一个定位于 7q31 32的鼻咽癌负相关新基因的初步研究

目的：克隆染色体7q31-32区域D7S495附近鼻咽癌相关的候选抑瘤基因,并研究其在鼻咽癌发生发展中的作用。方法：应用定位－候选克隆策略结合生物信息学手段筛选鼻咽癌负相关的EST（Expressed Sequence Tags)cDNA克隆测序和5‘RACE扩增获取候选EST的cDNA序列。Northern杂交和RT－PCR检测其组织表达谱及其在正常人胚鼻咽上皮与鼻咽癌细胞株和活检组织中的表达差异。Southern杂交和甲基化分析表达差异的机制。结果：克隆到一个位于7q31-32的与鼻咽癌负相关的新基因（GenBank登录号：AF196976,命名为NAG－14）,该基因编码649AA,含有LRR和IgC2结构域。Multiple Tissue Northern(MTN^TM)Blot杂交结果显示该基因在脑组织中表达较强,而在心、肝、肾、肺、脾、骨骼肌和胎盘等多种组织中检测不到表达。RT－PCR检测发现其在鼻咽癌细胞株和75％活检组织表达缺失或下调,Southern和甲基化分析表明其在鼻咽癌细胞株中某些位点发生甲基化修饰,鼻咽癌活检组织中存在遗传物质丢失,Southern和甲基化分析表明其在鼻咽癌细胞株中某些位点发生甲基化修饰,鼻咽癌活检组织中存在遗传物质丢失。结论：NAG14可能是定位于7q31-32的一个与鼻咽癌相关的抑瘤基因候选者。     

肝癌相关新基因HC6的全长cDNA克隆及分析

目的：染色体17p13.3区域内多态性位点D17S926是肝细胞肝癌（HCC）杂合性缺失热点,PAC579克隆含有D17S926位点,本实验目的在于从PAC579克隆中寻找与肝癌相关的表达序列（ESTs),对有意义的EST片段克隆其全长cDNA。方法：根据PAC579克隆中现有的9个代表新基因的 EST序列设计引物,对正常人肝cDNA文库作多聚酶链式反应（PCR）扩增检测,确定在肝组织中表达的EST,然后采用Southern杂交检测肝组织中表达的EST在27对肝癌和癌旁标本中杂合性生缺失（LOH）频率,选择缺失频率最高的EST克隆其全长cDNA,Nothern杂交验证后测序并作进一步分析。结果：PAC579现有9个代表新基因的EST中有3个在肝组织中表达,其中EST6有肝癌中LOH频率高达54．6％（6／11）,通过PACE－PCR方法,得到约1．8kb全长cDNA克隆,与Northern杂交结果一致,结构及同源性分析显示该基因是一新基因,编码一个包含134个氨基酸,分子量约为14．7kD的蛋白质,另外发现碱基序列313－592属于ALu同源序列,重新命名为肝癌相关基因6（HC6）。结论：通过定位克隆方法从肝癌杂合性缺失热点得到一个新基因HC6,该基因与肝癌的关系有待进一步研究。     

NAG14基因结构域蛋白的原核表达

基因组测序完成在即 , 运用已有的基因数据库 , 人们已经克隆了大量与人类重大疾病和肿瘤 相关的基因 . 结构基因组研究的深入 , 要求进一步分析新克隆基因的功能以及其结构与功能 之间的关系 . 我们应用定位-候选克隆策略结合生物信息学手段筛选与鼻咽癌负相关的 EST(Expressed Sequence Tags), cDNA克隆测序和 5′ RACE扩增获取候选 EST的 cDNA序列 , 已 克隆到一个新基因 NAG14 (GenBank登录号 : AF196976), 该基因在鼻咽癌细胞株 HNE1和 75% 活 检组织表达缺失或下调 [1]. 结构域是蛋白质在一级结构和三级结构之间的结构单位 , 也是生 物大分子生物功能的结构单位 [2]. 通过对蛋白质结构域的分析 , 并分离结构域 , 对分离的结 构域的结构和功能进行研究 , 可以对蛋白质功能有一个更为深入的结构层次的了解 . 为了解 NAG14基因所编码蛋白质的功能 , 我们用多聚酶链式反应 (PCR)方法分离出 NAG14基因的亮氨酸 重复区 ( leucine repeat pegion, LRR) 结构和 IgC2 结构域蛋白编码区序列 , 构建 LRR结构 域和 IgC2结构域的原核表达载体 , 在大肠杆菌中诱导这两个结构域蛋白的表达 , 为进一步制 备抗 NAG14基因蛋白的多克隆抗体和 NAG14基因功能研究打下基础 .     

