壳聚糖-明胶多孔复合支架构建自体组织工程化软骨组织的实验研究

目的探讨壳聚糖一明胶多孔复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法消化分离猪耳廓软骨细胞,接种于自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上培养1周,将细胞一生物支架复合物种植于猪自体腹外侧壁皮下,第10、16周取材,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学对再生软骨组织进行评价。结果HE染色见10周时有软骨组织形成,所形成的软骨组织见软骨细胞均匀分布,包埋在软骨陷窝内,还可见未降解的支架材料。16周时软骨组织完成成熟,软骨细胞包埋在软骨陷窝内,支架材料完全降解,结构与正常软骨组织相似。Masson’s trichrome染色见所形成的软骨组织间质中都有被染成绿色的胶原分布。Vehoeff染色见16周时形成的软骨间质内含大量被染成蓝黑色弹性纤维。免疫组化证实形成的软骨组织有Ⅱ型胶原分布,生物化学证实所形成的软骨组织的蛋白聚糖含量与正常猪耳软骨的含量接近。结论利用自制壳聚糖一明胶多孔复合支架上可在具有免疫功能的自体动物内形成软骨组织,但形成的软骨不充分,壳聚糖一明胶多孔复合支架有以作为软骨组织工程支架的应用前景。     

自体脂肪源性间充质干细胞修复兔软骨缺损的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人转化生长因子β2(Ad-hTGF-β2)基因转染自体兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合聚乳酸(PLGA)/藻酸钙对关节软骨缺损的修复效果.方法 将20只新西兰大白兔制备双侧膝关节软骨缺损模型.体外培养扩增自体ADSCs,转染Ad-hTGF-β2后,种植于PLGA上,然后将细胞_支架复合物植入兔关节软骨缺损模型;缺损处植入单纯支架、缺损处不做任何处理者,作为对照组.分别于术后4、12及24周处死动物进行大体及组织学观察,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.结果 实验组修复区可见新生的陷窝状细胞形成,与周围结合紧密.对照组见大量成纤维细胞,未见软骨样陷窝细胞形成.Ⅱ型胶原染色实验组呈阳性,对照组无明显阳性可见.结论 Ad-hTGF-β2基因转染的白体ADSCs能够修复关节软骨缺损.     

博来霉素诱导硬皮病小鼠基础研究

目的：构建硬皮病小鼠动物模型。方法用100μg/0.1ml 博来霉素每天皮下注射6周龄 BALB/ c 雄性小鼠背部皮肤3周,造模组与空白和 PBS 两组为对照组,各组为10只。取注射局部皮肤进行 HE 染色和 Massion 染色,镜下观察和测定各组皮肤厚度、胶原纤维含量,新鲜皮肤组织测定羟脯氨酸和胶原含量。结果3周后造模组较对照组,皮肤增厚变硬,弹性降低,真皮层明显增厚,胶原纤维明显增粗、膨大,毛囊明显减少,炎性细胞浸润,胶原纤维、羟脯氨酸和胶原含量明显升高。结论符合硬皮病皮肤病理改变,构建硬皮病小鼠动物模型成功。     

恶性黑色素瘤淋巴道转移裸小鼠模型的建立

目的:建立恶性黑色素瘤淋巴道转移裸小鼠模型.方法:12只裸小鼠分为2组,每组6只.实验组通过裸小鼠角膜囊袋植入恶性黑色素瘤A375细胞建立恶性黑色素瘤淋巴道转移裸小鼠模型,对照组未植入瘤细胞.2周后取材,进行淋巴内皮细胞特异性抗体LYVE-1角膜全组织荧光染色,采用图像分析法测定角膜淋巴管总体面积,RT-PCR法检测角...     

