超广谱-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达,为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,自行设计一对寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断,定向克隆入质粒载体pBK-CM V构建重组质粒,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后,N itrocefin显色结合SDS-PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带,定向克隆入质粒载体pBK-CM V后筛选到大小约为5.4kb的重组质粒,S acⅠ和E coRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段,DNA测序发现插入片断的基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对n itrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。     

宁波地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶基因检测

目的 了解近年宁波地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中质粒AmpC酶基因流行状态.方法 用K-B法对临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作耐药表型分析,通过聚合酶链反应(PCR)检测AmpC酶基因,然后用三维试验予以证实.结果 140株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中,质粒AmpC醇基因阳性率2009、2010、2011年分别为4.4％(2/45)、8.6％(3/35)、13.3％(8/60);其中2009和2010年所检出的均为DHA基因型,2011年分别从2株大肠埃希菌和1株肺炎克雷伯菌中检出ACT-1基因.结论 宁波地区临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中质粒AmpC酶基因的流行率有增长趋势.     

金葡菌多重耐药基因norA的原核表达及其抗体制备

按金葡菌多重耐药转运蛋白NorA的编码序列设计引物，以金葡菌基因组DNA为模板．扩增出基因norA中约1155bp的cDNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到感受态大肠埃希菌JM109中．成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒．经NdeⅠ和XhoⅠ酶切，回收1155bp的目的片段．定向克隆到pET-28a（＋）表达载体中，转化至感受态大肠埃希菌DH5a中，提取质粒，再次转化到BL21（DE3）中，成功筛选到阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS—PAGE检测出norA部分基因的表达。利用得到的纯化蛋白免疫家兔，并通过间接ELISA法检测抗体效价．证明得到相应抗体。     

基因芯片技术检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因

目的检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌产生的ESBLs和AmpC酶的基因。方法在对ESBLs和AmpC酶表型检测的基础上,利用基因芯片和PCR技术研究大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌产生ESBLs和AmpC酶的基因,并对部分ESBLs和AmpC酶的基因扩增产物进行序列分析。结果大肠埃希菌和产酸克雷伯菌以单产ESBLs为主,肺炎克雷伯菌则以同时产生ESBLs和AmpC酶为主。大肠埃希菌产生的ESBLs(除TEM型外)主要是CTX-M-9组型,占63.5%。肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌产生的ESBLs分别以SHV型和CTX-M-3组型为主,分别占70.4%和89.8%。肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的AmpC酶均为DHA-1型酶的基因,大肠埃希菌的AmpC酶主要编码CMY-2型AmpC酶。结论基因芯片技术可同时检测多种耐药基因,是ESBLs和AmpC酶基因检测的新途径。     

产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的流行病学调查及其酶的表达调控

目的研究产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的流行病学状况及其酶的表达调控。方法选择临床中分离到的疑似产质粒介导AmpC酶的大肠埃希菌30株,对产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的流行病学特征进行调查分析,并行转移接合试验。用6组引物对提取的细菌质粒DNA进行多重PCR扩增,从而对质粒介导的AmpC酶的表达调控进行分析。结果流行病学调查,共检出20株产p-内酰胺酶菌株,其中有5株菌株同时产AmpCp-内酰胺酶和超广谱p-内酰胺酶,12株只产超广谱p-内酰胺酶,3株只产AmpCp-内酰胺酶,5株转移接合成功。PCR扩增试验后,与Genbank数据库进行序列比对分析,发现有6株扩增产生质粒介导的AmpC基因,其中CIT型4株,DHA型2株。结论产质粒AmpC酶大肠埃希菌在临床上广泛传播,把握其持续高表达的调控机制,有助于指导临床合理使用抗牛素。     

质粒染色体介导的大肠埃希菌β-内酰胺酶基因型与耐药性分析

目的研究产β-内酰胺酶大肠埃希菌基因型及其相关耐药性。方法对临床分离的7株大肠埃希菌，作阻内酰胺酶测定、药物敏感试验、质粒DNA转化和DNA印迹试验。结果7株大肠埃希菌，经E—test法检测，均产生超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）；质粒DNA电泳图谱显示7株大肠埃希菌均含有TEM型耐药质粒；通过大肠埃希菌质粒DNA和染色体DNA印迹试验证明7株大肠埃希菌耐药由质粒介导或由质粒与染色体共同介导。结论第一株大肠埃希菌芦内酰胺酶单纯由质粒介导，第2～7株大肠埃希菌β-内酰胺酶由质粒和染色体共同介导。由质粒与染色体双重介导的肛内酰胺酶增强了大肠埃希菌对抗生素的耐药性。     

汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中的克隆及表达

目的：在大肠埃希菌中克隆和表达汉坦病毒SEO型及HTN型S基因。方法：PCR扩增汉坦病毒SEO型L99株及HTN型Z10株S基因读码区，前者经EcoRI及XhoI双酶切，后者经SacI及XhoI双酶切，将两者定向克隆入pET32a（＋），转入感受态E．coli Top10。获取重组质粒，经PCR、双酶切及序列分析鉴定后，转入E．coli BL21感受态。经IFTG诱导表达，其产物经SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：SEO型L99株及HTN型Z10株S基因正确克隆于pET32a（＋），目的蛋白的分子质量约为67．1ku，表达量占菌体总蛋白的40％以上，Western-blot有特异性条带。结论：SEO型及HTN型汉坦病毒S基因在大肠埃希菌中获得表达，为其后的应用奠定了基础。     

多重耐药菌中质粒介导喹诺酮耐药基因的检测和分析

目的分析广州医学院第一附属医院临床分离的60株多重耐药大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导的喹诺酮耐药基因存在状况。方法采用VITEK-2全自动细菌鉴定仪检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗生素的药物敏感性,选择多重耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为研究对象,用多重PCR法进行质粒介导的喹诺酮耐药基因的检测和分析。结果检测出耐药基因qnrA型2株,qnrB型耐药基因15株,aac（6’）-Ib基因9株,其中aac（6’）-Ib—cr型耐药基因5株。其中有1株肺炎克雷伯菌检测到同时含有qnrA和aac（6’）-Ib—cr基因;还有3株肺炎克雷伯菌检测到同时含有qnrB和aac（6’）-Ib—cr基因。未检测到qnrC、qnrD、qnrS、qepA型的耐药基因。结论临床分离的多重耐药大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌含有多种质粒介导的喹诺酮耐药基因,应引起临床的重视。     

产ESBLs液化沙雷氏菌临床分离株的表型和基因型分析

目的 探索液化沙雷氏菌临床分离株CR04对第三代头孢菌素耐药的分子机制。方法 采用琼脂二倍稀释法对临床分离的液化沙雷氏菌CR04株进行MIC检测，提取耐药菌β-内酰胺酶，并测定其酶活性。双纸片法筛选及确证实验鉴别耐药菌的ESBLs表型．进行结合传递实验并提取耐药菌质粒．进一步根据常见的质粒介导的β-内酰胺酶基因序列设计两对寡核苷酸引物，以耐药质粒为模板进行PCR扩增，并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果 头孢他啶对液化沙雷氏菌CR04株的MIC为512μg／ml，其酶活性为837．9U，双纸片法筛选及确证实验证明为产ESBLs耐药菌，结合传递实验表明产酶基因能传递给受体菌。从耐药菌中提取出大小约为10kb的质粒，以质粒DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物DNA测序结果进行分析表明，其核苷酸序列与已知的β-内酰胺酶blaSHV-5、blaSHV-1、bLaSHV-2、blaSHV-7、blaSHV-8、blaSHV-12、blaSHV-54、blaSHV-34基因高度同源，其所推导的氨基酸序列与已知的β-内酰胺酶blaSHV-5、blaSHV-1、blaSHV-2、blaSHV-7、blaSHV-11、blaSHV-12、blaSHV-24、blaSHV-34相比较至少有30个氨基酸残基的差异。结论 对临床分离的第三代头孢菌素耐药性液化沙雷氏菌CR04株进行详细的表型和基因型分析，为进一步通过反义核酸等技术抑制耐药基因表达从而系统研究细菌耐药机制奠定了基础。     

大肠埃希菌质粒介导AmpC酶基因检测及耐药性分析

目的 了解深圳市人民医院质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的基因型特点和耐药特性,为临床抗菌药物的合理使用提供依据.方法 收集深圳市人民医院头孢西丁耐药的大肠埃希菌临床分离株110株.提取菌株的质粒DNA,采用多重PCR法检测AmpC酶基因,并应用DNA测序确定AmpC酶的基因型;用K-B法对其进行药物敏感试验.结果 110株对头孢西丁耐药的大肠埃希菌中,13株(11.8%)AmpC酶基因扩增阳性,测序结果显示12株为DHA-1,1株为CMY-2.AmpC酶基因阳性株对亚胺培南和美罗培南100%敏感,对其它大多数药物敏感性较低.结论 该院大肠埃希菌临床分离株中质粒介导AmpC酶基因型主要为DHA-1型,对多种抗生素的耐药性高.     

细菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因定点突变对酶活性的影响研究

目的构建CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因突变体，比较突变前、后酶活性的变化，进一步阐明酶的分子结构特征和生化特性。方法利用重叠延伸PCR定点诱变技术将CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因Ser240（丝氨酸）AGC定点突变为Gly240（甘氨酸）GGC，分别构建CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体，重组载体经酶切鉴定和DNA测序鉴定后，转化大肠埃希菌JM109，比较突变前、后酶活性的改变。结果酶切鉴定和DNA测序鉴定表明CTX-M型酶的原核重组表达载体及其突变表达载体构建成功，转化大肠埃希菌JM109后，发现含野生型CTX-M基因的重组菌其酶活性与来源菌株相近，而含突变型CTX-M基因的重组菌未检测到酶活性。结论Ser240对于维持CTX-M型超广谱β-内酰胺酶活性具有重要作用。     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

肺炎克雷伯氏菌中超广谱β—内酰胺酶特性研究及体外选择高产酶突变株

报道英国近年来肺炎克雷伯氏菌所致的６次院内感染爆发流行中所分离到的６株肺炎克雷伯氏菌中超广谱ＳＨＶ型β－内酰胺酶研究及体外选择高产酶突变株。ＰＣＲ结果显示这６株肺炎克雷伯氏菌均产生ＳＨＶ型β－内酰胺酶，对头孢噻肟、头孢他啶耐药，其ＭＩＣ分别为４～６４及８～＞６４ｍｇ／Ｌ。其耐药性可通过接合试验传递给大肠埃希氏菌Ｋ１２Ｊ６２．１。６株大肠埃希氏菌感受株（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ）质粒琼脂糖电泳结果显示获得一平均大小为１００ｋｂ的大质粒。６株肺炎克雷伯氏菌的大肠埃希氏菌感受株的β－内酰胺酶等电点除一株菌为８．２外，其余为７．６。体外选择高产酶突变株结果显示除其中３株大肠埃希氏菌感受株已经是高产酶株外，其余３株均能为２～６４ｍｇ／Ｌ头孢噻肟诱导成高产酶突变株。高产酶株对头孢噻肟、头孢他啶耐药性增至２～６４倍。说明体外易于选择高产超广谱ＳＨＶ型β－内酰胺酶突变株     

Streptomyces sp.4353中3-氨基-5-羟基-苯甲酸（AHBA）合酶基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的 克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达.方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因通常连锁,形成一个AHBA生物合成基因簇.本文通过分析、比较已知AHBA生物合成基因簇的基因组织结构特点和序列保守性,设计引物,以Streptomyces sp.4353的总DNA为模板,在已知737bp AHBA合酶基因部分序列的基础上,通过PCR扩增其上、下游DNA序列,克隆至pMD18-T载体上,测序、拼接并进行生物信息学分析.以pET24a(+)为表达载体,对克隆得到的AHBA合酶基因在大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达和SDS-PAGE检测.结果从Streptomyces sp.4353中得到了一段2872bp大小的DNA片段(NCBI GenBank接受号EU734184),其中含有AHBA生物合成基因簇中的AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因(部分);AHBA合酶基因在大肠埃希菌中得到了成功表达,在SDS-PAGE上可见到清晰的、与预计大小(42.7ku)一致的蛋白表达特异条带.结论 Streptomyces sp.4353中的AHBA合酶基因的克隆以及在大肠埃希菌中的表达为进一步研究该基因的功能奠定了基础.本研究克隆得到的2872bp DNA片段还有可能用于AHBA的杂合/异源生物合成,以及安莎类抗生素的组合生物合成.     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的探讨

目的：了解本地区分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-酰胺酶的发生率、耐药性及超广谱β-酰胺酶可能的基因型。方法：用MICs试验和PCR方法研究了从武汉地区医院ICU病房收集的288株大肠埃希菌和103株肺炎克雷伯菌产超广谱β-酰胺酶的发生率、可能的基因型。结果：强产超广谱β-酰胺酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的发生率分别为25．0％（72／288）和46．6％（48／103）。RAPD分析显示一些不同的产超广谱β-酰胺酶的菌株具有相同的RAPD型别，而不同的RAPD型别的菌株可能含有相同的产超广谱β-酰胺酶的基因型。这些菌株耐受绝大部分含β-内酰胺的药物（包括第3代头孢菌素）和不含β-酰胺的药物（例如氨基糖苷、四环素和氯霉素），几乎所有的产超广谱β-内酰胺酶菌株对亚氨培南，头孢美唑和β-酰胺／克拉维酸敏感。TEM是产超广谱β-内酰胺酶的主要基因型，CTX-M型也常见，其中以CTX-M-3为主。产超广谱β-酰胺酶一些的大肠埃希菌和大部分的肺炎克雷伯菌的菌株含不止一个超广谱β-酰胺酶的基因型。产超广谱β-酰胺酶菌株的传播绝大部分依赖质粒的水平转移。结论：这些结果证明在武汉地区分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌菌株产超广谱β-酰胺酶很常见，对这些菌株的监测和阻止其传播具有重要意义。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药机制检测

