种直接、快速、准确地检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的实验方法。方法采用套式PCR扩增技术及测序法直接检测130例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌embB基因突变情况，同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养及菌型鉴定。结果29例耐乙胺丁醇标本有18例发生基因突变，均为306位密码子突变，基因突变率为62．1％（18／29）。结论套式PCR及测序法可望成为一种快速、特异、准确地检测痰中结核分枝杆菌embB基因突变的好方法。     

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇（EMB）耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应（PCR）产物进行反向斑点杂交，并与PCR-直接测序（PCR—DS）结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中，14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同；13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变。均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变．该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。     

广西原发性肝癌P^53基因第249密码子点突变的研究

用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性方法分析了原发性肝癌组织中Ｐ＾５３基因第２４９密码子的点突变，突变率为４８．４％，结果表明Ｐ＾５３基因的突变可能与环境致癌物ＡＦＢ１和ＨＢＶ有关。     

应用双链DNA循环测序技术检测Dystrophin基因内点突变

应用双链ＤＮＡ循环测序技术检测Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因内点突变吴志英，王柠，邓余，余龙，慕容慎行关键词：ＰＣＲ，ＤＮＡ测序，点突变本研究采用ＰＣＲ扩增产物直接测序方法──双链ＤＮＡ循环测序技术［１］。检测基因内点突变，操作简单，费时短，只需１～２天即...     

荧光显微观测Rpsl基因突变DNA分子探针杂交研究

目的选择结核杆菌耐链霉素（Sm）Rpsl基因包含88codon突变位点的序列设计分子信标,建立扩增体系及分子信标芯片检测方法。方法运用软件：Beacondesigner设计Rpsl基因包含88eodon突变位点的分子信标及及其单侧延长臂分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法,应用荧光显微镜观测荧光信号。结果通过荧光显微镜观测到标准株及耐SM株PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;51株耐链霉素（SM）与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,P〈0．05和P〈0．01的耐SM组Rpsl基因88codon突变检出率为61％。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术。单侧延长臂分子信标对解决分子信标在芯片表面固定难题提供了一种有效方法,采用荧光显微镜观测荧光信号具有更强的荧光信号识别、放大功能及结果判断更准确等优点。     

特异性寡核苷酸探针反向杂交在mtDNA点突变检测中的应用研究

目的：建立一种快捷、有效的mtDNA点突变检测体系。方法：线粒体病患者15例，根据临床表现分为3组，线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作（MELAS）组7例，单纯型线粒体肌病组4例，慢性进行性眼外肌麻痹（CPEO）组4例。用苯酚／氯仿法提取外周全血DNA，采用PCR／ASO反向杂交技术。用PCR扩增mtDNA的突变“热区”——tRNA^Leu（UUR）基因，在下游引物的5’端标记上地高辛，与点在尼龙膜上的5对寡核苷酸（AS0）探针：A3243／A3243G（野生型／突变型）、T3271／T3271C、G3460／G3460A、T3291／T3291C、C3256／C3256T进行反向杂交，根据杂交显色信号，确定有无突变。同时利用PCR／RFLP方法加以验证。结果：MELAS组中有A3243G点突变3例，但没有其他4个位点的突变。单纯型线粒体肌病组和CPEO组均未发现以上5个位点的突变。PCR/ASO反向杂交法与PCR／RFLP法结果一致。结论：PCR/ASO反向杂交技术，适用于已知mtDNA点突变的检测，具有敏感、节时、节省费用的特点。尤其适用于大批量标本的筛选。     

耐乙胺丁醇结核分枝杆菌基因型研究

目的研究青海地区耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株embB基因突变特征,并比较耐乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)菌株中耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug resistance,MDR)与非结核分枝杆菌菌株的embB基因突变差异。方法采用聚合酶链式反应方法对63株耐乙胺丁醇的结核分枝杆菌的embB高突变区进行扩增,并分析embB基因突变特征。结果 63株耐乙胺丁醇的结核分枝杆菌中,28株在embB基因发生突变,突变率为44.44%(28/63);53株结核分枝杆菌且耐乙胺丁醇菌株中,22株(45.51%,22/53)在embB基因发生突变;10株非结核分枝杆菌耐乙胺丁醇菌株中,6株(60.00%,6/10)在embB基因发生突变。位点embB306和embB406为高突变点,分别占突变菌株的67.86%(19/28)和21.43%(6/28)。耐乙胺丁醇菌株中,结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌菌株的embB基因突变差异无统计学意义(χ~2=0.536,P=20.464)。结论青海地区对乙胺丁醇耐药的结核分枝杆菌常见突变位点为embB306和embB406。单测embB基因不能非常有效地快速检测出乙胺丁醇耐药状况,增加emb A及其调控区的检测,能提高耐乙胺丁醇菌株的检出率。     