种植自体尿路上皮细胞的包膜化输尿管组织工程支架的构建

目的探讨应用组织工程技术体外构建种植自体尿路上皮细胞的包膜化聚乳酸输尿管支架的可行性。方法将聚乳酸输
尿管支架于比格犬皮下包埋3周,在其表面诱导形成一层结缔组织薄膜,获得包膜化聚乳酸输尿管支架。经脱细胞处理后,将
体外扩增培养的自体尿路上皮细胞种植于包膜输尿管支架表面。采用常规HE染色组织切片、扫描电镜和免疫组化法对包膜输
尿管支架及尿路上皮附着情况进行观察;应用MTT比色法比较尿路上皮细胞在包膜化聚乳酸输尿管支架组和管状小肠粘膜下
基质组的生长差异。结果HE染色及Ⅷ因子免疫组化染色结果显示结缔组织层内含有大量毛细血管,但无明显局部炎症反应;
扫描电镜和免疫组化染色提示包膜含有丰富的胶原纤维构成、表面呈现三维立体结构,尿路上皮细胞能在支架包膜表面粘附,
形成连续的上皮层;MTT检测显示包膜化聚乳酸输尿管支架组和管状小肠粘膜下基质组组吸光光度值比较无明显差异（P>
0.05）,说明尿路上皮细胞在包膜化输尿管支架上能连续增殖。结论包膜化聚乳酸输尿管支架适合尿路上皮细胞黏附和增殖,
体外构建的包膜化组织工程输尿管有潜在的临床应用价值。
     

去细胞组织工程心脏瓣膜构建的实验研究

目的:探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法:测定瓣叶去细胞前、后的生物力学性能;观察去细胞瓣叶上内皮细胞生长情况。结果:瓣叶去细胞可获得完整无细胞的纤维支架,瓣叶去细胞前、后的生物力学性能无差异;内皮细胞在去细胞瓣叶表面生长,形成一层基本连续的细胞层。结论:去细胞瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程瓣膜;内皮细胞种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

可梯度降解支架细胞化后修复兔前交叉韧带缺损

目的 通过可梯度降解的绳-网支架复合自体骨髓间充质干细胞(MSCs),修复兔前交叉韧带(ACL)缺损。 方法 将聚乳酸: 蚕丝丝素: 聚羟基乙酸纤维按质量比7: 6: 5混合,分别捻拧成绳芯与纬编针织成网状物,滴加Ⅰ型胶原并冻干。将网状物包裹绳芯,种植兔自体MSCs,植入兔前交叉韧带(ACL)缺损处,作为实验组。单纯支架置入为对照组。分别于术后12、24周,取材,HE染色,并行力学测试。 结果 术后12周,实验组新生韧带与骨之间产生大量有序的垂直胶原纤维;对照组形成少量垂直胶原纤维。术后24周,实验组形成类似直接止点结构;对照组则产生许多垂直胶原纤维。力学测试结果显示,术后12、24周实验组的最大载荷分别为72.7±23.4N与121.8±34.3N,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。 结论 可梯度降解支架复合自体MSCs能较好地重建兔ACL。     

髂骨来源的“双相”BMG结合软骨细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨应用髂骨来源的"双相"骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)结合软骨细胞移植修复兔关节软骨缺损的有效性和可行性。方法:使用酶消化法体外分离培养并扩增兔肋软骨细胞;使用自体来源髂骨构建"双相"BMG支架材料;将软骨细胞种植与BMG支架材料上构建成为细胞-BMG复合物;将制作好的27只软骨缺损动物模型随机分为3组。将细胞-BMG复合物移植于软骨缺损模型进行修复治疗作为实验组。将BMG支架移植入软骨缺损模型作为材料组;空白对照组不做处理。分别在术后4周、8周和12周通过大体形态学(依据国际软骨修复协会评分量表)、病理组织学染色及免疫组织化学染色方法对各组修复效果进行评价。结果:番红O染色,甲苯胺蓝染色和Collagen II免疫组化染色分别提示术后12周时实验组的修复组织非常类似于正常关节软骨,组织表面与正常软骨组织平面几乎持平,材料组软骨缺损处得到了部分修复,而缺损组的修复效果较差。按照ICRS量表,大体形态学和病理组织学评分结果提示:术后12周实验组的修复效果与其他两组相比有明显统计学差异(P<0.05)。结论:自体髂骨来源的"双相"BMG结合软骨细胞在体内可形成具有一定结构功能的软骨组织,能够应用于再生修复软骨的缺损。     

