贵阳地区GⅡ.4型诺如病毒变异株的初步研究

目的 了解贵阳地区GⅡ.4型诺如病毒变异株的组成及其点突变.方法 监测2010年6-11月于贵阳地区哨点医院就诊的急性胃肠炎病例,收集粪便标本,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)初步鉴定,随机选取部分GⅡ型诺如病毒阳性标本,采用一步法RT-PCR对其VP1基因区克隆及测序,基因序列与国内外流行的GⅡ.4型诺如病毒进行系统进化及氨基酸位点的突变分析.结果 检测标本426份,有267份(62.68％)GⅡ型诺如病毒阳性,测序获得了9份GⅡ.4型诺如病毒VP1基因组序列,贵州省2010年流行的GⅡ.4型诺如病毒包括2个变异株(GⅡ.42008a和GⅡ.4 2008b新型变异株),亚型组闻的VP1基因的同源性为95.90％ ～ 96.72％,亚型组内同源性为99.45％ ～ 100％,有2个氨基酸位点易发生突变.结论 贵阳地区2010年夏秋季急性胃肠炎以诺如病毒GⅡ型为主,并且变异株具有多样性.     

2011年苏州地区诺如病毒GⅡ组变异株的分子特征研究

目的 了解苏州地区诺如病毒的感染状况及其变异株的分子特征.方法 收集苏州市儿童医院疑似病毒性腹泻粪便标本419例,采用荧光定量PCR方法检测粪便中诺如病毒RNA及其基因组别,并对部分阳性标本测序分析.结果 419份粪便标本中,GⅡ组诺如病毒为122例,阳性率为29％,未检测出GⅠ组诺如病毒,对本地区部分诺如病毒阳性标本进行测序,A区(RdRp区)测序的25份GⅡ标本中25株均为GⅡ.4型;C区(N-S区)测序的26份GⅡ标本中17株为GⅡ.4型,8株为GⅡ.3型,1株为GⅡ.2型;D区(P区)测序的25份GⅡ标本中16株为GⅡ.4型,9株为GⅡ.3型.结论 诺如病毒是本地区婴幼儿病毒性腹泻的重要病原体,以诺如病毒GⅡ.4-2006b亚型为主,此外发现有GⅡ.4-2010亚型(GⅡ.4 New Orleans株)的流行,这是国内首次对该亚型毒株进行报道,同时还检测到部分重组毒株,提示诺如病毒在本地区的遗传变异日趋复杂.     

我国诺如病毒SZ9711株P粒子制备及唾液HBGAs受体亲和性分析

目的 了解SZ9711株P粒子与唾液组织血型抗原受体（HBGAs）的结合模式.方法 从诺如病毒SZ9711株基因组中克隆P区基因片段并构建pGEX-4T-1原核表达质粒,在原核细胞中表达目的 重组蛋白并纯化,经溶血酶酶切后释放目的 蛋白.用EIA方法测定SZ9711株和VA387株P粒子与唾液HBGAs的结合情况.结果 SDS-PAGE电泳分析确定重组融合蛋白的表达,经纯化和凝血酶切后获得约38×10^3的目的 蛋白P蛋白.根据EIA分析表明,SZ9711株P粒子与先前报道的VA387株P粒子与唾液HBGAs模式相同,与A、B和O^secretor有亲和力,但与O^non-secretor亲和力非常低.同时,SZ9711与A抗原的亲和力较VA387与A抗原的亲和力低.结论 本研究利用我国分离到的SZ9711株制备的P粒子进行唾液HBGAs受体结合分析,表明与同源性较高的先前报道的VA387 P粒子结合模式相似,为今后研究诺如病毒与宿主受体之间的关系奠定实验基础.     

2008-2014年GⅡ.4诺如病毒抗原表位进化研究

目的 了解新的GⅡ.4变异株相对于旧变异株在遗传和结构上的选择优势,研究近几年湖州市GⅡ.4型诺如病毒的进化替换规律.方法 收集从2008年到2014年湖州市GⅡ.4型诺如病毒13株,进行全长VP1区的序列测定,通过序列比对分析找到关键的变异位点.结果 湖州地区的GⅡ.4型诺如病毒在七年中经历了3次变异,2008年和2009年的诺如病毒与2006b variant聚成一个分支;2010和2011年检测到的病毒与2010 variant聚成一个分支;最近从2012年底一起暴发疫情中检测到的诺如病毒和2013年、2014年检测到的与国际上最新的2012 variant聚成一个分支.在氨基酸水平,我们找到77个信息位点（540个氨基酸中的14.3％）.其中39个位于P2区,N端4个,S区18个,P1区16个.结论 GⅡ.4型诺如病毒是全球范围内严重的病毒性肠胃炎首要原因.在过去的十几年时间里,诺如病毒GⅡ.4型已经引起了四次世界范围的急性胃肠炎流行暴发.新出现的变异株迅速并完全的替换已经正在流行的变异株.     