肺癌相关基因HLCDG1的克隆和表达分析

背景与目的：比较基因组杂交和微卫星多态性位点全基因组扫描结果显示肺癌患者在染色体3p、5q、6q、9p、10q、llp、13q、17p、19p等区域存在高频率的杂合性缺失,提示可能有多个未知的易感基因或抑癌基因与肺癌的发生、发展相关。本研究选用在mRNA差异显示研究中获得的在肺癌组织中表达下调且代表新基因的表达序列标签(expressed sequence tag,EST)LXDDl为进一步研究对象,克隆其全长cDNA。方法：采用Northern杂交验证LXDDl在肺癌中的表达差异。并用MTN(Multiple Tissue Northern Blots^TM)膜检测其在正常组织中的表达及其所代表基因的转录本大小;克隆其全长cDNA,并利用生物信息学对该序列进行初步分析;用差异RT-PCR检测新基因在肺癌组织、配对癌旁非癌组织、肺癌细胞系和其它肿瘤细胞系中的表达。结果：成功地克隆了一个在肺癌中表达下调的新基因。HLCDGl(human lung carcinoma deleted gene 1),GenBank登录号为AF447582,全长cDNA为3．113kb,预测其开放阅读框编码一个含166个氨基酸的跨膜蛋白质。通过电子-聚合酶链反应(electric-polymerase chain reaction,e-PCR)将该基因定位于5q33。结论：HLCDGl基因是一个在肺癌中表达下调的新基因。这提示HLCDGl可能与肺癌的发生、发展相关。     

STGC3新基因的克隆及功能初步分析

背景与目的：研究显示,染色体3p21是鼻咽癌高频率杂合性丢失位点,本研究在对3p21区域与鼻咽癌相关的表达序列标签(expressed sequencetag,EST)筛选的基础之上,进行鼻咽癌相关新基因的克隆和功能研究。方法：采用cDNA克隆质粒测序及RAcE方法,获取新基因全长cDNA。利用因特网上核酸、蛋白质数据库及蛋白质分析软件进行生物信息学分析。通过构建pEGIFP-C2／STGC3绿色荧光表达载体,与脂质体共转染COS7、CNE2细胞,进行基因表达蛋白质定位分析。用Northern blot法检测STGC3在人其他正常组织及肿瘤细胞系表达状况。结果：在3p21区域获得一个全长为1271bp的cDNA新序列,生物信息学分析与已知基因无明显同源性,属于一个新基因,编码146个氨基酸,定位于染色体3p21,被命名为STGC3(GenBank登录号：AY078383)。蛋白质定位分析显示,STGC3融合蛋白存在于细胞浆及细胞核内;MTE^TM Array2多组织膜Northem blot显示该基因在人正常组织及肿瘤细胞均有表达,并在淋巴瘤等多种肿瘤细胞株中阳性杂交信号弱。结论：STGC3属于一个新基因,其表达的蛋白质存在于细胞浆及细胞核内。在鼻咽癌及多种肿瘤细胞株表达下调。     

鼻咽癌相关基因NAG4编码蛋白的表达模式

目的：明确人鼻咽癌相关基因NAG4编码产物的特性和活细胞内定位,了解其与癌变的关系。方法：构建了绿色荧光蛋白GFP与NAG4融合基因的真核表达载体,通过脂质体倡导分别转染非洲绿猴肾永生化细胞系COS7、人宫颈癌细胞系HeLa、人鼻咽癌细胞系HNE1以及原代培养正常鼻咽上皮PNNE,瞬时表达后荧光显微镜观察NAG4编码蛋白的活细胞内定位及其在鼻咽癌中改变。结果：NAG4基因编码产物在COS7细胞的胞浆和胞核内可见表达,而在HeLa细胞中仅在细胞浆存在;有30％的鼻咽癌细胞仅分布在胞浆,而在所有的正常鼻咽上皮细胞胞核和胞浆均有表达。结论：NAG4基因编码核转录蛋白在细胞恶变过程中可能有细胞浆到细胞核的移位障碍。     