去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣实验研究

目的 观察未经戊二醛处理的去细胞猪主动脉瓣组织相容性和可降解性，并探讨基构建组织工程瓣可行性。方法 应用体外种植犬主动脉壁间质细胞和内皮细胞的去细胞猪主动脉瓣叶种植于犬腹主动脉内，观察其形态学和免疫组织化学变化。结果 （1）皮下埋藏实验显示瓣叶轻度炎症反应，10wk埋茂物完全降解吸收；（2）体外细胞种植后7d，见瓣叶表面有单层种子细胞覆盖；（3）体内，即腹主动脉内移植瓣叶，支架逐渐吸收，为新生细胞综合和分泌的纤维结缔组织所取代，至10wk末瓣叶完全重塑，在新构成的瓣叶中可检测到Ⅰ，Ⅲ型胶原、弹力纤维和粘多糖，间质细胞部分呈α－平滑肌肌动蛋白阳性表达，内皮细胞覆盖于瓣叶表面，Ⅷ因子染色为阳性。结论 去细胞猪主动脉瓣体外初步构建的组织工程瓣，移植入犬腹主动脉内经10wk观察，已初步形成具有活细胞的瓣叶组织，并提示组织相容性优于人工合成材料。     

去细胞猪主动脉瓣膜支架的生物学特性

目的探讨以Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞后的组织工程心脏瓣膜支架的生物学特性。方法经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶处理新鲜猪主动脉瓣膜,去除内皮细胞和间质细胞,常规苏木精伊红染色,电子扫描显微镜检查,评价去细胞效果,并检测去细胞瓣叶的力学特性、可溶性蛋白含量、同时行兔皮下包埋实验,观察其免疫反应性。结果Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶能有效去除细胞成分,获得组织工程心脏瓣膜支架。去细胞瓣叶与新鲜瓣叶有相同的拉伸强度-拉伸率曲线。可溶性蛋白含量明显降低,去细胞瓣叶的免疫反应性明显降低。结论经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞处理的猪主动脉瓣膜可以做为组织工程瓣膜支架。     

人脂肪间充质干细胞与生物材料共混物三维打印体的体内成骨

目的：构建人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells, hASCs） 生物材料共混物三维生物打印体,检测其体内成骨能力,初步建立将细胞共混物三维生物打印技术应用于体内成骨的技术路线。方法：以P4代hASCs作为种子细胞,进行成骨向诱导,并采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色和茜素红矿化结节染色检测其成骨向分化的能力。将种子细胞加入20 g/L海藻酸钠和80 g/L明胶混合物（细胞密度约为1×106个/mL）,采用Bioplotter三维生物打印机（德国Envision公司）进行打印,获得细胞 海藻酸钠 明胶共混物打印体,采用活-死细胞双荧光染色法观察打印体中细胞存活率,随后对打印体进行1周成骨诱导培养,作为实验组;另打印不含细胞、只含海藻酸钠 明胶溶胶的三维打印体作为对照组。将实验组和对照组打印体植入裸鼠背部皮下,于植入后6周取出样本,采用苏木精 伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色、马松（Masson）三色法染色、免疫组织化学染色和Inveon微型CT（Micro CT）检测打印体样本的成骨情况。结果：打印体中细胞存活率达89%±2%,打印体植入6周后取出,对照组植入打印体大部分发生降解,形态不规则,为无定型凝胶状,而实验组打印体基本保持原有大小,质地坚韧。HE染色和马松三色法染色结果显示,植入6周后,实验组打印体中有类骨组织形成,并有血管长入;免疫组织化学染色结果显示,骨钙素抗体表达成阳性;Micro CT结果显示,实验组密度较高,新生骨容积为18%±1%。结论：hASCs共混物三维生物打印体可在裸鼠体内异位成骨,细胞共混物三维生物打印技术应用于体内成骨的技术路线是可行的。     

