人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 :建立人肾小管上皮细胞原代培养、传代、冻存及鉴定方法。方法 :采用肾小管节段贴块培养法 (A法 )与消化培养法 (B法 )对比原代培养 ,并以 0 .2 5 %胰蛋白酶消化、传代 ,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类 ,常规冻存和复苏。结果 :A法成功培养、传代、冻存、复苏并鉴定了人肾小管上皮细胞 ,B法失败。结论 :肾小管节段贴块培养法用于人肾小管上皮细胞原代培养是可行的     

微分离方法原代培养大鼠肾近曲小管上皮细胞

目的建立比较理想的大鼠肾近曲小管上皮细胞的原代培养及鉴定方法。方法采用显微微分离单根肾近曲小管节段的方法进行原代培养,并用免疫细胞化学方法和电镜进行鉴定。结果用微分离方法成功地培养出肾小管上皮细胞,经鉴定为该细胞。结论微分离方法是大鼠肾近曲小管上皮细胞原代培养的有效方法。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的建立一种实用高效的小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离培养方法,并进行初步表型鉴定。方法采取贴壁细胞分离法分离和培养MSCs。倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态及生长过程,使用免疫细胞化学方法进行MSCs的初步表型鉴定。结果 MSCs贴壁生长,形态均一,呈成纤维缓胞样,生长状态良好。免疫细胞化学检测显示:CD44、CD105、CD34阳性率分别为94.3%、82.3%、3.3%。结论采用贴壁培养法可分离培养出高纯度的MSCs。     

神经细胞的原代培养及缺血再灌注模型的建立

目的:建立良好的SD乳鼠神经细胞原代培养及缺血再灌注模型。方法:选用SD乳鼠大脑皮质进行细胞培养,采用机械研磨、过滤、胰酶消化、percoll(硅石胶态悬浮液)、密度梯度离心法分离纯化大脑皮质细胞后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养。利用分离纯化的幼鼠大脑皮质,制作细胞爬片,利用免疫组化进行鉴定。结果:大脑皮质细胞贴壁生长,4～7d基本达到融合,结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代细胞培养97%为神经细胞。而后采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。结论:采用机械研磨、过滤、胰酶消化结合percoll:密度梯度离心法分离培养的大脑皮层神经细胞数量多,均一性生长佳,采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。为以后实验打下基础。     

原代肾小管上皮细胞的培养和鉴定

目的:建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养及鉴定方法.方法:采用研磨、消化培养法,用免疫细胞化学和RT-PCR鉴定细胞.结果:培养的细胞CK18蛋白表达阳性,基本没有α-SMA 和Vimentin的蛋白表达,E-cadherin mRNA强表达.结论:成功建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养方法,为肾脏疾病的研究提供实验平台.     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的建立一种实用高效的小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离培养方法,并进行初步表型鉴定。方法采取贴壁细胞分离法分离和培养MSCs。倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态及生长过程,使用免疫细胞化学方法进行MSCs的初步表型鉴定。结果 MSCs贴壁生长,形态均一,呈成纤维缓胞样,生长状态良好。免疫细胞化学检测CD44、CD105、CD34阳性率分别为94.3%、82.3%、3.3%。结论采用贴壁培养法可分离培养出高纯度的MSCs。     

兔正常膀胱移行上皮细胞的体外培养和鉴定

目的：摸索膀胱移行上皮细胞的合适培养条件，为建立满足组织工程需要的尿路上皮细胞体培养体系提供实验基础。方法：采用无血清培养系统，以组织块法原代培养兔正常膀胱移行上皮细胞并传代。动态观察细胞形态变化和生长增殖状况，进行免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。结果：原代第4开始有上皮样细胞自组织块边缘长出，第10-14天汇合，呈典型铺路石样外观。2代超细胞生长4-7d后汇合，未发现成纤维样细胞混杂生长。细胞可传至6代以上。细胞角蛋白AE1/AE3单抗染色各代细胞均呈阳性反应。结论：分离培养的是单一的膀胱移行上皮细胞，细胞具有一定的增殖传代能力。     

SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

目的：探讨大鼠肾小管上皮细胞的体外培养及鉴定方法,为肾结石病的研究提供实验平台。方法：采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离出肾小管节段,在含10%胎牛血清和1%上皮细胞生长因子的上皮细胞培养基中培养,0.25%胰蛋白酶消化后传代培养,并用原代和传1代细胞做免疫细胞化学染色鉴定。结果：细胞培养至第3天完全贴壁,4～7d处于对数生长期,为多边鹅卵石样;免疫细胞化学染色显示cytokeratin18表达阳性。结论：机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法结合使用上皮细胞培养基可以培养得到较纯的肾小管,是大鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法,为进一步研究泌尿系结石病因和机制提供了实验基础。     

酶消化法分离培养原代肺动脉平滑肌细胞及免疫组化鉴定

目的建立体外胶原酶消化法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)及免疫鉴定的方法。方法采用I型胶原酶对PASMCs进行体外培养。在无菌环境下,分离提取雄性Sprague Dawley(SD)大鼠肺动脉主干,剥离外膜、剔除内皮细胞,经酶消化法,体外培养PASMCs。倒置相差显微镜观察PASMCs生长状态及特点;台盼兰测定细胞活力;免疫细胞染色法进行平滑肌α-肌动蛋白(α-SM actin)鉴定。结果酶消化法分离培养的PASMCs 3 d后,可见细胞贴壁呈梭形生长,6 d后生长迅速呈典型的峰-谷状生长,9 d后达90%融合。通过形态学观察及免疫荧光染色法鉴定表明:培养的细胞为PASMCs;细胞存活率为98.5%;原代培养8~10 d后即可传代,3-10代细胞生长迅速、细胞形态不易发生改变,可用于进行细胞实验。结论采用I型胶原酶消化法简单易行、可靠、PASMCs生长迅速、传代周期短的特点;尤为重要的是,培养的原代PASMCs可用于肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。     

一种大鼠主动脉内皮细胞分离培养的改良方法

目的探索一套原代培养大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)简单实用的方法体系。方法 SD大鼠两只,无菌环境下分离胸腹主动脉,清除脂肪、结缔组织。显微剪剪开主动脉,内膜面向下贴附于少量Ⅰ型胶原酶上消化60min。离心收集内皮细胞置于1%明胶包被的六孔板,加入20%胎牛血清的M199中培养。3～4天后换液更换内皮细胞培养基(ECM)培养。当细胞长满约90%底面积时,玻璃探针机械剔除成纤维样细胞后传代。倒置显微镜和抗Ⅷ因子抗体对细胞分别做形态学和免疫细胞化学鉴定。结果原代培养3～4天时,少量细胞开始贴壁并分裂生长。更换ECM后细胞增殖迅速,培养8～10天时可见细胞长满90%左右的底面积,呈典型的"铺路石"或"鹅卵石"征。免疫细胞化学鉴定表明在分离培养的内皮细胞中有特定Ⅷ因子表达。原代周期8～10天,传代周期3～4天,经纯化传代后纯度接近100%。传至第6代仍未见细胞分裂增殖活性下降。结论本实验体系培养RAEC简单有效,重复性良好。获得细胞数量多、纯度高,有利于实验人员掌握。     

Percoll法分离培养肾小管上皮细胞

目的建立良好的肾小管上皮细胞培养方法。方法选用SD幼鼠的肾组织进行细胞培养，采用Percoil密度梯度离心法分离纯化肾小管后，选择含10％新生牛血清的DMEM／F12培养基、5％CO2、37℃孵箱进行细胞培养。利用传1代的细胞，制作细胞爬片，用免疫组化、透射电镜进行鉴定。结果细胞生长4—5天后基本达到融合，细胞呈多边鹅卵石铺路样。结合形态学及免疫组化鉴定，细胞培养传1代后98％的细胞为肾小管上皮细胞。结论用Pereoll法分离培养的细胞数量多，均一性生长较好，可重复性操作较好。为体外研究接近组织原位RTECs细胞功能和特征及药物的筛选提供了可行性和可能性。     