喉部相关基因LCRG1的鉴定和功能初步研究

喉癌是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤。选用在mRNA差异显示研究中获得的喉癌组织中表达显著下调且代表新基因的EST之一（AF10056）,设计引物进行cDNA文库筛选,得到一全长为3448bp的cDNA序列,其开放读码框编码288个氨基酸,与已知蛋白无明显同源性,属一新发现的基因,GenBank接受号为AF268387。与GenBank数据库匹配分析,发现该基因包含6个外显子,基因组DNA跨越60多kb, 定位于染色体17q12-21.1上,为喉癌等许多肿瘤的高频杂合性质丢失区域。MTN膜杂交显示该基因在多组织中表达。差异RT－PCR显示有40A％（12／30）的喉癌组织表达下调,RT－PCR显示有54．5％（6／11）其他肿瘤细胞系表达缺失。通过GFP荧光定位的方法,发现该基因编码的蛋白定位在核内。把该基因命名为喉癌相关基因（LaryngeaI Carcinonm Related Gene 1,LCRG1)。将LCRG1cDNA导入到此基因不表达的喉癌细胞系Hep-2中,观察到明显的生长抑制;抑制Hep-2细胞的停泊非依赖性生长和抑制裸鼠致瘤性。上述结果提示：喉癌相关基因LCRG1与喉癌的发生发展密切相关。     

人支气管上皮细胞恶性转化相关基因的克隆

[目的]根据克隆的大鼠气管上皮细胞恶性转化EST片段（GenBane Accession Number AF011363)克隆相应的人全长基因并探索其功能。[方法]根据大鼠EST序列进行生物素探针标记,cDNA文库筛选,cDNA快速终扩增延伸目的基因直到获得全长序列。[结果]HRNT－1全长cDNA 4256bp,开放阅读框架2760bp,位于254bp-3016bp之间,编码区内含有9个TRP序列;位于人类染色体Xq13;cDNA序列收录于GenBank中（Accession Number AF223393).HRNT-1在人支气管上皮恶性转化细胞以及肺癌细胞中具有较高表达。[结论]HRNT－10为一功能基因,其高表达与上支气管上皮细胞恶性转化有关。     

细胞色素P450酶系在人鼻咽癌及鼻咽非癌组织中的表达

背景与目的：鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的发生与环境及遗传因素密切相关。环境中各种前致癌物需经代谢酶包括细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)的活化才具有致癌作用。本研究拟检测鼻咽癌及鼻咽非癌组织中的CYP450基因表达,以了解与鼻咽部组织中致癌物代谢活化有关的CYP450基因。方法：利用下述两种方法检测CYP450基因的表达：(1)混合7例鼻咽非癌组织的RNA构建cDNA文库,进行克隆测序及生物信息学分析;(2)逆转录14例鼻咽癌组织及8例鼻咽非癌组织的RNA为cDNA,以PCR扩增检测CYP450基因的表达。结果：cDNA文库检测的CYP450基因EST(Expressed SequenceTag)有CYP1Bl、CYP2F1、CYP2J2、CYP4B1、CYP4F12、CYP5A(TBXAS1)、CYP20A1和CYP51A1,其中CYP481的EST拷贝数最高,达16个拷叭;RT—PCR检测表达的CYP450基因有CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2A13、CYP286、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2El、CYP2Fl、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4B1,其中CYP1B1、CYP286、CYP481已经在文库检测有表达。总共有19个CYP450基因在鼻咽癌及鼻咽非癌组织表达,表达较高的基因有CYP1B1、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A5和CYP481。结论：鼻咽部组织表达CYP450基因种类较多,其中包括与前致癌物代谢活化相关的基因。     

