HLA—Cw基因测序分型的研究

目的建立HLA-Cw位点测序分型技术,以用于无关供/受者HLA-Cw基因配型等基础应用研究。方法对HLA-Cw位点的第2和第3外显子,设计、合成一对PCR引物和4条测序引物,探索最佳的PCR反应体系和扩增条件,采用PCR引物扩增HLA-Cw基因的第2、第3外显子和第2内含子,扩增产物经纯化后作为测序模板,进行4个测序反应,产物经酒精/EDTA/NaAc法纯化,用ABIPrismTM3100测序仪电泳检测,相关的分析软件分析HLA基因型。检测分型结果的可靠性采用基因型已知的U-CLA国际HLA室间质控的DNA样本进行验证。结果检测6例UCLA国际HLA室间质控的DNA样本,HLA-Cw等位基因型与UCLA公布的结果完全一致。结论本文的HLA-Cw基因测序分型方法准确、可靠,具有广泛的应用前景。     

一例供者携带的C* 03:100等位基因的测序分析

目的 检测与分析1例骨髓志愿捐献者携带的等位基因C* 03:100.方法 采用快速DNA提取试剂盒从全血样本中提取基因组DNA,经HLA-C基因商品化测序分型试剂盒扩增,纯化后的扩增产物作为模板由试剂盒配套的第2,3和4外显子正反向测序引物及自行研制的第5外显子正反向、第6外显子正向和第7外显子反向测序,经乙醇/醋酸钠/EDTA纯化的测序反应产物于ABI PrismTM 3730测序仪电泳检测.结果 将电泳后的数据导入Assign-SBT 3.5.1.45分析软件分析,分型结果为C*03:02:02,03:100.结论 临床移植配型HLA-C基因分型增加第5,6和7外显子区域的多态性检测可提高分型结果的准确性,对临床组织配型工作具有重要意义.     

DNA工作站在HLA测序分型中的应用

目的 建立从全血样本中高通量提取基因组DNA的方法,以应用于HLA常规测序分型.方法 采用DNA工作站及2 ml深孔板,从400份全血样本中提取基因组DNA.用紫外分光光度仪测定其浓度和A<,260>/A<,280>值,并采用琼脂糖电泳检测DNA的完整性.扩增产物经纯化后作为测序模板,产物经酒精/EDTA/NaOAc法纯化,用ABI Prism<'TM>3730测序仪电泳检测.相关的分析软件分析HLA基因型.结果 使用400μL全血中400份样本的DNA产量平均为(3.217±0.715)μg,A<,260>/A<,280>值平均为1.710±0.103;琼脂糖电泳表明DNA的分子量均大于15×10<'3>;HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1座位序列碱基峰高均在2000以上,测序评分在75分以上.48份HLA-A、B和DRB1基因型已知的室内质控样本,经本文的方法提取DNA并进行HLA基因分型,经盲检质控检测,所得到的结果与已知的HLA基因型相一致.结论 采用本方法所提取的DNA能稳定、可靠地应用于骨髓捐献者样本的HLA-A、B和DRB1座位测序分型,具有快速、高通量化的特点和广泛的应用前景.     

RSCA技术应用于HLA-A,B座位高分辨基因分型的研究

目的采用参比链介导的构象分析(referencestrandmediatedconformationanalysis,RSCA)技术,建立新型、可靠的HLAA、B高分辩基因分型方法,应用于HLA基因分型及供、受者组织配型。方法采用一对座位特异性引物,扩增HLAA、B基因的第2、3外显子和第2内含子。扩增产物与单链标记荧光物质的参比链按一定比例混合,经变性、退火反应及脱水处理后,在杂交产物中掺入分子量内参标准物,用ABI377型基因测序仪电泳检测。用ABIGeneScan3.1软件分析每一泳道内异源双链波峰的迁移值、峰高及峰面积值,RSCAHLATyper1.3软件分析HLA等位基因型。应用本方法,对第13届国际组织相容性协作组(IHW)送检的20份盲检样本,以及2份HLA等位基因型已知的质控样本进行了检测。结果2份质控DNA的检测结果,与已知的HLA基因型完全相符;20份盲检样本HLAA、B座位的检测结果,与IHW公布的结果完全相同,准确率达100%。结论RSCA为新型、高分辨水平的HLA基因分型方法,并且出现模棱两可结果的情况少,分型结果准确、可靠。     

PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的研究

目的 探讨PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的可能性.方法 采用本实验室建立的HLA-C基因测序分型方法 中的PCR扩增、测序反应和测序纯化等步骤,对96份标本特异性扩增HLA-C基因外显子1～4目的 序列片段约为2 000 bp,扩增产物分别采用OMEGA公司(瑞士)磁珠纯化法及USB公司(美国)的外切酶I...     