新生大鼠窒息后肾组织c-fos和cyclinD1的表达及意义

目的：研究c-fos和cyclinD1在新生大鼠窒息后肾组织的表达及意义。方法：45只新生大白鼠随机分成4组，即对照组(13只)，窒息30min后复氧2h组(10只)，窒息30min后复氧24h组(11只)，窒息30min后复氧48h组(10只)。制成常压窒息模型。用免疫组化ABC法检测窒息后复氧不同时间点肾组织中c-fos，cyclinD1的表达。结果：窒息后复氧2h肾组织c-fos和cyclinD1的阳性细胞数开始增加，在24—48h达高峰。同时c-fos和cyclinD1的表达主要集中在肾小球，远曲小管，集合管等处的细胞核中，而近曲小管的表达弱。结论：c-fos和cyclinD1可能参与了窒息后肾损伤的修复和防护。     

小鼠肾间质纤维化早期上皮细胞-间充质细胞转型研究

目的:探讨小鼠肾间质纤维化早期是否存在肾小管上皮细胞间充质细胞转型的形态学变化.方法:利用单侧输尿管梗阻的方法建立小鼠肾间质纤维化模型,常规组织学分析小鼠肾脏病理变化,免疫组化检测a-SMA的表达,肾基底膜六胺银染色和透射电镜观察肾小管基底膜的变化情况,明胶酶谱分析观察肾脏中MMP2和MMP9的表达情况.结果:成功地建立了小鼠肾间质纤维化模型,并被组织学分析证实.免疫组化分析显示肾脏中出现了大量表达a-SMA的细胞,肾基底膜六胺银染色和透射电镜分析显示小鼠肾间质纤维化早期肾脏出现了肾小管基底膜局部断裂和肾小管上皮细胞迁出的改变,明胶酶谱分析显示小鼠肾脏中MMP2和MMP9于肾间质纤维化早期有一过性增高变化.结论:肾小管基底膜局部断裂,肾小管上皮细胞迁出以及MMP2和MMP9的表达变化参与了小鼠肾间质纤维化早期上皮细胞-间充质细胞转型的过程.     

大鼠肾小管上皮细胞的分离鉴定及其增殖活力分析

目的：建立一种大鼠肾小管上皮细胞的分离鉴定方法,分析所获得细胞的增殖活力,为肾损伤等肾脏疾病的体外分析实验提供理论基础和技术支持。方法：采用Ⅱ型胶原酶消化法分离肾小管节段,并用Percoll密度梯度离心法进一步纯化肾小管,常规条件下对肾小管节段进行贴壁培养,待细胞爬出后,用免疫组织化学方法检测细胞角质素-18（CK-18）的表达情况,采用流式细胞术对第0、1和2（P0、P1、P2）代细胞的CK-18表达情况进行分析,用CCK-8方法检测各代细胞的增殖活力。结果：肾小管节段培养24 h后,可见细胞从节段内爬出;培养72 h后,细胞呈铺路石样密集生长。随着传代进行,P0、P1和P2代细胞CK-18的表达效率分别为95.9%、91.5%和76.8%,肾小管上皮细胞逐渐死亡,P2代细胞较P1代细胞增殖活力明显减弱(P<0.05),同时培养体系中杂细胞增多。结论：该方法经济可靠、简便易行,但是所分离的肾小管上皮细胞只可在体外传代2次,不能长期培养,仅P0、P1代细胞可供体外分析实验使用。     

VDR和NaDC1在HK-2细胞中的表达及其对低枸橼酸尿症的意义

［摘要］目的　探讨维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）和二羧酸转运蛋白1（sodium-dicarboxylate cotransporter protein 1，NaDC1）在人肾近曲小管上皮细胞（HK-2 cells，HK-2细胞）中的表达及其对低枸橼酸尿症的意义．方法 按照HK-2细胞培养的条件培养细胞，采用流式细胞学检测所培养的HK-2细胞的细胞凋亡，免疫细胞化学SP法检测VDR和NaDC1在HK-2细胞中的表达．结果 细胞培养:拍照记录细胞状态；流式细胞学:1号至4号流式管HK-2细胞凋亡率分别为6.87%，6.80%，8.31%，4.274%；免疫细胞化学:NaDC1在HK-2细胞中表达，胞膜染色．NaDC1的阴性对照，胞膜未染色．NaDC1的阳性对照，在人胚肾293细胞（human embryonic kidney 293 cells，HEK293 cells）胞膜表达，胞膜染色．VDR在HK-2细胞中表达，核膜染色．VDR的阴性对照，核膜未染色．VDR的阳性对照，在人肺癌细胞系A549核膜表达，核膜染色．结论 所培养的HK-2细胞的细胞凋亡率比较低，细胞状态较好．VDR和NaDC1分别在HK-2细胞核膜和胞膜表达．VDR和NaDC1都与低枸橼酸尿症的发生发展有关，推测VDR可能参与调控NaDC1活性或表达．     

