重组嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ζ全基因合成及其真核表达载体的构建

目的通过合成嵌合受体anti-erbB2scFv-CD28-ζ的基因并建立其真核表达载体,为进一步研究增强NK细胞抗瘤活性创造条件。方法在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对目的基因密码子及RNA二级结构进行优化并在序列的两端分别引入HindⅢ和EcoRI限制酶切位点,根据基因序列分析的结果化学合成长度为50～70bp的单链oligo,利用PCR将合成的oligo拼接成完整的序列,将合成好的序列装入PMD-18T载体并转染至感受态细胞DH5α,测序验证重组克隆中基因序列。完整的序列经HindⅢ和EcoRI酶切后连接至目的载体PCDNA3.1（＋）中,并转染COS-7细胞。结果合成DNA片段长度为1803bp,经测序验证与目的基因嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ζ大小、序列一致。结论构建其真核表达载体PCDNA3.1（＋）后转染COS-7细胞,实现了anti-erbB2 scFv-CD28-ζ基因在COS-7细胞中的体外转染及瞬时表达。     

重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建

目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,转染PA 317细胞株,包装制备重组非复制型逆转录病毒.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,经G418筛选,收获上清液获非复制型逆转录病毒,将病毒感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞中的表达情况,确定病毒滴度.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.     

干扰素-α真核表达载体的构建及抗肿瘤研究

目的：构建干扰素真核表达载体及干扰素对T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat的作用。方法：将编码干扰素的基因片段插入到真核表达载体pCI中，构建的重组体转化大肠杆菌HB101，经筛选鉴定后，再转染哺乳动物细胞，检测其表达产物。(MTT)法测定梯度浓度的干扰素—α对Jurkat细胞增殖起杀伤作用。结果：电泳显示目的基因片段已正确地插入到真核表达载体中．其阳性克隆转染哺乳动物细胞后的产物可表达干扰素的活性及对Jurkat的作用。结论：干扰素—α真核表达载体构建成功。     

转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建及鉴定

[目的]克隆转录抑制因子Bmi-1基因并构建其正、反义真核表达载体,为研究其功能及其作用机制奠定基础。[方法]根据Bmi-1基因已知序列,设计合成一对引物,上下游引物分别加入XhoI和ClaI的酶切位点,用反转录PCR（RT-PCR）方法从人红白血病细胞株（K562）总RNA中扩增编码Bmi-1的基因片段（1017 bp）,插入克隆载体pMD18-T,构建pMD18-Bmi-1载体,经限制性核酸内切酶谱证实后,再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中,构建pLNCX2-Bmi-1真核表达载体,并经测序证实。然后以pLNCX2-Bmi-1为模板,物扩增Bmi-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171bp长度的核苷酸片段,并反向连接于表达载体（pLNCX2）上。[结果]DNA测序表明编码序列与读框完全正确,RT-PCR扩增出和目的片段相同的片段,正义DNA片断长度为1029bp,反义片断长度为171bp,Bmi-1基因被成功扩增并被克隆至真核表达载体pMD18-T和pLNCX2中。[结论]Bmi-1正义及反义片断被成功扩增,并成功构建了Bmi-1正、反义重组真核表达载体,为进一步研究该基因打下了基础。     

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。     

肿瘤细胞内特异表达TRAIL载体的构建及其在喉癌细胞株Hepa2中的表达

目的: 克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为肿瘤基因治疗的靶向性奠定实验基础. 方法: 提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181 hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181 hTERT /TRAIL.用Western Blotting鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物.结果: RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片段.经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL.Western Blotting结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌Hepa2肿瘤细胞中能有效表达.结论: 重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具.     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统的构建

