超声引导下瘤体内注入超声造影剂和P53基因治疗大鼠肝癌的初步研究

目的　探讨超声引导下将超声造影剂和人野生型 p5 3基因直接注入瘤体内对大鼠肝癌基因表达的影响。方法　采用免疫抑制法建立大鼠原位肝癌模型。 2 4只实验Wistar大鼠随机分成 4组。第 1组 :超声引导下将基因直接注入瘤体内并不用超声照射 ;第 2组 :注入基因后用超声照射瘤体 ;第 3组 :注入造影剂和p5 3基因后不行超声照射 ;第 4组 :用超声照射注入造影剂和基因的瘤体。 48h后用半定量逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)测定肝癌细胞内 p5 3mRNA的表达情况。 结果　超声引导下可准确地将基因注入肝癌内 ,4组肝癌细胞内均有 p5 3mRNA的表达 ,第 4组的表达量最高 ,明显高于其他三组 ( P <0 .0 0 1)。第 2组的基因表达量次之 ,高于另外两组 (P <0 .0 5 )。第 1、3组间在外源基因表达上的差异没有显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论　超声引导下瘤体内注射超声造影剂和p5 3基因后用超声照射 ,既可有效地控制肝癌基因治疗的靶向性 ,又能提高外源基因的表达量。     

超声造影剂无创性介导P53基因治疗肝癌的探讨

目的探讨超声破坏造影剂微气泡介导人野生型P53基因治疗大鼠肝癌的效果.方法将24只患有原位肝癌的Wistar大鼠随机分为4组:第1组:仅经股静脉注入P53质粒;第2组:输入P53质粒后,立刻用二次谐波超声经体表照射瘤区;第3组:注入造影剂和P53基因后不行超声照射;第4组:注入造影剂和基因后,立刻用超声照射瘤区. 48 h后用半定量RT-PCR法检测肝癌细胞、肺、肾细胞内P53 mRNA的相对表达量.结果 RT-PCR检测各实验组细胞内均有P53 mRNA的表达.第4组肝癌细胞内的基因表达量最高,与第1、2、3组间有显著性差异(P＜0.001);第2组与第1、3 组间有显著性差异(P＜0.05).超声照射的肝癌细胞内P53基因表达量增大,而未行超声照射的肝、肾细胞内则没有显著性变化.结论经外周静脉注入超声造影剂和治疗基因后用超声照射靶组织,是一种无创、高效、安全的靶向性基因导入技术.     

声学造影剂联合野生型P53质粒治疗大鼠肝癌的实验研究

目的　探讨超声破坏造影剂微气泡介导裸质粒DNA治疗大鼠肝癌的有效性。方法　将 2 4只肝癌模型Wistar大鼠分成 4组。第 1组 ,瘤体内直接注入造影剂和野生型P5 3质粒的混合物 ,立刻用超声照射 ;第2组 ,注射混合物后不用超声照射 ;第 3组 ,注入裸质粒后用超声照射瘤体 ;第 4组 ,仅注入裸质粒而不行超声照射。 2d后 ,用半定量逆转录 -聚合酶链式反应法检测野生型P5 3mRNA在肝癌组织中的表达。结果　第 1组的P5 3mRNA表达明显增强 ,高于其他 3组 (P <0 .0 0 1) ,是第 4组的 6.88倍。第 3组高于未行超声照射组 (P<0 .0 5 ) ,是第 4组的 2 .16倍。第 2组与第 4组在基因表达上的差异无显著性意义 (P >0 .0 5 )。结论　瘤体内直接注射造影剂和野生型P5 3质粒混合物后行超声照射 ,可明显增加裸质粒DNA的转录 ,是一种高效、安全的基因治疗方法。     