2008-2009年北京地区GⅡ.12型诺如病毒基因特征研究

目的 了解2008-2009年北京地区成人腹泻样本中诺如病毒(Norovirus,NoV)GⅡ.12型毒株的基因特征.方法 用三对引物对11株GⅡ.12型诺如病毒毒株RdRp,、ORF2、ORF3及ORF1/OFF2重叠区分别扩增,PCR产物纯化、克隆、测序,通过DNAStar、MEGA、SimPlot等生物软件进行比对、系统进化分析及重组分析.结果 根据系统进化分析,11株在RdRp区属于GⅡ.g,在ORF2和ORF3区均属于GⅡ.12.SimPlot分析进一步证实了11株均为GⅡ.g/GⅡ.12重组株.结论 北京地区流行的GⅡ.12型诺如病毒与世界其他地区流行的GⅡ.12型诺如病毒毒株均属同一毒株,确定了北京地区GⅡ.12型诺如病毒毒株的基因特征.     

创新型诺如病毒GⅠ/GⅡ抗原荧光纳米颗粒快速联检试纸条检测效能测评

目的 评估诺如病毒GⅠ和GⅡ抗原荧光纳米颗粒快速联检试纸条的灵敏度和特异性.方法 以培养的轮状病毒等其他肠道病原体和245例具有胃肠道感染症状患者的粪便为检测标本,分别用诺如病毒GⅠ和GⅡ抗原荧光纳米颗粒快速联检试纸条和诺如病毒GⅠ和GⅡ抗原二合一彩色微球法检测试纸条检测.结果 诺如病毒GⅠ和GⅡ抗原荧光纳米颗粒快速联检试纸条的灵敏度显著高于诺如病毒GⅠ和GⅡ抗原二合一彩色微球法检测试纸条;对常见的轮状病毒(Wa株)、肠道腺病毒(40型)、肠道病毒柯萨奇病毒(A16)、埃可病毒(30型)和肠道病毒(EV71)无交差反应.结论 诺如病毒GⅠ和GⅡ抗原的荧光纳米颗粒快速联检试纸条灵敏度显著高于彩色微球法快速检测试纸条,特异性良好.     

GII.P7/GII.14型诺如病毒暴发的分子特征分析

目的 了解江苏地区3起诺如病毒(Norovirus,NoV)暴发疫情中病毒感染情况,并对其分子流行病学特征进行初步研究.方法 收集暴发疫情中患者的肛拭子标本53份,采用实时荧光RT-PCR定性检测NoV,阳性标本利用普通RT-PCR对其聚合酶区(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)及衣壳蛋白区(VP1)片段进行扩增和测序分析.结果 3起NoV暴发疫情中,阳性检出率为56.6%(30/53).对30株阳性标本序列进行分析,其RdRp区与GII.P7的同源性最高(93.86%),VP1区与GII.14的同源性较高(97.13%).初步判断为GII.P7/GII.14重组毒株,SimPlot分析可能的重组位点在核苷酸5009位.对其氨基酸序列进行分析发现在RdRp区和VP1区均出现部分氨基酸突变.结论 3起NoV暴发疫情均由同一重组毒株引起,提示GII.P7/GII.14重组株传染性较强,有可能再次引起暴发,应加强监测防控.     