应用EST策略鉴定人类新基因UBAP1的数字化差异表达图谱

背景与目的：UBAP1（ubiquitin associated protein1）基因是我们先前在人类染色体9p21-22鼻咽癌杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）高频区所获得的一个鼻咽癌相关新基因。进一步地,我们应用EST策略鉴定UBAP1基因在多种肿瘤组织中的差异表达谱。方法：采用基于生物信息学的电子杂交方法,即以UBAP1基因的全长cDNA为“探针”,利用计算机对人类表达序列标签（expressed sequence tag,EST）和Unigene等数据库中代表UBAP1的EST在各类肿瘤及相应正常组织cDNA文库中的分布进行综合分析,研究UBAP1基因的数字化差异表达图谱。同时采用差异RT－PCR方法对UBAP1在3种肿瘤活检组织中的差异表达进行验证。结果：电子杂交结果表明UBAP1基因不仅在42种人类正常组织中广泛表达,而且在11种肿瘤组织中存在可能的表达差异,尤其是在脑瘤、乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、睾丸癌和宫颈癌等肿瘤组织中表达显著下调（P＜0．05）,而在肾癌、胰腺癌中高表达（P＜0．05）。进一步采用差异RT－PCR方法发现UBAP1基因在64％的脑膜瘤和72％的结直肠癌活检组织中具有明显表达缺失／下调。结论：UBAP1基因有可能与多种肿瘤的发生发展密切相关,有必要深入研究UBAP1基因的表达异常参与肿瘤发生发展的分子机制。     

精细定位和克隆9p21-22区域内鼻咽癌候选抑瘤基因

目的：进一步精细限定鼻咽癌９p２１－２２区域等位基因杂合性丢失的频率和范围,筛选 和克隆其共同缺失区内鼻咽癌相关的候选抑瘤基因。方法：应用１１个定位于９p２１－２ ２区域的高密度微卫星位点,检测２５例低分化鼻咽癌患者的杂合笥技失,确定其共同缺失区;用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ筛出在鼻咽癌细胞株ＨＮＥ１和鼻咽癌活检组织中表达下调的、定位于共同缺失区内的３’末端ＥＳＴs（Ｅｘｐｒｉｓｓ Ｓｅｑｕｅｎｃ     

鼻咽癌相关基因NAG7对鼻咽癌细胞周期及凋亡的影响

背景与目的NAG7基因是我室克隆的鼻咽癌相关的肿瘤抑制候选基因,其功能与作用机制目前尚不清楚.研究鼻咽癌相关的潜在抑瘤基因NAG7对鼻咽癌细胞系(HNE1)细胞周期和细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法采用脂质体转染技术将NAG7基因导入HNE1细胞,建立稳定表达NAG7的细胞株,Northernblot分析转染细胞NAG7基因的表达,并采用流式细胞技术检测细胞周期、细胞周期素及细胞凋亡的改变,并用westernblot验证.结果NAG7基因重表达的HNE1细胞与空载体转染的HNE1和HNE1细胞相比G0/G1期细胞数增加(P<0.05),S期细胞数减少;细胞凋亡数目增加(P<0.05);细胞周期素A、D1、E表达明显降低(P<0.05),细胞周期素B1表达降低,Westernblot检测亦证实cyclinD1和cyclinE表达明显下调.结论NAG7的重表达导致细胞周期素表达下调,从而延缓细胞经G1期进入S周期及诱导细胞凋亡增加进而抑制NPC细胞的过度增殖.     

