转录因子Sox9调控软骨发育的研究进展

骨的发育主要有膜内成骨和软骨内成骨两种形式,其中软骨内成骨是体内大部分骨骼包括四肢骨、脊椎骨、颅底骨和一部分锁骨的发育形式.软骨内成骨包括软骨发生和生长板发育阶段.在软骨发生阶段,间充质干细胞分化为软骨细胞形成软骨原基.软骨原基是未来骨骼的雏形,原基内的软骨细胞有序分化、增殖和排列形成典型的生长板结构.软骨生长板在结构上包含4个分区:即静息区、增殖区、前肥大区和肥大区.静息区软骨细胞体积小呈圆形,细胞排列紧密,增殖少而且分化不成熟,表达Ⅱ型胶原蛋白(Col2a1).增殖区软骨细胞分裂旺盛,细胞扁平呈柱状排列.前肥大区为软骨细胞由增殖区向肥大区的过渡阶段.肥大区软骨细胞停止增殖进入终末分化阶段,细胞体积变大分泌一些特定的软骨基质如X型胶原蛋白(ColX)等.终末分化的软骨细胞最后发生生理性死亡,同时伴有成骨细胞、破骨细胞和血管侵入,成骨细胞分泌的骨基质最终取代软骨基质实现骨化.一系列的研究表明软骨内成骨受到多因素、多层次严格有序的调控,如全身性的生长激素和甲状腺素;软骨细胞分泌的Wnts、BMP、FGF、IGF和Ihh-PTHrp等信号[1].这些信号通过激活多种转录因子启动一系列基因表达,最终使软骨内成骨协调有序进行.近年来的研究表明,转录因子Sox9参与调控软骨内成骨的多个阶段的发育过程,包括软骨发生、生长板内软骨细胞的成熟、肥大等过程,本文就Sox9基因调控软骨发育的最新研究进展进行综述.     

血管内皮生长因子在新生鼠胫骨生长板软骨细胞中的表达

目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）在鼠生长板软骨细胞增殖、分化和矿化过程中的自分泌作用。方法：新生鼠（1～2d）10只．切取干骺部软骨组织，采用免疫组织化学方法（5只）和RT—PCR方法（5只），检测VEGF及其受体Flt-1和KDR/Flk-1在胫骨生长板中的表达。结果：免疫组织化学染色VEGF、Fit-1和KDR／Flk-1在生长板的上肥大区、下肥大区和矿化区中的软骨细胞表达强阳性，在增殖区少数软骨细胞中呈阳性表达，在静止区软骨细胞中表达阴性。RT—PCR检测的5只鼠中除1只不表达Flt-1外，VEGF（251bp）、Flt-1（272bp）和KDR/Flk-1（252bp）在软骨组织中均清晰表达。结论：VEGF及受体Flt-1和KDR／Flk-1在生长板软骨中的表达具有高度一致性，并且随着软骨细胞的分化成熟表达逐渐增强。提示VEGF在生长板软骨细胞的增殖、分化和矿化过程中，可以自分泌作用方式起重要调节作用。     

骨关节炎软骨细胞凋亡率的实验研究

目的检测和分析髋关节骨关节炎中软骨损伤轻重部位的软骨细胞凋亡率。方法关节软骨组织切片分别进行HE染色，番红O-固绿染色，Mankin评分评价软骨损伤程度，TUNEL方法检测软骨细胞凋亡率。结果关节软骨损伤重的部位的Mankin评分值及软骨细胞凋亡率均高于软骨损伤轻的部位。结论软骨细胞凋亡率与骨关节炎软骨损伤程度相一致，说明细胞凋亡可能是骨关节炎软骨损伤的机制之一。     

家兔髋脱位模型中髋臼软骨病理改变的研究

目的 观察家兔髋关节脱位模型中髋臼软骨的病理改变.方法 建立单侧髋关节脱位的动物模型,通过X线片测量髋臼指数,HE染色观察组织病理改变.TUNEL法检测软骨细胞的凋亡情况.结果 固定8周后,脱位侧髋关节的髋臼指数与固定前相比明显增大(P<0.05);髋臼软骨细胞的大小及排列均不规则,软骨基质中可见多个空泡样结构;肥大层中凋亡细胞明显低于对照组(P<0.05).结论 髋关节脱位可导致髋臼软骨组织发育过程出现变化,髋臼软骨中肥大层软骨细胞的凋亡数目减少,软骨细胞堆积,可能导致髋臼局部区域软骨层增厚.     

骨培养探讨脂多糖对小鼠骨骼发育及矿化的影响

目的 探讨体外培养情况下脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激对小鼠骨骼发育和矿化的影响及其机制.方法 分离E18.5 d小鼠跖骨和胫骨,分为空白对照组(Blank组)及LPS组(10μg/mL LPS).分别于培养后第1、7天照相,计算跖骨和胫骨全长增长率(TL-rate)、矿化带增长率(CZ-rate)、第7天矿化带占骨全长的比例(CZ％).培养7d后固定、石蜡包埋切片,臧红固绿和甲苯胺蓝染色观察肥大带宽度、Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)、X型胶原(collagen X,Col X)免疫组化染色观察软骨细胞分化及TUNEL染色观察软骨细胞凋亡变化.结果 与Blank组比较,LPS处理后跖骨和胫骨TL-rate及CZ-rate明显降低(跖骨TL-rate P=0.025;跖骨CZ-rate P=0.019;胫骨TL-rate P=0.010;胫骨CZ-rate P=0.024).臧红固绿、甲苯胺蓝染色及形态计量显示LPS组胫骨肥大带较Blank组明显变短(P ＜0.001).与Blank组比较,LPS组胫骨的软骨分化相关蛋白ColⅡ、ColX表达降低,软骨细胞凋亡明显增加.结论 LPS通过抑制软骨增生、分化及促进肥大带软骨细胞凋亡来抑制骨骼发育及矿化.     