GII.8和GII.9型诺如病毒P蛋白糖结合特征研究

目的了解GII.8和GII.9型诺如病毒P蛋白的糖结合特征。方法利用大肠杆菌系统获得GII.8和GII.9诺如病毒P颗粒蛋白, 通过寡糖和唾液结合实验, 研究P颗粒蛋白与组织血型抗原等糖的相互作用, 再采用序列比对和结构比较, 分析GII.8和GII.9糖结合位点的序列和结构特征。结果 GII.8 P蛋白与所检测的寡糖无明显结合, 与部分人A/B/O型别唾液样本有结合。GII.9 P蛋白结合H双糖, 与人A/B/O型别唾液有很好结合。序列和结构分析均显示GII.8 P蛋白具有与GIII.9相似的潜在糖受体结合位点, 其位点与流行株GII.4等型别的糖受体区区相近。结论非流行株GII.8和GII.9 P蛋白与不同组织血型抗原的结合能力不同, 提示可能会造成流行的差异, 需要对非流行株开展持续的分子监测。     

2015—2016年上海地区成人门诊腹泻病例中诺如病毒GⅡ型流行特征

目的 了解2015—2016年上海地区成人门诊急性腹泻病例中诺如病毒(norovirus, NoV)GⅡ型的基因分型及分子流行病学特征。方法 收集上海地区2015年3月至2016年12月912份成人急性腹泻粪便标本,采用一步法定量逆转录PCR方法检测NoV GⅡ型,并扩增开放阅读框1(open reading frame,ORF1)的聚合酶和ORF2衣壳区域进行测序分型。结果 2015年3月至2016年12月912份成人急性腹泻粪便标本NoV GⅡ型阳性检出率为17.76%(162/912),其中2015年NoV GⅡ型阳性率为15.08%(65/431),2016年阳性率为20.17%(97/481),阳性标本中针对ORF1的RdRp区域和ORF2区域5′端均分型的标本为145份,共有10种型别,分别为GⅡ.Pe_GⅡ.4 Sydney 2012(60份)、GⅡ.P17_GⅡ.17(45份)、GⅡ.P16_GⅡ.13(10份)、GⅡ.P12_GⅡ.3(10份)、GⅡ.P7_GⅡ.6(9...     

通用引物高通量测序扩增GⅡ.4 Sydney[P31]型诺如病毒基因组及进化分析

目的:分析2017至2020年我国诺如病毒流行株GⅡ.4 Sydney[P31]基因型的基因组以及变异情况。方法:利用通用引物初步建立GⅡ组诺如病毒基因组扩增方法,扩增GⅡ.4 Sydney[P31]株基因组,并应用高通量测序技术对其基因组测序,对GⅡ.4 Sydney[P31]株进行系统进化分析和关键位点分析。结果:...     

一起诺如病毒Ⅰ型Ⅱ型混合感染急性胃肠炎暴发疫情调查分析

目的 对湖州市某中学发生的一起以腹泻、呕吐为特征的暴发疫情进行调查和分析,查找病因、分析危险因素.方法 采用现场流行病学调查方法,结合临床表现及实验室检测结果进行调查与综合分析.结果该校共发生急性胃肠炎病例578例,罹患率为23.58%;临床表现主要为腹泻、呕吐、腹痛、恶心,少见发热,大多症状较轻,病程1～3 d;各班均有发病,无明显聚集性;共采集患者粪便标本15份,采用RT-PCR方法检出诺如病毒阳性标本11份,其中Ⅱ型6份,Ⅰ型阳性3份,Ⅰ型、Ⅱ型混合阳性2份(同一学生,两次采样).病例对照研究显示,饮用未加热桶装水是此次发病的危险因素(OR=2.46,95% CI=1.19～5.23),且饮水量与发病存在剂量反应关系(X2=24.18,P<0.01).通过采取隔离治疗传染源、改桶装水为供应开水、卫生消杀及健康教育等综合措施后,疫情迅速得到控制.结论 本次疫情是由诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发,可疑的传播途径为饮用未加热的桶装水与日常接触.     

抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原单克隆抗体的研制

目的应用杂交瘤技术制备抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的单克隆抗体。方法用脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原免疫雌性Balbc小鼠,取其致敏脾脏淋巴细胞与SP20小鼠骨髓瘤细胞融合。间接ELISA法筛选阳性克隆,制备腹水。检测McAb效价、抗体亚类和杂交瘤细胞核型。结果获得4株阳性杂瘤细胞株,选择一株制备腹水,ELISA效价为1∶2.4×106,中和试验效价1∶1.3×104,蛋白浓度为27.2mgmL。McAb与Ⅱ型Sabin株C抗原(ⅡC)、Ⅰ型Sabin株及Ⅲ型Phizer株D抗原(ⅠD、ⅢD)不发生交叉反应,具有高度特异性。结论成功的制备了针对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的McAb,为进一步研究IPV效力检测奠定了基础。     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗株的建立