应用寡核苷酸芯片进行HLA-DQA1位点基因分型

为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HIA系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域，自行设计一套寡核苷酸分型探针；采用本实验室自建的方法，制成寡核苷酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号，确定HLA等位基因型；分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测。结果表明：100例样本芯片分型全部成功，其中50例标准DNA与其模板相符，另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符，其中2例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率95％。结论：研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。     

HLA-Cw基因常规检测区外第1、5、6、7外显子核苷酸序列测定的研究及临床应用

目的 研究中国人群HLA-Cw基因第1、5、6、7外显子的分子遗传多态性,探讨增加第1、5 6 7外显子核苷酸序列测定在临床组织配型工作中的重要性及意义.方法 应用PCR-SBT法,对324份样本的HLA-Cw基因第2、3、4外显子作常规测序分型.对检出的模棱两可结果,设计HLACw第1、5 6 7外显子序列测序引物并优化测序反应条件,增加第1、5、6、7外显子核苷酸序列分析.结果 对HLA-Cw基冈第2、3、4外显子常规检测,一次性获得等位基因前4位数分型结果 的样本占23.8%(77/324);出现模棱两可结果的样本数占76.2%(247/324),检出的模棱两可等位基因组合有73种;增加HLA-Cw基因的第1、5、6、7外显子多态性检测,可解决Cw* 030201/030202、030301/0320N、Cw* 040101/0409N/0430、Cw* 070201/0750、Cw* 0403/0409N/0430和Cw* 080101/0822等10种常见的模棱两可等位基因组合.结论 在临床HLA-Cw基因配型中增加第1、5、6、7外显子多态性检测,有助于解决测序分型中的模棱两可的结果 和提高HLA-Cw基因分型精确度,对临床组织配型工作具有重要意义.     

HLA-Cw基因常规检测区外第1、5、6、7外显子核苷酸序列测定的研究及临床应用

目的 研究中国人群HLA-Cw基因第1、5、6、7外显子的分子遗传多态性,探讨增加第1、5 6 7外显子核苷酸序列测定在临床组织配型工作中的重要性及意义.方法 应用PCR-SBT法,对324份样本的HLA-Cw基因第2、3、4外显子作常规测序分型.对检出的模棱两可结果,设计HLACw第1、5 6 7外显子序列测序引物并优化测序反应条件,增加第1、5、6、7外显子核苷酸序列分析.结果 对HLA-Cw基冈第2、3、4外显子常规检测,一次性获得等位基因前4位数分型结果 的样本占23.8%(77/324);出现模棱两可结果的样本数占76.2%(247/324),检出的模棱两可等位基因组合有73种;增加HLA-Cw基因的第1、5、6、7外显子多态性检测,可解决Cw* 030201/030202、030301/0320N、Cw* 040101/0409N/0430、Cw* 070201/0750、Cw* 0403/0409N/0430和Cw* 080101/0822等10种常见的模棱两可等位基因组合.结论 在临床HLA-Cw基因配型中增加第1、5、6、7外显子多态性检测,有助于解决测序分型中的模棱两可的结果 和提高HLA-Cw基因分型精确度,对临床组织配型工作具有重要意义.     

HLA-Cw基因常规检测区外第1、5、6、7外显子核苷酸序列测定的研究及临床应用

目的 研究中国人群HLA-Cw基因第1、5、6、7外显子的分子遗传多态性,探讨增加第1、5 6 7外显子核苷酸序列测定在临床组织配型工作中的重要性及意义.方法 应用PCR-SBT法,对324份样本的HLA-Cw基因第2、3、4外显子作常规测序分型.对检出的模棱两可结果,设计HLACw第1、5 6 7外显子序列测序引物并优化测序反应条件,增加第1、5、6、7外显子核苷酸序列分析.结果 对HLA-Cw基冈第2、3、4外显子常规检测,一次性获得等位基因前4位数分型结果 的样本占23.8%(77/324);出现模棱两可结果的样本数占76.2%(247/324),检出的模棱两可等位基因组合有73种;增加HLA-Cw基因的第1、5、6、7外显子多态性检测,可解决Cw* 030201/030202、030301/0320N、Cw* 040101/0409N/0430、Cw* 070201/0750、Cw* 0403/0409N/0430和Cw* 080101/0822等10种常见的模棱两可等位基因组合.结论 在临床HLA-Cw基因配型中增加第1、5、6、7外显子多态性检测,有助于解决测序分型中的模棱两可的结果 和提高HLA-Cw基因分型精确度,对临床组织配型工作具有重要意义.     

HLA-A新等位基因HLA-A~* 110106的核苷酸序列分析

目的研究HLA新的等位基因HLA-A* 110106的分子机制。方法采用商用DNA试剂盒抽提样本基因组DNA,利用HLA-A组特异性引物PCR扩增先证者HLA-A基因的第2、3外显子,经酶法纯化扩增产物后,用第2、3外显子双向测序引物进行测序分析。结果先证者有2个HLA-A等位基因,其中1个为HLA-A*0203,另1个HLA-A等位基因经HLA b last验证为新的等位基因,新的等位基因序列已递交Genbank(EF092416)。与最接近的HLA-A*110101等位基因序列相比,新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同,即第387位G→C,但未引起氨基酸的改变。结论该等位基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*110106。