缺氧复氧后肾小管上皮细胞ICAM-1的表达及NAC对其干预研究

 目的 研究缺氧复氧后肾小管上皮细胞ICAM-1的表达及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对其影响.方法 选用人肾小管上皮细胞(HK2)建立缺氧复氧损伤模型,设正常对照组、单纯缺氧复氧组、不同浓度(1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L)NAC干预组.流式细胞术检测细胞内氧化应激水平,流式细胞术检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白表达、RT-PCR法测定细胞ICAM-1 mRNA表达.结果 缺氧复氧后HK2细胞内氧化应激水平提高,细胞ICAM-1蛋白和mRNA表达上调,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,ICAM-1蛋白和mRNA表达逐渐增强;NAC呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,同时呈剂量关系抑制ICAM-1蛋白和mRNA表达的上调.结论 缺氧复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导ICAM-1表达上调;NAC可以通过抑制细胞内氧化应激抑制ICAM-1的上调.     

胡黄连提取物对缺氧复氧后肾小管上皮细胞氧化损伤的作用

目的研究胡黄连提取物对缺氧复氧后肾小管上皮细胞氧化损伤的保护作用。方法采用肾小管上皮细胞建立缺氧复氧损伤模型（分别缺氧0.5、1、2 h）,取缺氧2 h组分别用不同浓度胡黄连提取物（10、100、1000μg/ml）进行预处理,采用流式细胞术检测不同组细胞凋亡及细胞内氧化应激水平。结果正常情况下肾小管上皮细胞内氧化应激水平非常低,可见极少量凋亡细胞和死亡细胞,与正常对照组相比,各缺氧复氧组细胞内氧化应激水平提高（P〈0.05）,凋亡细胞和死亡细胞数量明显增多（P〈0.05）,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高（P〈0.05）,凋亡细胞和死亡细胞数量逐渐增多（P〈0.05）。与单纯缺氧复氧组相比,不同浓度胡黄连提取物呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平（P〈0.05）,同时呈剂量关系减少凋亡细胞和坏死细胞的数量（P〈0.05）。结论胡黄连提取物可以通过抑制细胞内氧化应激减少肾小管上皮细胞缺氧复氧后细胞凋亡和坏死。     

大鼠急性肾功能衰竭时肾小管上皮细胞凋亡及其意义

目的探讨肾小管上皮细胞凋亡在急性肾功能衰竭（ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ,ＡＲＦ）中的意义。方法以体积分数为５０％的甘油分别按５ｍｌ／ｋｇ和１０ｍｌ／ｋｇ的剂量注射于Ｗｉｓｔａｒ大鼠后肢肌肉,造成不同程度的ＡＲＦ,在注射后１,３,６,１２,２４,４８,９６ｈ测定肾功能,并取肾脏分别以原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ）、流式细胞仪（ＦＣＭ）及瑞氏染色等检测肾小管上皮细胞的凋亡。结果甘油注射后有肌     

急性肾功能衰竭时肾小管上皮细胞bcl-2表达的意义

目的 探讨急性肾功能衰竭（acute renal failure,ARF)中肾小管上皮细胞bcl-2表达与细胞凋亡的关系及其意义。方法 50％甘油分别按5ml/kg、10ml/kg注射于Wistar大鼠后肢肌肉,造成不同程度的ARF,随后在1、6、12、24、48、96小时测定肾功能,并以免疫组化法检测肾小管上皮细胞bcl-2表达,以TUNEL、FCM及瑞氏染色法检测肾小管上皮 细胞的凋亡。结果 甘油注射后肾小管上皮细胞bcl-2表达上升,与凋 亡的发生呈现出相似的剂量及时间依赖性,且区域相近,均以外髓及远端小管为主。结论 ARF中,肾小管上皮细胞bcl-2表达与凋亡密切相关,是创伤后机体启动的重要的抗损伤机制。     

