实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的探讨优化实验反应条件,使实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果.方法建立质粒标准品作为外参照;以管家基因GAPDH作为内参照,并对Mg2+、引物与探针比例、Buffer等进行优化.结果优化条件后,RT-PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致,保证了方法的稳定性和可靠性.结论为了获得可靠、重复性好的实时RT-PCR绝对定量结果,应对实验方法进行优化.     

人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立

目的 建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量.方法 构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量.结果 本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数（CV）11%,批间CV17%.结论 成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测.     

实时荧光定量RT-PCR检测血液肿瘤细胞株PAX5 mRNA表达

目的　建立实时定量逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测6个血液肿瘤细胞株中PAX5和CD19的 mRNA相对表达量。方法　一系列稀释的反转录自NAMALWA细胞株总RNA的cDNA被用于构建PAX5、CD19 和GAPDH扩增的标准曲线。实验证实靶基因(PAX5和CD19)与管家基因(GAPDH)的扩增效率一致,因此可 以用比较循环数(Ct)法对PAX5和CD19的表达进行相对定量。结果　在NAMALWA(B细胞系)细胞株中, PAX5和CD19mRNA相对表达量分别为2.35%和2.52%;而在其他T细胞和髓系细胞株中几乎不表达。结论 　本研究中所建立的实时定量RT PCR能简单、快速、方便地对PAX5和CD19mRNA表达水平进行定量,且适 用于对大量、不同种血液恶性肿瘤患者进行观察研究。     

实时荧光定量RT-PCR检测血液肿瘤细胞株PAX5 mRNA表达

目的建立实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)检测6个血液肿瘤细胞株中PAX5和CD19的mRNA相对表达量。方法一系列稀释的反转录自NAMALWA细胞株总RNA的cDNA被用于构建PAX5、CD19和GAPDH扩增的标准曲线。实验证实靶基因(PAX5和CD19)与管家基因(GAPDH)的扩增效率一致,因此可以用比较循环数(Ct)法对PAX5和CD19的表达进行相对定量。结果在NAMALWA(B细胞系)细胞株中,PAX5和CD19 mRNA相对表达量分别为2．35％和2．52％;而在其他T细胞和髓系细胞株中几乎不表达。结论本研究中所建立的实时定量RT—PCR能简单、快速、方便地对PAX5和CD19 mRNA表达水平进行定量,且适用于对大量、不同种血液恶性肿瘤患者进行观察研究。     

如何利用geNorm软件筛选基因表达测定的内参基因?

答:随着实时荧光定量PCR成为检测基因表达谱的高通量、高精度的方法,基因表达分析在生物学研究中得到广泛应用.采用稳定的内参基因对反应进行标准化可以增加该方法的敏感度、重复性和动态范围,理想的内参基因在所研究的组织、细胞和实验条件下均恒定表达.管家基因是维持细胞最低限度功能不可少的基因,在所有类型细胞中都表达,是广泛应用的内参基因.但是,很多研究表明管家基因在不同组织、细胞以及不同条件下表达量并非永远恒定,甚至差别很大,至今尚未发现在所有条件下均恒定表达的管家基因.因此,对特定基因表达研究中候选管家基因的表达稳定性进行评价,筛选出最为稳定的管家基因作为内参基因,对保证研究结果的真实、可靠至关重要.     

构建cRNA作为标准曲线的实时RT-PCR检测方法

目的　建立一种新的基于LightCyclerTM技术 ,并通过构建cRNA标准曲线来对目的基因进行定量实时RT -PCR的检测方法。方法　以T7RNA聚合酶体外转录合成带有目的片段的cRNA作为标准品 ,并与样本同时进行反转录和PCR扩增 ,用此方法来检测目的基因在结直肠组织中的表达。结果　采用cRNA标准品制作的标准曲线具有较好的线性关系 (r>0 .99) ,而且在每次实验中都能取得较好的扩增效率 ,CEA与GAPDH的扩增效率分别大于 88.7%和 87.4 %。结论　此方法能较为准确的对组织中的目的基因表达进行定量检测。     

实时逆转录PCR

实时RT－PCR是一种新技术，它利用荧光实时检测PCR反应，灵敏度高、特异性好、节约时间。本文对分子打塔、DNA结合染色、杂交探针和水解探针四种方法的原理、特点作了简要的介绍。并比较了三种可供选择的仪器，即ABI Prism 7 700、Lighteycler和Biorad iCycler各自的特点。使用特定的仪器、选择不同的实时RT－PCR策略，可以将实时RT－PCR应用于绝对定量、检测点突变和等位基因、mRNA结合变量，并可通过优化设计，实现多重RT－PCR。     

实时荧光定量RT—PCR定量分析mRNA表达水平原理及应用

实时荧光定量RT—PCR技术是一种新近发展起来定量检测mRNA表达水平的灵敏方法。本介绍了目前应用的四种荧光定量RT—PCR反应系统：即水解探针、杂交探针、DNA—染料结合和分子灯标RT—PCR反应系统，并对实时荣光定量RT—PCR反应系统的实验设计原则及所需仪器进行了介绍。     

