抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础.     

截短型TGF-β Ⅱ型受体原核表达载体的构建

目的：构建截短型TGF-β型受体,为TGF-βⅡ型受体的研究提供平台。方法：用定向克隆方法将tTGF-β基因插入载体PET-28a,原核表达,构建重组质粒tTGF-βRⅡB。结果：经酶切鉴定及DNA序列测定,重组质粒tTGF-βRⅡB序列及阅读框架正确。结论：成功地构建了PET-28a-tTGF-βRⅡB重组质粒。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

人β细胞素基因原核表达载体的构建

目的构建人BTC基因的原核表达载体。方法以人胰岛细胞瘤CDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCK）扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列，克隆入原核细胞表达载体PET32a（＋）中，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCK扩增的特异性片段长度为240bp，以此构建的重组质粒PET32a（＋）-BTC，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5．9kb和250bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中的人BTC基因eDNA（Genbank序列号NM_001729）序列一致。证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a（＋）中。结论成功构建了PET32a（＋）-BTC重组原核表达载体。     

血小板衍化内皮细胞生长因子原核表达载体的构建

目的 构建血小板衍化内皮细胞生长因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）的原核表达载体。方法 设计引物扩增ＰＤ－ＥＣＧＦ的ｃＤＮＡ,然后亚克隆入原核表达载体ｐＱＥ和ｐＱＥ－３２ａ,并转化入大肠杆菌ＪＭ１０９。结果 通过菌落原位杂交、ＰＣＲ和重组质粒酶切分析等方法,筛选出重组阳性克隆。结论 此重组质粒可用于原核表达等进一步研究。dir     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnI的cDNA片段，设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导入宿主菌BL21（DE3）中，采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因，重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致，测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

转化生长因子-β1 shRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建转化生长因子（TGF）-β1短发卡RNA（shRNA）表达载体,为肿瘤生物学研究奠定方法基础。方法根据TGF-β1的mRNA序列,运用Ambion公司的Target Finder软件筛选TGF-β1shRNA的候选点,在BglⅡ和HindⅢ位点克隆到表达载体pSUPER gfp-neo上。重组的shRNA pSUPER gfp-neo在大肠杆菌DH5a上筛选和鉴定。分别用酶联免疫吸附法（ELISA）测定和免疫荧光筛选最佳TGF-β1shRNA靶点序列。结果 ELISA和免疫荧光染色结果显示,shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c均在不同程度上降低了靶细胞TGF-β1蛋白质表达,以shRNA-b所引起的下降最为显著（P〈0.05）。结论构建的TGF-β1shRNA在肿瘤细胞中产生较好的TGF-β1沉默效果,为肿瘤生物学研究提供了一种方法。     

抑癌基因p16原核表达载体的构建及其表达的研究

为获取具有生物学活性的ｐ１６蛋白，采用定向克隆方法将双酶切克隆质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｐ１６得到的ｐ１６ ｃＮＤＡ片段连接到双酶切的原核表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌ＴＧ１得到含重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｐ１６的工程菌，温度诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ｐ１６蛋白。     

人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnⅠ的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

高脂血症对实验性肾病大鼠肾脏TGF—β1基因表达的影响

目的 本研究观察高脂饮食对阿霉素肾病（ADR）模型大鼠肾脏TGF—β1，基因表达的影响，并探讨辛伐他汀及苯那普利对ADR大鼠肾脏TGF-β1基因表达的影响。方法 根据大鼠TGF—β1cDNA的序列，设计TGF—β1逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）的引物，以RT—PCR法观察不同组大鼠肾脏TGF-β1mRNA在4，8，12周时的表达，并以GAPDH为内参照；标记（地高辛）TGF-β1探针，在不同组大鼠的肾组织冰冻切片上作原位杂交，检测12周时大鼠肾脏TGF-β1mRNA的表达情况。结果 高脂饮食ADR大鼠4，8，12周时肾脏TGF-β1mRNA表达逐步上调，8，12周明显高于普通饲料肾病大鼠，12周时原位杂交结果表明高脂饮食肾病组肾脏TGF-β1mRNA增强明显，以小管间质为主，而普通饲料肾病组TGF-β1；mRNA表达主要在小管间质，呈局灶性分布；辛伐他汀组和苯那普利组大鼠肾脏TGF-β1mRNA表达较高脂饮食肾病大鼠组明显降低；正常大鼠高脂饮食组TGF-β1mRNA表达在12周时高于正常对照组。结论 高脂饮食ADR大鼠肾脏促纤维化因子TGF—β1mRNA随时间延长表达明显上调，表达以小管间质为主；辛伐他汀及苯那普利能明显降低肾脏TGF-β1mRNA的表达，辛伐他汀降低肾脏TGF—β1mRNA的作用机制可能与降低高脂血症相关的RAS活性有关，还可能与抑制MVA通路的间接作用有关；而苯那普利降低大鼠肾脏TGF—β1mRNA表达与其直接抑制AngⅡ介导作用有关。     

人胃蛋白酶原A基因原核表达载体构建及鉴定

目的构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A)原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达。方法以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒。结果 PCR扩增出约1 000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功。结论成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础。     

凋亡素原核表达载体的构建和表达

目的 构建凋亡素原核表达系统，以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 通过PCR方法，以pcDNA-VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达栽体pET-DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后，聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38300的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达栽体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

βig-h3基因4段高度保守序列定位、克隆及原核表达载体的构建

目的：确定βig—h3基因4段高度保守序列的序列位置,克隆βig—h3全长及4段高度保守序列的基因,分别构建原核表达载体．方法：用RT—PCR方法获得βig—h3全长及4段高度保守序列的基因,以pRSET—A为载体,分别构建重组原核表达质粒．结果：测序结果证实获得B睁h3全长及4段高度保守序列的基因,其序列与GenBank中报道完全一致．分别正确连入pRSET—A载体中,读码框正确．结论：成功构建βig-h3基因全长及4段高度保守序列的原核表达载体,为进行结构与功能相关性研究奠定了基础．     

缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体的构建

目的：本实验旨在通过构建大鼠缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体的真核表达质粒载体,为研究大鼠肝组织因TGFβ1Ⅱ型受体缺陷而阻断TGFβ1的作用后,对人工免疫性大鼠的肝组织及其他组织的影响提供实验材料.方法：根据大鼠肝组织TGFβ1Ⅱ型受体的基因序列,设计在特异的位置添加终止密码,在此序列两端加入特异的限制性内切酶的酶切位点,从而构建大鼠的缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体基因序列,再利用基因重组技术,将其连接在真核表达质粒载体中,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序加以验证.结果：运用分子生物学技术,成功获取突变体TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体,经过DNA测序鉴定,确认为实验预期所需.结论：TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体构建成功,其关键涉及基因片段及载体的选择.     

靶向克隆法构建NY-ESO-1基因的原核表达载体

目的:利用PCR产物靶向克隆法构建人癌-睾丸抗原NY-ESO-1的原核表达载体。方法:从人新鲜的食管癌组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增NY-ES0-1基因3′端的340bp片段,采用靶向克隆法将目的基因插入到原核表达载体pET-15b中,得到重组表达质粒pET-15b-NY-ESO-1,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物核苷酸序列分析等,鉴定所构建的原核表达载体。结果:扩增得到NY-ESO-1基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒经过PCR,酶切鉴定获得了一个大小为340bp的特征性片段,证明重组质粒中已成功的插入了目的基因NY-ESO-1。结论:靶向克隆法可快速、高效地构建人NY-ESO-1基因的原核表达载体,为制备pET-15b-NY-ESO-1融合蛋白奠定了基础。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。