鼻咽癌表达下调基因NASG3′UTR可变剪接分析及其在多种肿瘤中的表达

背景与目的：采用抑制性消减杂交技术已分离获得了人鼻咽组织特异性基因NASG。本研究对人鼻咽组织特异性表达且在鼻咽癌表达下调的NASG基因3′非编码区(untranslated region,UTR)的可变剪接进行分析,并考察NASG基因在多种肿瘤组织中的表达。方法：在NASG基因3′UTR存在可变剪接部位的两端设计引物进行RT—PCR扩增,分离扩增产物并测序。用RT—PCR检测NASG基因在鼻咽癌中的表达,采用了肿瘤表达谱阵列(cancer profiling array)杂交分析NASG基因在多种肿瘤组织的表达状况。结果：NASG基因3′UTR存在3种剪接产物,NASG基因在71％的鼻咽癌活检组织中表达下调,25％的肺癌组织中表达上调．而在其他肿瘤及其配对的正常组织末见明显表达。结论：NASG基因3′UTR存在3种剪接产物,NASG基因的表达异常是鼻咽癌和肺癌发生、发展过程中重要的分子事件。     

p16基因的表达上调对鼻咽癌细胞恶性表型的影响：p16基因在鼻咽癌中的改变

探讨上调Ｐ１６基因的表达对鼻咽癌细胞恶性表型逆转的作用,为Ｐ１６基因在处鼻咽癌发病过程中具有一定的作用提供直接的语气方法,本文采用电穿孔的方法向Ｐ１６基因表达下调的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ１中导入全长野生型的Ｐ１６ｃＤＮＡ,通过Ｇ４１８筛选获得可以稳定传代的转当细胞系,对其中４个转染细胞系以ＰＣＲ和Ｎｏｒｈｅｒｎ杂交鉴定转染细胞系中外源Ｐ１６ｃＤＮＡ整合以及Ｐ１６基因表达的状况,并借助比较细胞倍增时间,     

BRD7交互作用蛋白基因BRD2、BRD3在鼻咽癌组织中的表达

背景与目的：BRD7基因是通过cDNA代表性差异分析获得的一个鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）密切相关基因。采用酵母双杂交技术,已从人胎脑的cDNA文库中筛选到了两个与BRD7蛋白存在交互作用且包含溴区结构域（bromodomain)的蛋白BRD2、BRD3。本研究的目的在于进一步证实BRD7蛋白与BRD2、BRD3蛋白之间的交互作用,探讨BRD2、BRD3基因在鼻咽癌中的表达和作用模式。方法：将BRD2、BRD3基因分别与BRD7基因共转化酵母Y187后将菌落影印到尼龙膜,X－Gal检测酵母中报告基因LacZ的表达,推断BRD2、BRD3与BRD7蛋白之间的交互作用。RT－PCR方法检测BRD2、BRD3基因在正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌活检组织中的差异表达以及在BRD7基因稳定转染的鼻咽癌细胞株（HNE1）中,BRD7基因的重表达对BRD2、BRD3基因表达水平的影响。结果：通过特异性酵母双杂交技术,发现酵母转化子的颜色呈蓝色,进一步证实BRD2、BRD3蛋白能分别与BRD7蛋白发生交互作用。RT－PCR结果显示,在鼻咽癌组织中,BRD2和BRD3基因表达下调或缺失;在BRD7基因稳定转染的HNE1细胞株中,随着BRD7基因表达的增强,BRD2、BRD3基因的表达存在明显的上调。结论：BRD7蛋白能分别与BRD2、BRD3蛋白发生交互作用,且在mRNA水平存在一定程度的协同表达作用,彼此可能形成二聚体或三聚体,共同参与鼻咽癌的发病过程。     

染色体3p14.2区域一个与鼻咽癌呈负相关EST的鉴定

目的：寻找染色体３Ｐ１４．２区域与鼻咽癌相关的表达序列标记,为筛选鼻咽癌候选基因打下基础。方法：运用生物信息学同生比较筛选ＥＳＴ的策略,结合Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和逆转录ＰＣＲ方法,检测３ｐ１４．２区域的相关ＥＳＴＳ在鼻咽癌和正常鼻咽组织中的表达。结果：在３Ｐ１４．２区域筛选到一个在鼻咽癌中低表达的ＥＳＴＷ２３３１２,与正常鼻咽上上以组织相比较,在鼻咽癌细胞株及１３例鼻咽癌活检组织中的５便其表达下调     