实时定量RT—PCR检测临床肝组织标本中CXCL16及其受体的表达

[目的]建立实时定量RT—PCR方法并检测不同病理状态的肝脏组织中CXCL16趋化因子及其受体CXCR6的表达变化。[方法]建立外参照标准和灵敏的荧光实时定量RT—PCR方法，检测人正常肝组织、癌旁肝组织及癌组织标本中的趋化因子CXCL16及其受体的表达变化，进一步测定和比较其它相关的趋化因子表达谱的表达情况。[结果]获得了灵敏特异的实时定量RT—PCR方法，CXCL16及其受体在癌旁肝损伤组织中显著上调表达，显著高于趋化因子表达谱中其它趋化因子的表达变化，提示它在淋巴细胞尤其是T细胞介导的肝脏损伤过程中可能发挥重要作用。[结论]简便可靠的实时定量RT—PCR适用于检测病理组织中特异基因的表达变化，趋化因子表达谱改变尤其是CXCL16及其爱体CXCR6的显著变化可能与肝脏疾病的病理发生发展密切相关。     

实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌

目的:运用实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌,为早期快速诊断气性坏疽提供新方法.方法:以产气荚膜梭菌16s rDNA基因序列为模板,在其保守区域设计特异性引物与探针,将PCR扩增所得产物片段克隆,作为定量检测的标准品,绘制标准曲线.并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性、重复性及可行性.结果:实时荧光定量PCR法对产气荚膜梭菌的检测具有高度特异性,与创伤弧菌等24种相关细菌等均无交叉反应;检测灵敏度以纯菌计数达9×102cfu/mL,相当于9 cfu/反应;反应体系有较高稳定性;整个操作过程仅需3 h;300例创伤可疑分泌物样本的荧光定量PCR检测结果与细菌培养结果一致.结论:实时荧光定量PCR法特异、灵敏、快速,适用于产气荚膜梭菌的临床检测及突发事件的批量检测.     

荧光杂交探针实时聚合酶链式反应快速检测甘露聚糖结合凝集素启动子区基因变异方法的建立

目的建立用荧光杂交探针实时聚合酶链式反应（Real-timePCR）检测人甘露聚糖结合凝集素（MBL）启动子区基因变异新型的基因分型法——Tm基因分型法。方法收集30例健康献血员外周抗凝全血,提取基因组DNA。通过LightCycler实时PCR仪描绘扩增的目标DNA片段的熔解曲线,根据熔解温度（Tm）峰值判定待测标本的基因变异类型。最后,用基因测序法检测PCR产物来验证Tm基因分型法的准确性。结果建立了新型的Tm基因分型法,且测定PCR产物的时间仅180min,检测结果与测序法完全吻合。结论Tm基因分型法检测人MBL启动子区基因变异快速、准确,重复性好,具有广泛的临床应用前景。     

Quantification of chemotherapeutic target gene mRNA expression in human breast cancer biopsies: comparison of real-time reverse transcription-PCR vs. relative quantification reverse transcription-PCR utilizing DNA sequencer analysis of PCR products

The solid tumor mRNA expression of genes related to the mechanism of action of certain antineoplastic agents is often predictive of clinical efficacy. We report here on the development of a rapid and practical real-time RT-PCR method to quantify genetic expression in solid tumors. The genes examined are related to the intracellular pharmacology of gemcitabine and cisplatin, two drugs that are used in the treatment of several types of advanced cancer. We evaluated target gene mRNA levels from breast tumor samples using two quantitative RT-PCR methods: 1) an improved relative RT-PCR method using fluorescence-labeled primers, automated PCR set up, and GeneScan analysis software; and 2) real-time RT-PCR with redesigned primers using an ABI 7900HT instrument, with additional postprocessing of the data to adjust for efficiency differences across the target genes. Using these methods, we quantified mRNA expression levels of deoxycytidine kinase (dCK), deoxycytidylate deaminase (dCDA), the M1 and M2 subunits of ribonucleotide reductase (RRM1, RRM2), and excision cross complementation group 1 (ERCC1) in 35 human "fresh" frozen breast cancer biopsies. While both assay methods were substantially more rapid than traditional RT-PCR, real-time RT-PCR appeared to be superior to the amplification end-point measurement in terms of precision and high throughput, even when a DNA sequencer was used to assess fluorescence-labeled PCR products. This reproducible, highly sensitive real-time RT-PCR method for the detection and quantification of the mRNAs for dCK, dCDA, RRM1, RRM2, and ERCC1 in human breast cancer biopsies appears to be more informative and less time-consuming than either classical radioisotope-dependent RT-PCR or the technique utilizing GeneScan analysis described herein. By allowing the measurement of intratumoral target gene expression, these new methods may prove useful in predicting the clinical utility of gemcitabine- and platinum-containing chemotherapy programs in patients with solid tumors.     

Semiautomated Turbidimetric Microbiological Assay for Determination of Cefazolin

The Autoturb System, a semiautomated system for photometric bioassay, was used to determine cefazolin content. Suitable conditions for the assay using Streptococcus faecalis ATCC 10541 as the indicator organism included a medium pH of 6.0 to 7.0 and an incubation time of 3 to 3.5 h at 36 C. Multiple independent assays of samples from a common batch showed the test to be highly reproducible. Accuracy of the turbidimetric assay was evaluated by comparing data obtained from a chemical (hydroxylamine) and a biological (disk diffusion) assay. The available data show the turbidimetric assay to be a rapid, accurate, and reproducible method for determining the biological activity of cefazolin samples.