截短型TGF-β Ⅱ型受体原核表达载体的构建

目的：构建截短型TGF-β型受体,为TGF-βⅡ型受体的研究提供平台。方法：用定向克隆方法将tTGF-β基因插入载体PET-28a,原核表达,构建重组质粒tTGF-βRⅡB。结果：经酶切鉴定及DNA序列测定,重组质粒tTGF-βRⅡB序列及阅读框架正确。结论：成功地构建了PET-28a-tTGF-βRⅡB重组质粒。     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。     

缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体的构建

目的：本实验旨在通过构建大鼠缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体的真核表达质粒载体,为研究大鼠肝组织因TGFβ1Ⅱ型受体缺陷而阻断TGFβ1的作用后,对人工免疫性大鼠的肝组织及其他组织的影响提供实验材料.方法：根据大鼠肝组织TGFβ1Ⅱ型受体的基因序列,设计在特异的位置添加终止密码,在此序列两端加入特异的限制性内切酶的酶切位点,从而构建大鼠的缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体基因序列,再利用基因重组技术,将其连接在真核表达质粒载体中,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序加以验证.结果：运用分子生物学技术,成功获取突变体TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体,经过DNA测序鉴定,确认为实验预期所需.结论：TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体构建成功,其关键涉及基因片段及载体的选择.     

人TGFβ1cDNA高表达重组质粒的构建

目的为了得到基因工程制备的人重组TGFβ1,构建人TGFβ;cDNA高表达重组质粒。方法从人血小板中提取总RNA,经RT－PCR得到TGFβ;cDNA基因,并克隆到表达质粒pBLMVL2中,构建了在PL启动控制基因表达质粒pBLMVL2－TGFβ;,使其在大肠杆菌中进行温敏诱导表达。结果RT－PCR得到的TGFβcDNA经DNA序列分析与文献报道一致,pBLMVL2－TGFβ1在大肠杆菌中表达产物人重组TGFβ1经还原型SDS－PAGE电泳,呈一条蛋白条带,分子量12．5kd,表达产物约占全菌蛋白20％。结论构建的重组质粒pBLMVL2－TGFβ1能高表达人重组TGFβ1。     

TGFβ1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.方法:根据人TCFβ1的mRNA序列选择3个靶序列并根据它们设计合成3对寡核苷酸序列.同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连人pRNA-U6/Lenti质粒,酶切和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293FT细胞,包装产生病毒颗粒.各组病毒载体转染Hela细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TGFβ lmRNA和蛋白的表达水平.结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNA-U6/Lenti质粒;各质粒与包装质粒共转染293FT细胞后能产生高滴度的慢病毒载体颗粒;各组慢病毒载体感染Hela细胞后,有两组可以显著抑制TGFβ1mRNA水平及蛋白水平的表达,其中以第一组效果最佳.结论:成功构建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.     

缺陷型TGF_1βⅡ型受体真核表达质粒载体的构建

目的:本实验旨在通过构建大鼠缺陷型TGF1βⅡ型受体的真核表达质粒载体,为研究大鼠肝组织因TGF1βⅡ型受体缺陷而阻断TGF1β的作用后,对人工免疫性大鼠的肝组织及其他组织的影响提供实验材料。方法:根据大鼠肝组织TGF1βⅡ型受体的基因序列,设计在特异的位置添加终止密码,在此序列两端加入特异的限制性内切酶的酶切位点,从而构建大鼠的缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体基因序列,再利用基因重组技术,将其连接在真核表达质粒载体中,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序加以验证。结果:运用分子生物学技术,成功获取突变体TGF1βⅡ型受体真核表达质粒载体,经过DNA测序鉴定,确认为实验预期所需。结论:TGF1βⅡ型受体真核表达质粒载体构建成功,其关键涉及基因片段及载体的选择。     

赖氨酰氧化酶基因原核表达克隆的构建

目的 克隆编码人赖氨酰氧化酶(hLOX)的基因片段,并构建含有该基因的重组原核表达质粒,为制备基因工程化的重组hLOX奠定基础.方法 从人皮肤成纤维细胞中抽提RNA,通过RT-PCR扩增LOX编码序列(750bp),所得目的 基因插入原核表达载体质粒pET28a,转化大肠杆菌DH5a.重组质粒pET28a-hLOX经双酶切和核苷酸序列分析鉴定.结果 载体质粒pET28a中插入的基因片段与hLOX基因序列完全相同.结论 成功构建含有人LOX基因的重组表达质粒.     