不同细胞株建立人前列腺癌裸小鼠移植模型及转移特性比较

目的比较人前列腺癌细胞DU145和CWR22Rv1(22Rv1)(下面简称22Rv1)分别在皮下和前列腺原位接种后的成瘤性和转移率。方法采用原位接种及皮下接种两种方法将前列腺癌细胞DU145和22Rv1分别接种于裸小鼠体内,以裸鼠出现恶液质、处于濒死状态作为观察终点,颈椎脱臼法处死。尸解并观察荷瘤部位肿瘤的生长情况及局部淋巴结自发性转移情况,并取皮下肿瘤、原位肿瘤、肝、肺、肾、膀胱、盆腔淋巴结标本,甲醛固定、石蜡包埋和HE染色后显微镜下观察。结果原位接种22Rv1组的裸小鼠成瘤率达到10/10,淋巴结转移率为9/10；原位接种DU145组的裸小鼠成瘤率达到10/10,而淋巴结转移率为1/10。两种细胞皮下接种法的裸小鼠成瘤率均达10/10,但未检测到任何淋巴结转移。结论对这两种细胞株采用原位接种法建立裸鼠人前列腺癌原位模型获得成功,用22Rv1细胞建立的原位模型淋巴结转移率高于DU145组,为前列腺癌转移机制的研究及筛药提供了模型。     

原代人脂肪基质细胞体内成骨能力的检测

目的:检测原代人脂肪基质细胞(human adipose-derived stromal sells,hASCs)的体内成骨能力,为应用其构建组织工程化骨奠定基础。方法:酶消化法分离原代hASCs,细胞经成骨向和成脂肪向诱导后,碱性磷酸酶(al-kaline phosphatase,ALP)染色和茜素红矿化染色检测其成骨向分化的能力,油红O染色检测其成脂肪向分化的能力。体内实验使用12只裸鼠,于其背部一侧皮下植入原代hASCs+支架材料作为实验组,同一裸鼠的另一侧植入单纯支架材料作为对照组。植入4周和8周后取材,制成组织切片,进行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果:300 mL脂肪组织中可以获得约6×107个原代hASCs。体外实验证实原代hASCs具有成骨向和成脂肪向分化的潜能。HE染色可见,植入4周和8周后植入物中有类骨组织形成,免疫组织化学染色显示骨钙素、ALP和抗人核抗体呈阳性表达。结论:原代人脂肪基质细胞与支架材料构建的复合物可以在裸鼠体内成骨。     

治疗性协同给药抑制裸鼠脑胶质瘤的增生浸润

目的:观察持续低剂量抗肿瘤细胞和抗血管增生单独或协同治疗性给药对裸鼠U251MG脑胶质瘤生长的影响.方法:将浓度为107个/mL的U251MG脑胶质瘤细胞悬液(95%以上成活率),接种至4周龄雄性裸鼠脑白质内.接种第20天开始给药,2次/周,将裸鼠分4大组,吲哚美辛口服给药组;榄香烯腹腔注射给药组;吲哚美辛和榄香烯低剂量协同用药组;对照组(含肿瘤对照和空白对照两组).接种瘤细胞后40 d和50 d时,断椎处死裸鼠,脑标本石蜡切片,3 μm厚,分别行苏木精-伊红(HE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)等染色.结果:肿瘤对照组:接种后40 d裸鼠脑内大量胶质瘤细胞出现,并有多个微血管;50 d裸鼠脑内大量胶质瘤细胞伴随微血管串向脑白质深部浸润.协同用药组:40 d裸鼠脑内仍可见胶质瘤细胞,部分细胞发生凋亡;50 d脑内未见明显肿瘤细胞,大量细胞发生凋亡.4组裸鼠肿瘤平均体积:接种40d为(29.8±39.1)mm³,50 d为(78.4±125.9)mm³,组间差异无统计学意义(P=0.11).结论:联合用药虽能抑制肿瘤增生、浸润发展,延长载瘤鼠的存活期,但不能完全消除肿瘤.     