AIF促进缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞凋亡的研究

目的 探讨凋亡诱导因子(AIF)对缺氧/复氧致肥大心肌细胞凋亡的影响及其意义.方法 分离培养新生昆明系小鼠心肌细胞,应用血管紧张素Ⅱ(0.1μmol/L培养12h)诱导心肌细胞肥大并建立缺氧/复氧模型以模拟缺血/再灌注损伤.实验共分设7组:肥大对照组(HC组)、缺氧8h组(H8h组)、缺氧12h组(H12h组)、缺氧8h/复氧4h组(H8h/R组)、缺氧12h/复氧4h组(H12h/R组)、缺氧12h+siRNA基凶转染组(H12h+siRNA组)、缺氧12h/复氧4h+siRNA基因转染组(H12h/R+siRNA组).AIF小干扰RNA(siRNA)转染心肌细胞后分别采用RT-PCR、Western blotting、Hoechst 33258染色法检测AIF mRNA、蛋白及细胞凋亡率.结果 H8h组、H12h组AIFmRNA(分别为0.52±0.04、0.85±0.10)均较HC组(0.29±0.08)显著升高(P<0.05);H8h组、H12h组蛋白表达水平(分别为2.07±0.15、3.12±0.19)较HC组(1.00±0.04)显著升高(P<0.05),且H12组AIF mRNA、蛋白表达水平均高于H8h组(P<0.05).与单纯缺氧组比较,缺氧后给予复氧刺激,H8h/R组和H12h/R组AIF mRNA(分别为1.09±0.07、1.41±0.12)及蛋白表达水平(分别为4.57±0.25、5.71±0.27)均较单纯缺氧时对应时间组显著升高(P<0.05).H12h+siRNA组可显著抑制肥大心肌细胞AIF的表达,其细胞凋亡率(13.40%±1.53%)与H12h组(12.90%±1.55%)比较无显著差异(P>0.05);H12h/R+siR-NA组肥大细胞凋亡率(24.90%±3.90%)显著高于H12h/R组(14.50%±1.32%,P<0.05).结论 AIF siRNA转染显著减轻缺氧/复氧时肥大心肌细胞凋亡程度,提示AIF促进缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞凋亡.     

脂联素对氯化钴诱导肾小管上皮细胞凋亡及炎症反应影响研究

目的 探讨脂联素对氯化钴诱导的肾小管上皮细胞凋亡及炎症反应的影响.方法 将人肾小管上皮细胞株HK-2细胞分入4组:正常对照组,用DME/F-12培养液培养细胞24 h;氯化钴诱导缺氧模型组,用含600.0μM氯化钴的培养液培养细胞24 h;单独脂联素处理组,用含2.5μg/ml脂联素的培养液培养细胞24 h;氯化钴+脂...     

红景天苷对心肌细胞缺氧/复氧的保护作用

目的观察红景天苷抗心肌缺氧/复氧损伤的保护作用,探讨红景天苷抗心肌缺氧可能的信号通路。方法原代培养的心肌细胞加入不同浓度的红景天苷缺氧24h,噻唑蓝法测定细胞增殖;原代培养的心肌细胞分为5组：正常对照组;缺氧/复氧组;缺氧/复氧加红景天苷100μg/ml组;缺氧/复氧加红景天苷100μg/ml再加细胞外调节激酶抑制剂20μg组;缺氧/复氧加细胞外调节激酶抑制剂20μg组。加药后先孵育60min,再缺氧培养4h,随后常氧培养2h。全自动生化分析仪测定心肌酶（乳酸脱氢酶、肌酸肌酶、谷草转氨酶）含量,Westernblot法检测细胞外信号调节激酶蛋白表达。结果红景天苷增加了缺氧/复氧损伤心肌细胞的活力,降低了心肌细胞乳酸脱氢酶和肌酸激酶的渗漏,使磷酸化细胞外信号调节激酶蛋白表达水平明显降低。结论红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞损伤有保护作用,此作用可能通过细胞外信号调节激酶信号通路发挥作用。     

体外缺氧／复氧对星形胶质细胞AQP4表达的影响及葛根素干预的实验研究

目的观察缺氧,复氧条件下星形胶质细胞形态和AQP4mRNA的表达变化以及葛根素对其表达变化的影响,探讨脑缺血再灌注损伤与AQP4的关系以及葛根索的干预作用。方法原代培养星形胶质细胞,用5％CO2＋95％N2混合气体造成缺氧．以LDH漏出率及M1Tr降解率作为细胞受损指标,应用RT-PCR技术检验星形胶质细胞缺氧／复氧各个时间点AQP4mRNA的表达变化及葛根素的干预效果。结果体外培养的星形胶质细胞在缺氧环境下损伤不明显,随着复氧时间的延长细胞损害加重。AQP4mRNA在缺氧时表达与正常对照组无明显差异。复氧后表达升高并随时间延长呈增高趋势（P〈0．05）。葛根素干预组AQP4mRNA表达丰度与缺氧,复氧组无明显差异（P〉0．05）。结论星形胶质细胞AQP4mRNA表达变化与细胞损伤有明显的相关性,葛根素对星形胶质细胞损伤的保护作用不是通过改变AQP4的表达来实现的。     