人干燥综合征A抗原重组体的构建及鉴定

目的 克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-52kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础.方法 根据GenBank中检索到的人SSA-52kD cDNA序列,在5'非编码区和3'非编码区设计特异性引物,提取人源Hela细胞总RNA作为模板,反转录RT-PCR扩增人干燥综合征SSA-52kD抗原cDNA.PCR产物纯化后连接至载体PET30a,导人大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD.对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对DNA测序结果进行鉴定分析.结果 RT-PCR扩增产物为1447bp.重组质粒PET-30a-SSA-52kD经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段.序列分析提示与GenBank中检索到的一致.结论 成功克隆人SSA-52kD基因,并构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD.     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的:探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的词控机制。方法:以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1--1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc，采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS—Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞，用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞，检测并比较荧光素酶／β-半乳糖苷酶活性，以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果：(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确；(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达；(3)在LPS刺激下．人eNOS启动子的转录活性降低，而在tPNS和TGFβ1刺激下，其启动子的转录活性增强，其中，TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论：正确构建了人eNOS基因启动子区(-1-1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS—Luc；tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

前列腺癌免疫治疗中质粒pLenti6／V5-D-TOPO-TβRⅡDNglytk构建的意义及相应慢病毒的产生

目的构建含有TβRⅡDNglytk的慢病毒质粒载体,生产出相应的慢病毒,用于对TGF—β失敏感的CTL的制备。方法先以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡDN和HSV—tk基因,用重组PCR方法获得TβRⅡDNglytk融合基因,用PCR扩增出TRANSglytk基因;再用TOPO克隆技术将其连接到慢病毒表达质粒,经测序验证;最后用Invitrogen公司提供的ViraPowerTMLentiviralSystem和293细胞合成慢病毒,并用293细胞完成其滴度测定。结果完成慢病毒质粒TβRⅡDNglytk的构建,经测序验证序列正确;生产的慢病毒具有感染能力,其滴度达到实验要求,叮用于对TGF—B不敏感的肿瘤特异性CTL的制备。结论运用重组PCR技术合成TβRⅡDNglytk及TRANSglytk两个融合基因,并用TOPO克隆技术连接到pLenti6／V5-D-TOPO载体,成功构建了慢病毒表达载体,说明此方法用于病毒载体的构建是快捷可行的;用ViraPowerTMLentiviralSystem和293FT细胞成功制备了慢病毒,为生产TGF—B不敏感的人肿瘤特异性CTL提供了基础。     

弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达

目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化人大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础.方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质...     

携带跨膜信号的凋亡蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建携带跨膜信号序列的凋亡蛋白（apoptin）的原核表达载体PET-28a（＋）-apoptin,诱导表达并纯化重组apoptin蛋白,制备多克隆抗体。方法用多重PCR的方法扩增跨膜信号序列（PTD）及apoptin的编码序列,构建原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,转化大肠杆菌BL21（DE3）,低温条件下IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法鉴定蛋白表达,经镍亲和层析方法纯化目的蛋白后,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体。结果DNA测序鉴定表明成功构建了原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经低温和IPTG诱导后,获得重组apoptin蛋白,制备的多克隆抗体经ELISA方法和免疫印迹法证实能特异性地识别apoptin。结论成功获得了携带跨膜信号序列的重组蛋白apoptin及其多克隆抗体,为进一步研究其特异性诱导肿瘤细胞凋亡功能及相关机制奠定了基础。     