目的 CD59和CD2都是重要的淋巴细胞膜表面分子,参与T细胞信号转导。文中构建CD59和CD2融合基因真核表达系统,探讨CD59向T细胞传递信号的机制及CD59与CD2的相互作用。方法在CD59基因和CD2基因间加入一段柔性链接头(linker)基因序列,构建CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。利用RT-PCR法从人T细胞白血病细胞系Jurkat细胞总RNA中扩增CD59和CD2基因,分别构建CD59-T和CD2-T重组克隆载体,经限制性核酸内切酶酶切后与pIRES质粒进行重组,构建pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。结果测序证实CD59和CD2基因扩增成功;经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明携带CD59-linker-CD2融合基因的重组质粒构建成功。结论构建CD59-linker-CD2真核表达系统为在真核细胞中表达CD59与CD2并进一步探讨其在T细胞信号转导中的作用提供了实验材料。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

凋亡抑制因子Survivin siRNA荧光表达载体的构建

目的构建靶向survivin siRNA真核表达质粒载体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因的表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA（dsDNA）,采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,且转染至肿瘤细胞,可见其发出绿色荧光,转染率为70％-80％。结论靶向survivin—siRNA真核表达载体pGU6／GFP／Neo／survivin—siRNA可用于转染肿瘤细胞、阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究,为肿瘤的基因治疗奠定一定的基础。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制。方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1cDNA(3878bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1。通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Westernblotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经HindⅢ-NotⅠ酶切后,得到3878bp(PLCγ1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约1300bp及约8500bp两个片段,与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westernblot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Ra株fbpC基因的克隆与表达

目的：探讨克隆结核杆菌H37Ra菌株抗原fbpC基因及在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法：通过聚合酶链反应扩增人结核杆菌弱毒性菌株H37Ra的编码基因ibpC,并定向克隆到原核表达载体pET-28a,通过酶切、聚合酶链反应和测序鉴定重组质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）中,由异丙基硫代半乳糖苷诱导表达,十二烷基磺酸纳一聚丙烯酰胺和Westernblot鉴定表达的重组蛋白。结果：成功构建了pET28a—fbpC重组质粒;在大肠埃希菌中表达了相对分子量约33000的重组蛋白。结论：重组质粒pET28a—fbpC成功构建和表达,为fbpc反应原性、免疫诊断价值的研究提供参考。     

分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶3融合蛋白对SKBr3细胞的靶向杀伤作用

目的探讨分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶(caspase-3)融合蛋白对：ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法将重构型人caspase-3基因亚克隆入pcMV-e23scFv—PEII—PEIII相应位点,构建表达分泌型的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase-3融合蛋白基因的真核表达载体pcMV-e23scFv-PEII-revcasp3,转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系,ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达以及对人乳腺癌细胞SKBr3生长的抑制作用,并将重组质粒经脂质体包裹后肌肉注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用,间接免疫荧光检测重构型人caspase-3蛋白在瘤体的靶向分布。结果融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤SKBr3细胞,肌肉注射重组质粒明显延长荷瘤裸鼠生存时间(延长72％)和抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长(抑制率为77％)。间接免疫荧光染色显示重构型人caspase-3融合蛋白具有靶向分布。结论分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase-3融合蛋白靶向诱导SKBr3细胞死亡。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

NLRP3基因真核表达载体的构建和定位

目的：构建人NLRP3真核表达载体,并证实融合蛋白在人心肌细胞中定位。方法：以人胎脑cDNA文库为模版,PCR扩增NLRP3全长编码基因,亚克隆至p3×FLAG-cmvTM-10表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测。利用激光共聚焦扫描显微镜观察FLAG-NLRP3在HCM细胞内定位。结果：NLRP3全长基因序列克隆到了真核表达载体p3×FLAG-cmvTM-10中,酶切鉴定片段大小3 111 bp。Western blotting检测到了融合蛋白FLAG-NLRP3表达,分子量约为114 kD。FLAG-NLRP3在人心肌细胞中表达,定位于细胞浆内。结论：成功构建了FLAG-NLRP3全长基因真核表达载体,FLAG-NLRP3蛋白主要定位于心肌细胞浆内。     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。