转化生长因子β1对人肾小管上皮细胞表达桩蛋白的影响

目的探讨重组人类转化生长因子β1（rhTGF-β1）对人近端肾小管上皮细胞（HKC）桩蛋白（Pax）表达时相的影响。方法将体外培养的HKC随机分为4组。对照组（C组）：无血清培养基（FSM）培养;rhTGF-β1培养组（T1、T2、T3组）：分别用含10ng／ml TGF-β1的FSM培养,取不同时相点（T1组24h,T2组48h,T3组72h）终止培养。MTT法检测rhTGF-β1诱导HKC增殖的时效关系,RT-PCR检测HKC的Pax mRNA表达,免疫组化和Western blot检测Pax蛋白的表达。结果C组可检测到PaxmRNA和蛋白表达;Pax mRNA和蛋白表达T组明显高于C组,且T2、T3组明显高于T1组（P〈0．01）。结论TGF-β1诱导HKC合成Pax具有时间依赖性。     

紫芪方对缺氧复氧所致大鼠小肠上皮细胞损伤的保护作用

目的观察缺氧复氧对大鼠小肠上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）-6培养液中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量及细胞内Ca^2＋浓度和线粒体膜电位的影响，探讨复方中药-紫芪方对IEC-6肠上皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制。方法复制IEC-6细胞缺氧复氧损伤模型，采用紫外分光法测定缺氧复氧后及紫芪方血清治疗后细胞培养液中SOD活性及MDA含量；采用激光共聚焦显微镜测定细胞Ca^2＋浓度和线粒体膜电位变化。结果细胞缺氧复氧损伤后，可导致细胞培养液中SOD活性显著降低、MDA含量显著升高、线粒体膜电位明显降低及细胞内Ca^2＋浓度明显升高（P〈0．01）。紫芪方药物血清治疗后，可提高细胞培养液中SOD活性并降低其MDA含量，同时稳定了线粒体膜电位并降低细胞内Ca^2＋浓度（P〈0．05）。结论缺氧复氧可导致IEC-6肠上皮细胞损伤；紫芪方血清对IEC-6小肠上皮细胞缺氧复氧损伤具有显著的保护作用。     

脂肪间充质干细胞分化为肾小管上皮细胞的实验研究

目的 探讨脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMCSs)是否能分化为肾小管上皮细胞,用于急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的治疗.方法 体外分离和培养ADMSCs,用一种携带有荧光素酶和红色荧光蛋白(fluc-mrfp)报告基因的慢病毒转染ADMSCs;构建SD大鼠缺血再灌注诱导的AKI模型,将病毒转染ADMSCs直接从肾实质注射移植2×106细胞量.使用生物发光成像仪(bioluminescence imaging,BLI)示踪移植后的ADMSCs在大鼠体内的分布;免疫荧光染色法检测ADMSCs在体内的分化.结果 ADMSCs高表达CD29、CD90,不表达CD31、CD45、CD34;慢病毒转染后的ADMSCs稳定表达fluc和mrfp报告基因.体内ADMSCs移植后,BLI可以检测到荧光信号一直持续到第14天;免疫荧光结果进一步证实移植的ADMSCs可能分化为肾小管上皮细胞.结论 ADMSCs在体内可以分化为肾小管上皮细胞,为进一步研究ADMSCs治疗AKI提供实验基础.     

Wnt阻滞剂Dickkopf-1对肾小管上皮细胞转分化的抑制作用

目的 研究Wnt阻滞剂Dickkopf-1 (Dkk-1)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响.方法 体外培养人近端肾小管上皮细胞(HKC),收集后分3组:对照组细胞以含10％胎牛血清的培养基常规培养,TGF-β1组在常规培养基中加入TGF-β1(终浓度20ng/ml),TGF-β1+Dkk-1组同时加入TGF-β1(终浓度20ng/ml)和Dkk-1(终浓度100ng/ml).培养48h后在倒置相差显微镜下进行形态观察,分别采用RT-PCR和Western blotting检测Wnt4、β-catenin、E-cadherin、α-SMA mRNA及蛋白表达情况,细胞免疫荧光染色观察E-cadherin和α-SMA的表达.结果与对照组比较,TGF-β1组和TGF-β1+Dkk-1组Wnt4 mRNA和蛋白表达水平均显著增高(P＜0.05),后两组间差异无统计学意义(P＞0.05).β-catenin mRNA表达在各组之间差异无统计学意义(P＞0.05).β-catenin蛋白在对照组呈低表达,TGF-β1组表达明显上调,TGF-β1+Dkk-1组较TGF-β1组表达下调(P＜0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).E-cadherin mRNA和蛋白在对照组呈高表达,TGF-β1组表达明显降低,TGF-β1+Dkk-1组较TGF-β1组表达显著增高(P＜0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).α -SMA mRNA和蛋白表达在对照组和TGF-β1+Dkk-1组的表达均较TGF-β1组明显降低(P＜0.05).细胞免疫荧光染色显示E-cadherin和α-SMA表达与RT-PCR和Western blotting检测结果一致.结论Wnt阻滞剂DickkopGl能抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化.     