人眼眶横纹肌肉瘤动物模型的建立

目的:探讨建立人眼眶横纹肌肉瘤动物模型的方法. 方法:培养人胚胎型横纹肌肉瘤细胞株RD细胞,取对数生长期细胞分别接种于4周龄SCID鼠和60Co照射 (1 Gy) 后1 d 的BALB/c裸小鼠;选用成瘤BALB/c裸小鼠的瘤块移植入另一批4周龄BALB/c裸小鼠胁部皮下(组织块接种法).观察各组动物肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线;肿瘤组织行常规病理H-E染色并镜检. 结果:60Co照射后1 d裸小鼠成瘤时间约6～8周,SCID鼠组约3～4周,组织块接种法移植2周后裸小鼠瘤体较明显,3组动物的成瘤率均为100%;成功绘制出肿瘤生长曲线,肿瘤均呈进行性生长;病理检查示各组移植性横纹肌肉瘤与人体肿瘤标本所见类似.结论:成功建立了裸小鼠和SCID鼠人眼眶横纹肌肉瘤模型,组织块接种法可以缩短BALB/c裸小鼠成瘤时间,为进一步研究人眼眶横纹肌肉瘤奠定了基础.     

两种破坏粘膜的方法对原位膀胱癌模型建立的影响

目的比较两种不同的膀胱粘膜损伤方法对细胞移植法原位膀胱癌模型建立的影响及优缺点。方法4～6周龄裸鼠两组,每组10只。麻醉后经尿道置入膀胱静脉留置针,导尿后一组注入100ul10％胰酶保留30min,另一组注入100ul0．1mol·L^-1Hcl15s．PBS冲洗后将浓度为1×10^7L^-1L。的人膀胱癌T24细胞悬液注入两组鼠膀胱保留1～2h。另设一组5只导尿冲洗后直接注入细胞保留1～2h。定期观察裸鼠一般情况。28d后断颈处死,解剖观察膀胱成瘤及转移情况,并取膀胱及可疑肾脏行病理学检查。结果胰酶破坏组到2w有2只间断出现淡红色血尿,下腹肿块不明显。到28d后处死,肉眼2只成瘤,约占膀胱50％以上。病理检查证实成瘤2只,多局限于粘膜,未突破肌层。盐酸破坏组约12d开始出现血尿,其中4只可及下腹肿块,2只于2d死亡。到28d处死．共8只大体成瘤,2只见右肾肿大。病理检查示8只成瘤,细胞结构紊乱,未突破浆膜层,两只肾转移。未行粘膜破坏组无明显变化,也无瘤形成。结论胰酶破坏膀胱粘膜对动物损伤轻,但成瘤率低;盐酸破坏粘膜对动物损伤稍大,但成瘤率满意,在细胞移植法建立原位膀胱癌模型可明显提高成瘤率。     

Cal27裸鼠口腔癌转移模型的建立及其意义

目的 建立Cal27舌鳞癌动物正位移植瘤淋巴道转移模型, 为进一步研究口腔癌细胞转移的规律及分子机制提供帮助.方法 经口底将2×106 Cal27细胞悬液0.08 mL分别注射至24只裸鼠下颌舌骨肌与颏舌肌之间.成瘤后定期测量肿瘤体积, 记录裸鼠体重变化;14 d后处死裸鼠, 对组织切片型HE染色观察组织结构异型性和细胞异形性, 颌下淋巴结及肺、肝有无转移, 并统计转移率.结果 裸鼠在接种Cal27细胞第3天成瘤, 成瘤率100% (24/24) .HE染色示肿瘤组织呈典型鳞癌表现.颌下淋巴结内可见转移鳞癌细胞, 转移率70% (17/24) .肝、肺未见转移.结论 成功建立Cal27裸鼠正位移植瘤淋巴道转移模型.此动物模型能客观反应口腔癌生物学行为, 模拟口腔癌区域淋巴结转移的过程, 是研究口腔鳞状细胞癌侵袭转移较理想动物模型之一.     