人胚胎肾脏发育的超微结构研究 Ⅱ．肾小管的发育

本文应用光镜、扫描及透射电镜对２０例正常发育的人胚胎肾脏（８～２８周）进行观察。结果表明：①肾小管的发育与肾小体发育相一致。②肾小管分化发育大致分为未分化期、分化期和成熟期３个阶段。③胚胎第８周近、远端小管已形成，第１０周已有小管发育较好。④胚胎期近端小管上皮细胞可观察到一种大小、密度不同的胞质颗位。⑤肾小管尿极的壁层上皮与近端小管上皮之间有一明显过渡区。⑥集合管、近端、远端小管均可见明、暗两种类型上皮细胞。     

肾小管损伤中载脂蛋白H表达的研究

目的 探讨载脂蛋白H（apo H)在儿童肾小管损伤中的基因表达及临床意义。方法 采用聚合酶链反应观察32例肾小管损伤患儿血白细胞中apo H的表达，并以肾病组与正常儿童作对照。结果 apo H碱基对为343bp，条带可清晰区分，无杂带出现。同时测定肾小管损伤组儿童尿NAG酶的水平，明显高于肾病组与对照组；同时发现在肾小管损伤组中外周血单个核细胞apo H的基因表达呈阳性，而肾病组与对照组apo H的基因表达均为阴性。从而说明apo H的基因表达可反映肾小管功能的损伤。结论 本方法灵敏度高、且专一性较好，为研究肾小管损伤奠定了基础。apo H是反映肾小管损伤较早的指标，有助于临床及早诊断肾小管疾病，对其早期治疗及判定预后有着重要的临床意义。     

实验性IgA肾病肾小管的超微病变

为研究ＩｇＡ肾病时肾小管上皮细胞的病变，用右旋糖酐诱发小鼠ＩｇＡ肾病。结果为：ＩｇＡ肾病的主要超微病变为肾小球系膜细胞轻度增生，系膜基质及血管球基膜内有电子致密物沉积。同时，肾小管上皮细胞内线粒体肿大、嵴减少、断裂或消失，内质网扩张，髓样小体增多。以上结果表明：ＩｇＡ肾病时，病变波及肾小管上皮细胞     

大鼠胃平滑肌细胞的体外分离与三维支架培养方法

目的:探讨复合胶原酶和胰蛋白酶解离大鼠胃平滑肌细胞,建立稳定的胃平滑肌细胞体外培养模型,并探讨其三维复合培养的可行性。方法:0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰蛋白酶酶解大鼠胃平滑肌,用相差显微镜观察细胞学形态与生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞;采用纤维蛋白胶作为细胞外基质建立三维PLGA复合物培养模型,荧光显微镜观察复合物中的细胞活性。结果:平滑肌组织裂解充分均匀,细胞接种成功率高,1～2周细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长;α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色证实所获得的平滑肌细胞,荧光显微镜下观察到PLGA支架内细胞均匀分布,存活率达90%以上。结论:酶解分离法可获得高纯度大鼠胃平滑肌细胞,三维支架培养在体外成功培养胃平滑肌细胞复合物,为深入研究胃组织工程再生奠定了基础。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较理想的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法。方法:新生大鼠大脑皮层通过胰酶消化获取单细胞悬液,用台盼蓝染色鉴定活性后种板培养;培养第3~4天加入阿糖胞苷纯化神经元;最后用甲苯胺蓝染色检测尼氏体进行鉴定。结果:实验获取细胞存活率高;在体外培养条件下细胞生长旺盛,培养第6~7天,细胞胞体较大,突起粗,分支多,突起交织成网,并能形成典型的神经细胞网络;培养第10~14天,检查有尼氏体细胞占90%以上。结论:该培养技术是大鼠皮层神经元体外培养的一种较理想的方法。