组织芯片技术检测人鼻咽癌组织及细胞株KIAA1173基因的表达

背景与目的:鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)致病的分子机制至今仍不清楚,已有研究表明,染色体3p21～22区域存在与鼻咽癌发生密切相关的抑癌基因。KIAA1173基因是定位于3p22.1的一个新的肿瘤相关基因,其与NPC发病的关系尚未见报道。本研究采用KIAA1173基因特异性原位杂交探针,检测其在NPC组织及细胞株中的表达,探讨KIAA1173基因与NPC发病的关系。方法:克隆KIAA1173基因片段(354bp),并制备cDNA探针;采用组织芯片技术,通过原位杂交检测73例鼻咽部不同组织标本(41例NPC、18例鼻咽非典型增生上皮、14例正常鼻咽粘膜上皮)和6种NPC细胞株(CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、6-10B、5-8F)中KIAA1173基因mRNA的表达情况。结果:KIAA1173基因在NPC细胞、非典型增生上皮和正常鼻咽粘膜上皮的阳性率分别为21.9%(9/41)、83.3%(15/18)、92.8%(13/14),而6种NPC细胞株均未见表达;在正常鼻咽粘膜上皮和非典型增生上皮中强阳性率分别是64.3%(9/14)和38.9%(7/18),而NPC中无强阳性,在鼻咽部不同上皮组织中的表达差异有显著性(P<0.001);在38例伴有淋巴细胞浸润的NPC组织中,癌细胞与浸润淋巴细胞之间KIAA1173基因表达有显著性差异(P=0.026),并且呈明显负相关(κ=-0.337,P=0.020)。结论:KIAA1173基因在鼻咽部不同组织中表达不同,正常鼻咽上皮强表达,而NPC细胞中低表达甚至不表达,提示该基因可能参与NPC演变的过程。     

细胞角蛋白基因13在鼻咽癌中的作用研究

目的 研究细胞角蛋白基因１３（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １３,ＣＫ１３）在人鼻咽癌组织中的表达,并对其甲基化程度进行了检测。方法 应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测３２例鼻咽癌活检组织和８例慢性鼻咽炎组织中ＣＫ１３的表达情况。同时运用甲基敏感的限制性内切酶ＨｐａⅡ和ＭｓｐⅠ,结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,对鼻咽癌细胞 ＨＮＥ１及正常人上皮ＣＫ１３基因的甲基化状态进行检测。     

3p213区域鼻咽癌相关基因--BLU的抑癌功能

背景与目的：染色体3p21.3区域的杂合性丢失是鼻咽癌细胞中高发和早期的细胞遗传学变异,提示缺失区域内可能存在与鼻咽癌发生相关的抑癌基因。BLU基因定位于3p21.3,蛋白质结构中含有MYND功能域。已有研究表明,BLU基因在鼻咽癌细胞中发生高频率的启动子甲基化和表达缺失。本研究构建了野生型BLU基因和其突变体的表达载体,分析BLU基因对鼻咽癌细胞恶性增殖的可能抑制作用。方法：用RT－PCR方法钓取BLU基因全长cDNA;用定点突变技术分别构建缺失MYND结构域的突变体、携带Ser402Phe点突变及缺失第405位Cys和第406位Ser的突变体、以及携带Gly160Arg点突变的BLU基因突变体的表达载体。将野生型BLU基因和MYND缺失型突变体转染鼻咽癌细胞CNE1和CNE2,用TUNEL方法检测、观察细胞凋亡情况;通过细胞计数和克隆形成实验分析稳定转染细胞的生长特性;分析稳定转染BLU基因的载体对CNE2细胞裸鼠致瘤性的影响。结果：瞬时转染野生型或MYND缺失突变型BLU基因不能诱导CNE2细胞凋亡;外源表达BLU基因对CNE2的细胞凋亡以及对CNE1、CNE2的细胞增殖和克隆形成能力均无明显影响;BLU基因对CNE2细胞的裸鼠成瘤能力也没有明显抑制作用。结论：尽管BLU基因在鼻咽癌中发生高频率变异,但其对鼻咽癌细胞的恶性增殖并没有明显抑制作用,因此该基因是否是抑癌基因,以及其在鼻咽癌发生中的作用机制和功能仍有待进一步探讨。