野生型DNA聚合酶β重组绿色荧光蛋白表达载体的构建

目的：构建携带野生型DNA聚合酶β基因(wtDNA polβ)的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3——polβ。方法：运用PCR方法，从质粑pcDNA3．1-polβ中扩增出wtDNA polβ的开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—T载体，再定向克隆至pEGFP—C3，重组质粒pEGFP—C3—polβ用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果与结论：多种鉴定方法让实了重组载体pEGFP—C3—polβ中的wtDNA polβ序列与GenBank中已知的序列相符。携带wtDNA polβ的重组增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3—polβ构建成功。     

人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体的构建

目的构建人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。方法以人胰腺癌(PANC)-1细胞株cDNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增胰腺十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a中,经限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切及DNA序列分析重组质粒的目的基因。结果 RT-PCR扩增产物的特异性片段长度为885 bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-PDX-1经HindIII和BamHI双酶切后显示5 900 bp和885 bp左右的2条片段,测序结果与Genbank中的人PDX-1基因cDNA序列一致。结论成功构建了人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

Ki-P21ras蛋白原核表达质粒的构建、表达及纯化的研究

目的：构建Ki—ras—PET—28a（＋）原核表达质粒，并表达、纯化得到Ki—P21ras蛋白。方法：人工合成Ki—ras基因cDNA的蛋白编码CDs区序列，并在其正义链5′加上BamHⅠ酶切位点，3′加上HindⅢ酶切位点，经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有粘性末端的Ki—ras cDNA，将PET-28α（＋）同样经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到与Ki—ras cDNA有相同粘性末端的线形片段，通过T4DNA连接酶将具有粘性末端的Ki—ras cDNA与酶切后的PET-28α（＋）定向连接，构建重组质粒Ki—ras—PET—28a（＋），经酶切和测序鉴定。将鉴定正确的Ki—ras—PET—28α（＋）转入感受态细菌BL21（DE3）中诱导表达，利用组氨酸“标签”（His-Tag）对P21ras进行亲和层析纯化。结果：测序分析证实，克隆人PET-28α（＋）的Ki—ras序列与Genbank登录号为“M54968”的Ki-ras cDNA序列一致，将重组质粒Ki—ras—PET—28α（＋）转化BL21（DE3），IPTG诱导目的蛋白表达。SDS—PAGE和蛋白纯化结果表明，Ki—ras—PET—28α（＋）在大肠杆菌中获得可溶性高表达，经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的ki—P21ras蛋白，Western-Blot分析证实其免疫活性。结论：成功构建了原核表达载体Ki—ras—PET—28α（＋），并经表达、纯化得到具有生物活性的P21ras蛋白，为研究P21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及抗P21ras细胞内抗体的研究奠定了基础。     

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1—polβ的构建

目的：构建含突变型polβ基因重组表达载体。方法：从食管癌标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,克隆入pCDNA3．1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒,并进行测序。结果：测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论：成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体,可应用于下游研究。     

淋球菌主要外膜蛋白PIA原核重组质粒的构建及序列分析

目的：构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因的pET重组质粒，分析其编码序列。方法：根据PIA已知序列设计——对引物，用PCR技术从淋球菌捷克标准株中扩增PIA；将目的基因PCR产物和质粒pET28a( )同时用BamHI和Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切，纯化回收后将其连接并将重组质粒转化大肠杆菌DH5α。将构建的重组质粒pET28a( )-PIA通过PCR、质粒双酶切、DNA测序证实获得正确的重组克隆。结果：成功构建PIA基因原核重组质粒pET28a( )-PIA。序列分析表明，其携带的PIA基因序列与GenBank中公布的淋球菌(AF090818)的PIA序列具有很高的同源性，其同源性达到99．9％。结论：成功构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因重组表达载体，有助于更深入地分析其基因功能，为后期淋球菌的临床检测和基因疫苗研制打下基础。     

DNA聚合酶β靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建DNA聚合酶β（polβ）靶向的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体。方法：根据GenBank中人DNApolβ基因（M13140）的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果：经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论：成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。