目的筛查大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌膜孔蛋白基因情况,分析其与耐药的关系。方法随机抽取2008—2010年耐3代头孢菌素(头孢他啶)的大肠埃希菌72株和肺炎克雷伯菌57株,56株头孢他啶敏感的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为对照组;三维试验确定细菌头孢菌素β-内酰胺酶(AmpC酶)的产生情况;超广谱β-内酰胺酶(ESBL)确证试验检测细菌产ESBL的情况;多重聚合酶链反应(PCR)扩增AmpC基因和膜孔蛋白ompF、ompk35、ompk36基因;纸片扩散法检测抗菌药物的敏感性。结果 72株大肠埃希菌中,14株产AmpC酶,23株产ESBL,3株膜孔蛋白基因缺失;57株肺炎克雷伯菌中,13株产AmpC酶,19株产ESBL,5株膜孔蛋白缺失,膜孔蛋白缺失株4代头孢均出现耐药。结论我院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢类抗生素的耐药机制主要是产AmpC酶和ESBLs,同时膜孔蛋白基因的缺失会造成耐药程度增高。     

广州地区具有水解头孢他啶活性的CTX-M型ESBLs的调查

目的 对广州地区具有水解头孢他啶活性的CTX-M型ESBLs进行调查,了解其种类、比例以及传播机制,为临床抗生素的使用提供指导.方法 对广州地区多家医院2007年到2008年临床分离的非重复的确证产ESBLs的181株大肠埃希菌和180株肺炎克雷伯菌进行研究,PCR方法确定CTX-M型ESBLs的基因型,MIC检测菌株对抗菌药物的敏感性;接合实验了解CTX-M型的ESBLs编码基因(blaCTX-M)所在质粒的大小.结果 检出携带blaCTX-M-15的菌株共86株(23.8%),其中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分别为39株(21.5%)和47株(26.1%);大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中各检出1株携带blaCTX-M-27的菌株,比率均为0.55%,未发现携带blaCTX-M-16的菌株.接合实验发现,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中携带blaCTX-M-15的质粒分别是65Kb和92Kb大小的可接合性质粒;肺炎克雷伯菌中携带blaCTX-M-27的质粒推测是大小为57Kb的可结合性质粒.结论 广州地区具有水解头孢他啶活性的CTX-M型ESBLs的类犁为CTX-M-15和CTX-M-27,且以CTX-M-15为主.耐药基因所在的质粒为可接合性质粒,能通过接合水平传播.鉴于CTX-M-15型ESBLs在临床菌株中检出率较高,治疗上应避免单独使用头孢他啶.     

志贺菌外排泵基因emrE的克隆表达及进化分析

目的研究志贺菌外排泵基因emrE的耐药功能及其进化。方法以志贺菌临床多重耐药株H24基因组为模板,扩增出含emrE基因的1126bp DNA片段,将所得片段与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,对阳性克隆酶切鉴定和测序;用琼脂平皿二倍稀释法对重组菌株进行药敏测定并测定泵抑制剂CCCP对MIC值的影响;通过RT-PCR从mRNA水平检测emrE的表达水平;通过Genbank数据库对基因序列进行同源性比对,建立进化树并分析同源基因之间的关系。结果含emrE基因质粒可以提高大肠埃希菌对四环素耐药性1倍,对红霉素的耐药性1倍;对emrE基因的同源分析显示H24菌株和大肠埃希菌、其它志贺菌可归为相近一族,同源性在92%以上,与同属于肠杆菌科的欧文杆菌和沙门菌的同源性分别为70%和60%;与亲缘关系较远革兰阳性菌除虫链霉菌和结核分枝杆菌的同源性仅为47%和48%。结论志贺菌耐药株H24的emrE基因与对四环素及红霉素的耐药性相关,依据现有数据进行的emrE基因同源分析未发现有明显的基因水平转移现象。     

产志贺毒素大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶基因型的研究

目的 探讨产志贺毒索大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs）类型及耐药机制。方法采用纸片琼脂扩散法筛选36株产志贺毒素大肠埃希菌产ESBLs菌株，接合传递实验、质粒谱分析、PCR检测耐药基因和DNA序列分析产ESBLs菌株的表型和基因型。结果双纸片扩散法证明有2株产志贺毒素大肠埃希菌产ESBLs，美国株E．coli 5 nonO157：H7和中国株E．coli 27O157：H7对头孢他啶等第三、第四代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素耐药。并能通过5．8kb的质粒传递给受体菌。PCR检测含有blaTEM基因。DNA同源分析表明861bp的blaTEM DNA片段与blaTEM-1 DNA片段同源。结论产志贺毒索大肠埃希菌美国株和中国株产生相同类型的ESBLs。表现出对第三、第四代β-内酰胺酶类抗生素耐药。     

强化针对产ESBLs细菌的临床药学研究

超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）又称氧亚氨-β内酰胺酶,是由革兰阴性菌产生的β内酰胺酶质粒介导的耐受基因发生突变后产生的酶。主要由克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌属及不动杆菌属产生。