超声造影剂促进野生型p53基因转染抑制大鼠卵巢癌生长的实验研究

目的 探讨超声辐照造影剂微泡促进野生型p53基因转染进而抑制大鼠卵巢癌生长的有效性。方法构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，将40只卵巢癌荷瘤大鼠分成4组。第1组瘤体内注入造影剂微泡和野生型p53质粒混合物，并用超声辐照大鼠腹部瘤区；第2组注入裸质粒后予以超声辐照瘤体；第3组注射超声造影剂和基因混合物后无超声辐照；第4组仅注入裸质粒而无超声辐照。每组进行基因转染每周1次，共进行8次。2月后用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测野生型p53 mRNA在卵巢癌组织中的表达，Western Blot检测野生型p53基因蛋白表达。结果成功构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，埋线法建立卵巢癌动物模型；用超声波辐照微泡促进基因转染后见p53基因转录及表达。第1组p53 mRNA的表达明显增强，高于其他3组，约是第2组的2．65倍，第4组的5．95倍。第2组高于未行超声辐照组，是第4组的2．23倍。第3、4组基因表达差异无统计学意义；Western Blot分析示p53基因蛋白表达的差异模式基本同mRNA，即第1组p53 mRNA的表达增强，高于其他3组，约是第2组的1．75倍，第4组的3．13倍；第2组高于未行超声辐照组，是第4组的1．79倍；第3、4组基因表达差异无统计学意义。结论瘤体内注射造影剂微泡和野生型p53质粒混合物后行超声辐照，可明显增加质粒基因在癌瘤组织中的导人及表达，超声联合造影剂微泡可作为卵巢癌基因治疗中促进基因转移的辅助方法。     

超声造影剂SonoVue介导P53基因转染胰腺癌的实验研究

目的探讨超声造影剂SonoVue联合超声辐照介导野生型P53基因对裸鼠胰腺癌的转染作用。 方法构建野生型P53真核质粒表达载体pcDNA3.1＋/P53,建立裸鼠胰腺癌皮下模型。将60只荷瘤裸鼠分成4组,第1组瘤体内注入造影剂＋P53质粒,超声辐照瘤体;第2组注入P53质粒后超声辐照;第3组注射造影剂＋P53质粒;第4组注入P53质粒。利用RT-PCR、western blot、免疫组化检测P53基因在组织中的表达情况。 结果成功构建了P53真核质粒表达载体pcDNA3.1＋/P53及建立了胰腺癌动物模型;超声辐照微泡造影剂可促进P53基因在胰腺癌中的转染及表达。第1组P53的表达量明显高于其他3组（P〈0.05）,第2组基因表达高于第3、4组（P〈0.05）,第3、4组间基因表达差异无统计学意义（P〉0.05）。 结论造影剂联合超声辐照可明显增加P53基因在胰腺癌中的转染,可作为促进P53基因转染胰腺癌的辅助方法。     

超声造影剂及超声辐照对TIMP-1 siRNA在肝纤维化大鼠肝组织中表达的影响

目的观测超声造影剂及超声辐照对TIMP-1 siRNA质粒转染肝纤维化大鼠肝组织内TIMP-1基因表达的影响。 方法采用二甲基亚硝胺（DMN）方法建立大鼠肝纤维化模型，72只造模大鼠在第6周随机均分成3组，质粒组（P组）、质粒＋造影剂及超声照射组（P＋U组）、对照组。2d、6d及12d后各组分别随机取8只处死、取肝、肾、肺、脑、心肌组织快速冷冻切片，荧光显微镜下观察各组织内TIMP-1 siRNA荧光表达；FQ—PCR测定肝组织TIMP-1 mRNA表达。 结果2d后，P组肝、肾、肺、脑、心肌组织内均有少量TIMP-1 siRNA绿色荧光表达，组间无显著差异，P＞0．05；P＋U组肝组织内TIMP-1 siRNA荧光表达明显增强，较其它组织差异显著，P＜0．001。P组及P＋U组肝组织TIMP-1 mRNA表达量均较对照组明显降低，P＜0．001；P＋U组降低较P组显著，P＜0．001；P＋U组6d时TIMP-1 mRNA表达量最低，后依次为48h、12d。 结论TIMP-1 siRNA对肝纤维化大鼠TIMP-1基因表达抑制作用明显；超声造影剂及超声辐照能够明显增高基因转染效率，并有将基因载体靶向定位于肝组织释放的作用。     

超声微泡造影剂对心肌组织毛细血管通透性的影响实验研究

目的　研究超声破坏微泡造影剂对靶区内心肌组织毛细血管通透性的影响 ;探讨超声微泡造影剂增强基因转染的机制。方法　 2 4只健康雄性 Wistar大鼠 ,取 15只分为 3组 ,第 1组经静脉输入含有伊文思蓝 (Evans blue,EB)的微泡造影剂 ,并采用超声波在鼠胸壁辐照约 6 min破坏心肌组织内造影剂 ;第 2组采用超声照射 ,同时经静脉单纯输入 EB溶液 ;第 3组单纯经静脉输入 EB作为对照。照射完毕 2 h后放血处死大鼠 ,使用标准曲线和分光光度法测量各组大鼠心肌组织中 EB含量 (作为反映血管通透性的指标 )。另 9只大鼠随机分为 3组 ,每组 3只。第 1组经静脉输入微泡造影剂 ,并采用超声波在鼠胸壁辐照约 6 min破坏心肌组织内造影剂 ;第 2组单纯采用超声照射 ;第 3组不加任何处理 ,作为对照。照射完毕即刻处死大鼠 ,取心肌组织进行电镜观察毛细血管的改变。结果　采用超声照射 ,并经静脉输入微泡造影剂的大鼠 ,心肌组织中 EB含量为 (75 .33± 16 .80 )μg/ g,比单纯超声照射[(32 .2 1± 9.5 3)μg/ g]及心肌正常组织 EB含量 [(37.16± 7.98)μg/ g]明显增加 (P<0 .0 5 )。电镜结果显示超声破坏微泡后 ,能使毛细血管破裂 ,红细胞溢出于毛细血管外。结论　超声波触发破坏微泡造影剂后能使心肌组织毛细血管通透性增加 ,可     