Detection and evaluation of the mutations of embB gene in ethambutol-susceptible and resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from China

The situation of tuberculosis (TB) and Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) drug resistance is still very serious in China. Improper treatment for TB may lead to a prolonged course of antimicrobial therapy and spreading of drug resistant strains. Thus, rapid detection of drug resistant strains will allow prompt initiation and adjustment of effective chemotherapeutic treatment of TB. Ethambutol (EMB) is a first line anti-TB drug. embB Met306 is located in a cytoplasmic loop that forms an EMB resistance determining region,1 Lety et al2 have demonstrated that a missense mutation in the M. smegmatis embB gene confers EMB resistance. The identification of mutations in embB gene may offer a means to rapidly screen M. tuberculosis isolates for EMB resistance. Thus, in this study, we analysed 197 isolates of M. tuberculosis from Chinese people and characterized mutations in the 258 bp region of the embB gene.     

DNA探针板杂交法检测临床标本中结核杆菌的应用

目的：在酶标板上进行ＤＮＡ探针杂交,评价其在检测临床标本中结核杆菌的应用价值。方法：收集７１份结核性标本和３２份非结核性标本,进行ＤＮＡ扩增,把扩增产物分别进行电泳和ＤＮＡ探针杂交,比较其结果。结果：７１份结核性标本电泳法阳性率为４５１％,ＤＮＡ探针法阳性率为６９０％;３２份非结核性标本二者均为阴性。结论：ＤＮＡ探针杂交可提高临床标本中结核杆菌的阳性检出率,是结核病早期诊断的一种新方法。     

结核分支杆菌rpoB基因突变和耐利福平的相关性研究

研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ分析结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因。结果显示ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因为属特异性。８１株结核分支杆菌的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ图谱与Ｈ３７Ｒｖ为对照,３５株敏感菌仅有一株位置有区别;４６株耐药菌有４２株有明显区别;检测阳性率为９１．３％;特异性９７．１％。证明ｒｐｏＢ基因突变是结核分支杆菌耐利福平的主要机理,ＰＣＲ—ＳＳＣＰ可简便快速地检出ｒｐｏＢ基因的突变,有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究。     

耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因突变快速筛选的研究

目的：建立结核分枝杆菌（MTB）katG基因点突变的筛选方法，了解结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）的状况。方法：采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）技术，对8株耐INH的临床MTB分离株、16株对INH敏感的临床分离株及MTB标准株H37Rv的katG基因，进行聚合酶链（PCR）反应扩增katG基因片段，再用Msp I内切酶分别对PCR产物进行消化反应。如果有315位点AGC突变为ACC，则将增加一个切点。结果：检测到8株耐药株中有7株增加了一个Msp I内切酶切点，耐药株中katG基因点突变检出率为87．5％（7／8）；16株敏感株和标准株均无额外的Msp I内切酶切点。未发现katG基因序列的缺失。结论：katG基因点突变是MTB耐INH重要机理之一；用PCR－RFLP检测耐INH的MTB的katG基因点突变具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点。     

单侧延长臂分子信标探针芯片在结核杆菌检测中的运用研究

目的分子信标探针在芯片表面的固定结合是限制其在芯片技术领域运用的难题。本研究拟寻找一种将分子信标探针固定在芯片表面的新方法,同时对其中重要影响因素进行优化探讨。方法本实验设计一种带单侧延长臂分子信标探针,固定在芯片表面进行杂交、扫描等后续实验。提高杂交效率部分优化包括：分子信标探针浓度;杂交温度、杂交时间;杂交液配方;4种分子对分子信标荧光信号比较。结果较理想区分阴阳性信号强度理想的探针浓度：Cy3-BDH分子信标探针浓度约10μmol/L,FAM-DABCLYE约15μmol/L。讨论单侧延长臂分子信标特异性高、敏感性高、技术难度低,对中、高密度芯片杂交可做到“点对点杂交”。