胚胎皮肤细胞裸鼠皮下移植构建毛发发育模型

目的 观察胚胎皮肤细胞裸鼠皮下移植后的毛发发育情况,构建毛发发育模型.方法 从C57BL/6鼠胚胎的皮肤中分离出真皮和表皮细胞,将它们按照一定比例重新混合后采用注射法移植到裸鼠皮下,显微镜下观察毛发形成情况.结果 镜下观察到裸鼠皮下有毛囊及毛发纤维形成并有毛干长出.结论 胚胎皮肤细胞体内移植可以构建毛发发育的完整模型.

Abstract：

Objective To observe the hair development after subcutaneous implantation of embryonic skin cells in nude mice, and construct a model of hair development. Methods Dermal and epidermal cells isolated from embryonic mouse skin were mixed at a given ratio and injected subcutaneously in nude mice, and hair formation after the implantation was observed under a microscope. Results Formation of the hair follicles and fibers under the skin of the recipient nude mice and emergence of the hair shaft were observed microscopically. Conclusion Embryonic skin cells be used to construct a complete model of hair development after implantation in vivo.     

人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立的实验研究

目的:探讨人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立的技术方法。方法:借助动物立体定向仪的引导,采用微注射方法将体外培养人脑胶质瘤细胞U87MG(悬浮于无血清RPMI1640培养液中,细胞数为108/ml)接种于裸鼠(BALB/c)额叶白质区。接种后观察不同实验鼠的生存情况,分别于接种后1h至63d的不同时间进行裸鼠脑肿瘤组织病理学检查和免疫组织化学分析。结果:裸鼠脑内注射体外培养的人脑胶质瘤细胞U87MG的合适速率为0.05μl/min=1μl/20min,细胞悬液体积1ul,细胞数105,注射时间20min。按此方案注射U87MG细胞无沿针道返流,恰好在尾状核区形成近圆球形肿瘤体,成瘤率高(100%),肿瘤颅内生长稳定,组织病理学检查符合人脑胶质瘤形态特征,未见脑外转移。结论:本研究的人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立方法精确可靠,重复性好,该模型可作为研究人脑胶质瘤发生、生物学特性以及治疗研究的可靠动物模型。     

1.5T磁共振成像在检测裸小鼠胶质瘤原位成瘤模型中的应用

目的建立裸鼠脑胶质瘤原位移植瘤模型并进行1.5T磁共振(magnetic resonance,MR)扫描,探讨1.5TMR在裸鼠颅内肿瘤成像的可行性和准确性。方法SHG-44细胞传代培养后,用微量注射器吸取肿瘤细胞悬液直接穿刺接种,在肿瘤细胞接种后15 d行1.5T MR扫描,裸鼠麻醉后置于小动物线圈采集图像,共扫描T1、T2增强及DTI序列,并利用影像工作站测量体积。而后取脑组织做病理切片,计算体积后行HE染色及CD34染色,与MR采集的图像进行对比分析。结果除去围手术期死亡2只裸鼠外,剩余的13只裸鼠在MR增强序列图像上均能见到肿瘤,成瘤率达100%,荷瘤裸鼠平均生存时间为25 d。在MR图像上测得的肿瘤体积为(29.41±10.95)mm3,组织切片测得的肿瘤体积为(26.57±9.70)mm3,二者差异无统计学意义(P>0.05),但具有明显的相关性(r=0.985,P<0.01)。MR扫描的图像质量以T2加权和增强序列较好,DTI序列能够重建出裸鼠大脑白质纤维束分布情况。结论采用微量注射器直接建立裸鼠胶质瘤原位移植瘤模型简单快捷,成瘤率高。1.5TMR能无创性检测裸鼠脑胶质瘤成瘤情况,在T2、增强序...