经外周静脉超声造影对大鼠CBRH-7919肝癌的研究

【目的】用超声监测免疫抑制大鼠CBRH 7919肝癌模型的建立情况 ,并探讨大鼠肝癌的超声造影二维灰阶影像。【方法】经60 Co照射和氢化可的松联合免疫抑制建立了 17只大鼠肝癌模型。 2周后用超声观察肝内肿块的灰阶和彩色多普勒表现 ,并经股静脉通道注入超声造影剂“全氟显” ,观察肝内肿块的二维灰阶增强效果。【结果】超声检查发现大鼠肝内有肿块存在 ,肿块直径平均为 (1.0 2± 0 .15 )cm。二维灰阶造影增强发现肝内有异常的占位性病变 ,分为动脉相、门静脉相、毛细血管相和延迟血管相四个时相。【结论】超声检查可监测大鼠CBRH 7919肝细胞性肝癌模型的生长状况 ,超声造影可提供肿块血供及血流灌注的详细信息。     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的探讨超声破坏微泡介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移目的奠定基础。方法将30只Long-evans大鼠分为6组，第1组仅以0．5w／cm。的超声波辐照大鼠眼球，第2组于尾静脉输入适当剂量的微泡造影剂，并立即以相同能量的超声波辐照大鼠眼球，第3组于尾静脉输入质粒，第4组于尾静脉输入质粒，并以超声辐照大鼠眼球，第5组于尾静脉输入质粒与微泡，第6组尾静脉输入质粒、微泡，并用超声辐照眼球。转染2周后，在激光共聚焦显微镜下观察EGFP表达情况。结果超声微泡介导的EGFP质粒对大鼠视网膜的转染效率，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对大鼠视网膜脉络膜无明显损伤。结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高EGFP质粒在大鼠视网膜的转染效率。     

RNA干扰体外抑制肝癌细胞端粒逆转酶基因表达的研究

目的 利用小片段干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞内诱导RNA干扰(RNAi)，抑制端粒逆转录酶(hTERT)基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的试验研究。方法 构建针对hTERT基因的siRNA(siRNA-hTERT)，转导入肝癌细胞7721，在瘤细胞内诱导RNAi，采用流式细胞分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、免疫组化等技术检测siRNA处理前后细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 siRNA-hTERT对肝癌细胞生长抑制率达37．5％；细胞周期中S期细胞明显减少，G1／G0期细胞显著增加；hTERT基因的mRNA表达由99．4％下调到53．1％，其蛋白表达由86．3％下调到46．6％。结论 RNAi在体外明显抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

超声辐照携TIMP-1siRNA微泡对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨携TIMP-1 siRNA的造影剂微泡在超声辐照条件下对肝纤维化大鼠组织学改变的影响。方法二甲基亚硝胺建立肝纤维化模型，6周后分组并静脉质粒注射，2天后观察肝、肾、肺、脑、心肌组织内基因荧光表达；12天后检测肝组织内TIMP-1 mRNA、蛋白表达及胶原纤维变化。结果2天后，超声照射微泡组基因荧光表达明显增强，较其他组织差异显著，P〈0．001；12天后，其TIMP-1 mRNA及蛋白表达、胶原含量均较单质粒组及对照组减低，P〈0．001。结论超声辐照携TIMP-1 siRNA超声微泡有将目的基因定位释放作用，TIMP-1 siRNA转染肝纤维化大鼠可改善肝纤维化结构，为肝纤维化的基因治疗提供了新的思路及方法。     