siRNA干扰明胶酶对人肾小管细胞ICAM-1表达的影响

目的 利用小干扰RNA(siRNA)抑制人肾小管上皮细胞(HKC)的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9,即明胶酶A和B的表达,观察其对胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响.方法 培养人肾小管上皮细胞,以100nmol/L佛波醇酯(PMA)刺激18h,脂质体转染抑制MMP-2或MMP-9表达的siRNA或无关siRNA.提取细胞总RNA或胞浆蛋白,利用Real-Time PCR、Western blot或免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术检测MMP-2、MMP-9或ICAM-1的表达情况.结果 特异性的siRNA能有效抑制HKC中MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白表达;免疫荧光结果显示经PMA刺激后HKC的ICAM-1表达上调,同时MMP-9-siRNA转染组人肾小管细胞的ICAM-1蛋白表达水比其他实验组高(P＜0.05).结论 抑制肾小管上皮细胞MMP-9的表达可使ICAM-1表达上调,提示除了细胞外基质降解途径外,MMP-9还可通过炎症途径影响肾脏纤维化进程.     

血小板反应蛋白1对肾小管上皮细胞VEGF表达的影响

目的　探讨血小板反应蛋白1(TSP-1)对肾小管上皮细胞(HKCs)表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法　实验 分4组:对照组(C组)用无血清培养基(FSM)培养人HKCs;转化生长因子β1(TGF-β1)组(T组)用含TGF-β120ng/ml的FSM培养 HKCs;反义寡核苷酸组(TA组)在T组基础上加TSP- 1反义寡核苷酸;错义寡核苷酸组(TS组)在T组基础上加TSP -1错义寡核苷 酸。上述各组均培养72h后,用免疫细胞化学及RT-PCR方法检测TSP-1和VEGF及它们的mRNA表达的变化。结果　T组与C 组比较,TSP 1表达显著增高(P<0.01),VEGF表达显著下降(P<0.01);TA组阻断TSP-1表达后,与T组比较VEGF表达显著增 加(P<0.01)。结论　TGF-β1能诱导HKCs表达TSP-1、SP-1对VEGF的表达有抑制作用。     

激活素A刺激肾小管上皮细胞转分化的研究

目的研究激活素A对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法取人肾小管上皮细胞株进行体外培养,分为ACT—A组（含不同浓度激活素A）、FS组（含不同浓度卯泡抑素）、ACT—A＋Fs组（含30ng／mlACT＋不同浓度卵泡抑素）和对照组（含无血清培养基及0ng／mlACT—A和0ng／mlFS）,应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白（TGF—β）的表达,以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果与对照组和卵泡抑素组相比,激活素组。肾小管—巳皮细胞表达的TGF-β蛋白显著增多（P〈0．05）。结论激活素A能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化,激活素A可能在肾小管问质纤维化中起重要作用。     

Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞表达细胞外基质成分的影响

目的观察Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞(HKC)表达细胞外基质成分的影响,探讨Cyr61在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)发病中的作用及机制。方法RT PCR扩增Cyr61全长基因,构建pcDNA3.1+Cyr61重组质粒,转染HKC细胞。经RT PCR、Westernblot鉴定转染细胞系Cyr61基因的整合及表达。荧光定量PCR检测空白HKC、空质粒pcDNA3.1转染的HKC、Cyr61转染的HKC和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61、I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白的基因表达。结果构建了pcDNA3.1+Cyr61重组质粒并转染HKC细胞。Cyr61基因转染组和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61蛋白表达显著高于空白HKC组,Cyr61基因转染组的I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白mRNA表达都明显增高,且Ⅳ型胶原的基因表达增高程度远大于Ⅰ型(P<0.01)。但Cyr61基因转染组上述细胞外基质成分的表达仍显著低于囊肿衬里上皮细胞(P<0.01)。结论过表达Cyr61的HKC表达细胞外基质成分明显增强,尤以Ⅳ型胶原为著。过表达的Cyr61可能通过调节细胞外基质成分,促进细胞外基质重构,参与ADPKD囊肿的形成和发展。