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）的重组痘苗病毒（实验疫苗株）能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株。首先将经聚合酶链反应（ＰＣＲ）修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７５Ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＋痘苗病毒天坛７６１株感染的人胚肺二倍体细胞。经同位素探针（３２Ｐ－ＨＳＶ－２ｇＤ）原位杂交法和３轮蚀斑纯化，筛选出基因组内整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，ＨＳＶ－２ｇＤ基因已插入痘苗病毒基因组内预期的ＴＫ区段，间接免疫荧光检测显示，重组病毒感染细胞后能有效地表达ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白。     

GII.P16型诺如病毒聚合酶蛋白的原核表达、活性测定和结晶

目的:原核表达GII.P16型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）蛋白,并对其进行生物活性测定和晶体制备。方法:首先通过RT-PCR方法获得GII.P16 RdRp完整基因并将其克隆至携带His-Tag PET28a载体,构建重组表达质粒,然后转化至大肠杆...     

广州市一起诺如病毒GII.17变异株引起的医院内感染性腹泻暴发调查

目的调查2016年广州市某医院一起医务人员感染性腹泻暴发病因、传播途径以及危险因素, 为疫情防控提供参考。方法根据病例定义开展病例搜索, 采用描述性及回顾性队列研究的方法分析事件特征及危险因素;采集病例、厨工的粪便/肛拭子及环境拭子, 采用荧光定量RT-PCR方法检测诺如病毒核酸, 阳性标本进行基因序列扩增和测定并进行同源性分析。结果共报告病例158例, 罹患率为5.2%(158/3 010)。回顾性队列研究显示, 诺如病毒检测阳性厨工配餐科室医务人员发病风险是检测阴性厨工配餐科室医务人员的3.5倍(RR=3.52, 95%CI:1.54～8.06);共采集各类标本141份, 阳性率27.0%(38/141), 基因测序结果为GII.17毒株, 病例与食堂送餐阳性人员同源性为100%。结论本起疫情为GII.17毒株感染引起的院内诺如病毒暴发疫情, 疫情在中心手术室医护人员中传播后, 引起食堂配餐人员感染进而通过配餐环节扩散到其他科室。诺如病毒暴发调查时要注意排查厨工的感染情况。     

人乳头瘤病毒16型内变异株与宫颈病变

目的 研究患宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）的汉族妇女中人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）16型内变异株的类型及其在临床上的意义.方法 随机收集中日友好医院妇科门诊就诊的77例感染HPV16的汉族患者的宫颈脱落细胞DNA,用PCR法扩增HPV16型包含E6和E7基因的DNA片段并测序.通过对测序得到的E6基因序列与GenBank下载的参考株的比对,研究77例汉族患者中HPV16变异株的类型并探讨其与CIN的关系.结果 纳入研究的77例患者中,最小年龄21岁,最大年龄56岁,平均年龄36.39±6.86岁.其中,CIN Ⅱ级以下病变16例（占比20.8%）,CIN Ⅱ级及以上病变61例（占比79.2%）.HPV16型内变异株只有亚洲株和欧洲株两种,亚洲株38例,欧洲株39例.经χ^2检验,χ^2=0.0034,P〉0.05,尚不支持亚洲株与欧洲株的致癌作用不同.结论 虽然本研究未发现HPV16型亚洲株与欧洲株的致癌作用不同,但本研究发现77例汉族患者感染的HPV16型内变异株以亚洲株和欧洲株为主,故我们有理由推测,HPV16型内变异株在我国汉族妇女中的分布以亚洲株和欧洲株为主,而其他变异株,特别是高致癌的亚美株并不常见.     

北京地区人乳头瘤病毒16型感染及其E6/E7基因变异与宫颈病变的相关性研究

目的探讨HPV16感染及其E6/E7基因变异与宫颈病变的相关性。方法采用导流杂交技术进行HPV感染分型检测,PCR扩增出80份HPV16阳性宫颈病变的E6/E7基因、克隆入pMD18-T载体,双向测序分析基因变异与宫颈病变相关性。结果HPV16在宫颈病变患者中的检出率最高为33.3%(154/463),与病变程度相关(P<0.05)。E6/E7基因72份测序成功,DNA序列变异发生率为88.9%(64/72)。氨基酸序列E6-D32E(T96G)和E7-N29S(A86G)位点突变同时伴随存在,D32E/N29S的检出率为38.9%(28/72),与宫颈病变程度相关(P<0.05)。结论HPV16是北京地区来源的宫颈病变中最常见的致病型,其D32E/N29S变异与病变程度相关。