超声辐照促纳米多聚体释放DNA的体内研究

目的 通过研究不同超声参数与绿色荧光蛋白表达之间的关系,探讨超声辐照促进绿色荧光蛋白基因(GFP)与雄激素受体抗体标记的PLGA纳米颗粒(NP-PLGA-GFP-AR)的体内降解与释放的作用.方法 建立人前列腺癌PC-3细胞裸鼠动物模型,将NP-PLGA-GFP-AR纳米粒注射于瘤内2 h后,对癌瘤使用不同强度和类型的超声进行局部辐照,通过激光共聚焦荧光显微镜观察GFP表达,从而评价转染效果.结果 粒径优选后的纳米粒能稳定转染GFP与雄激素受体抗体标记的DNA质粒,超声辐照组较非辐照组的GFP表达提前,占空比为50%的连续波超声较脉冲波超声对前列腺癌的转染效果好.结论 优化后的超声辐照可有效靶向增强体内DNA转染,局部超声辐照结合特异PLGA纳米粒能有效用于DNA靶向递送.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility and the efficacy of ultrasound in promoting PLGA nanoparticle-mediated gene transfection in vivo.Methods Prostate cancer cell line PC-3 was used to generate xenografts in nude mice for gene transfection experiment in vivo.GFP plasmid was encapsulated in PLGA-based nanoparticles.Nanoparticles were injected into tumors locally.Two hours later,xenografts were exposed to ultrasound.Xenograft tissues were harvested in different time points to assess the efficiency of gene expression with regard to different parameters of ultrasound. Results PLGA nanoparticle-encapsulated GFP plasmids were readily transfected to PC-3 cells in vivo.A large number of GFP expressing cells were observed after exposed to ultrasound with 1.0 MHz 50% duty factor continuous wave.In comparison,ultrasound exposure with 40% duty factor pulse wave in vivo had low efficacy in terms of GFP expression.No animal death was noticed due to ultrasound exposure.Conclusions Ultrasound exposure can enhance the release of plasmid DNA content delivered by PLGA nanoparticles in vivo,local exposure to ultrasound wave would be used in conjunction with PLGA nanoparticle-mediated targeted delivery to the tissue or organ of interest.     

超声微泡转染前列腺癌细胞的参数筛选

目的观察不同辐照参数下超声微泡对前列腺癌细胞生长及基因转染效率的影响。方法采用噻唑兰比色法检测单纯超声、单纯微泡、超声辐照微泡对前列腺癌细胞生存率的影响。荧光显微镜观察超声微泡介导的质粒为EGFP基因与HSV l-TK基因共表达载体。观察它对前列腺癌细胞PC-3转染后荧光表达情况,Westernblot检测EGFP蛋白的表达情况。结果 MTT显示超声强度为1.0W/cm2,频率为1MHz,辐照时间30s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;采用不同浓度的微泡对前列腺癌细胞PC-3作用24h后,各实验组细胞存活率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);当采用最适的超声辐照时间辐照微泡浓度为10、20、40、80μL时,超声+微泡(80μL)组细胞存活率低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而10、20、40μL组中细胞生长良好;转染EGFP后48h,在荧光显微镜观察对照组未见荧光表达,其他各组中均有荧光表达,并随着微泡剂量的增加,荧光表达量增多;Western blot检测显示各处理组中均有EGFP蛋白的表达,超声+微泡(20μL)+TK(1μg)组、超声+微泡(40μL)+TK(1μg)组的EGFP蛋白表达明显高于其他各组。结论在最适辐照参数下,超声微泡造影剂能够有效地促进TK基因的转染。     

超声作用下CTGF-siRNA对大鼠肝纤维化基因治疗的实验研究

目的探讨利用超声微泡造影剂介导携带结缔组织生长因子-小干扰RNA(CTGF-siRNA)真核表达质粒转染大鼠肝细胞的有效性。方法 (1)构建CTGF-siRNA真核表达质粒;(2)将40只实验大鼠随机分为7组:正常组,实验对照组,CTGF-siRNA质粒组,超声联合微泡组,超声联合微泡介导基因低、中、高剂量组;(3)建立肝纤维化模型,基因治疗4周后处死大鼠,超声及病理切片HE染色评价肝纤维化程度,masson染色观察胶原纤维含量,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达。结果 (1)CTGF-siRNA基因治疗后超声及病理切片显示干预组纤维化程度降低;(2)masson染色显示超声介导微泡基因组胶原纤维含量表达量随着剂量增高而降低(P<0.05);(3)RT-PCR显示超声介导微泡基因组CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达明显低于其他组,且随着质粒剂量增大而减少(P<0.05)。结论超声微泡作用下CTGF-siRNA基因能特异地作用于靶位点,有效抑制肝纤维化进程,提高对肝纤维化干预的特异度。