Sox9在软骨内成骨中的研究进展

在胚胎发育期间,躯干和四肢骨与大部分颅面骨架均通过软骨内成骨而形成,在间充质细胞向软骨细胞、前肥大软骨细胞、肥大软骨细胞及终末分化的过程中,一系列分子信号的精密调控在正常软骨内成骨中发挥着重要作用。Sox9信号通过自身直接或间接作用,以及与其他信号共同调节软骨细胞的增殖和分化,在胚胎早期软骨内成骨中起核心调控作用。     

关节软骨的细胞凋亡

目的 观察正常及关节炎时关节软骨是否发生细胞凋亡及其可能的意义。方法 采用光镜、电镜观察软骨细胞形态,以琼脂糖凝胶电泳检测软骨细胞特异ＤＮＡ的梯形带,以激光共聚焦显微镜观察细胞内「Ｃａ＾２＋」ｉ动脉变化。结果 骨性关节炎及风湿性关节炎患者的关节软骨细胞经体外培养３ｄ后,光镜及电镜下均可见处于正常分化期的软骨细胞,而未经培养直接分离的部分软骨细胞可见细胞凋亡早期形态学改变。此外,体外培养的牛正常软骨     

细胞凋亡在Meckel's软骨消失中的作用研究

目的 观察细胞凋亡在SD大鼠Meckel's软骨上的变化,初步探讨细胞凋亡在Meekel’s软骨和下颌骨发育中的意义.方法 用原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞在E13 ～ 19 dSD胎鼠的下颌骨发育过程中Meckel's软骨中的变化.结果 E13 ～ 19 d在Meckel's软骨嘴突软骨细胞有零星凋亡细胞出现,软骨膜上可观察到少量凋亡细胞.E17 ～ 19 d Meckel's软骨前段骨化,近骨化处Meckel's软骨软骨细胞TUNEL染色“++”.Meckel's软骨前段远离骨化处和Meckel's软骨中段Meckel's软骨软骨细胞TUNEL染色“+”.E17 ～ 19 d Meckel's软骨前段和Meckel's软骨中段Meckel's软骨膜崩解,软骨膜细胞TUNEL染色“++”,可见多个凋亡细胞聚集成团现象.骨化的Meckel's软骨内也观察到凋亡细胞的出现,TUNEL染色“+”.结论 Meckel’s软骨软骨膜细胞的消亡可能是以凋亡的形式消失,只有一部分Meckel's软骨软骨细胞通过凋亡的形式消失.     

骨关节病与大骨节病关节软骨细胞凋亡的比较

目的比较成年人大骨节病与骨关节病关节软骨细胞凋亡及凋亡相关调控因子Fas和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达分布特点,探讨两种疾病发病机制的异同。方法收集15例大骨节病、15例正常对照以及15例骨关节病的关节软骨,分别采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的脱氧核糖核酸缺口标记(TUNEL)技术和免疫组化法,观察大骨节病、骨关节病和正常对照关节软骨的细胞凋亡率、Fas及iNOS蛋白表达及其分布特点。结果大骨节病及骨关节病关节软骨细胞凋亡率较正常对照高(P<0·01),且关节软骨剥蚀区的细胞凋亡率较未剥蚀区高(P<0·05),但大骨节病与骨关节病之间软骨细胞凋亡率差异无显著性。大骨节病与骨关节病关节软骨Fas及iNOS表达阳性细胞数较正常关节软骨增多(P<0·01),且关节软骨剥蚀区Fas及iNOS表达阳性细胞数较未剥蚀区增多(P<0·05),但大骨节病与骨关节病之间Fas及iNOS表达阳性细胞数差异无显著性。结论骨关节病和大骨节病均存在软骨细胞异常凋亡,Fas和iNOS可能参与了细胞凋亡过程。     

正常成人和成体大鼠气管软骨组织动力学观察

目的：观察正常成人和成体大鼠气管软骨的组织动力学。方法：应用细胞生物学方法、衰老相关-β-半乳糖苷酶组织化学染色和增殖细胞核抗原免疫组织化学方法,研究正常成人和正常成体大鼠气管软骨组织动力学。结果：软骨细胞呈现多种方式的无丝分裂像;气管软骨膜与软骨周围带多见细胞增生;气管软骨中央带多见衰老的软骨细胞,并见明显核固缩、核碎裂等细胞凋亡形态学特征。结论：从软骨膜最外层致密结缔组织到成熟软骨组织呈现一个连续的组织演化动力学过程;气管软骨组织适应性再生的细胞来源是软骨膜结缔组织细胞。     

组织工程化关节软骨细胞凋亡的研究

目的 观察离心管构建的组织工程骨细胞亡及细胞增殖情况。方法 对离心管构建3周的组织工程骨进行透射电镜，流式细胞仪检测和^3H-TdR掺入测定，与3周龄兔关节软骨对照。结果 透射电镜检查组织工程软骨在5％左右的细胞凋亡，正常关节软骨未见明显的细胞凋亡；流式细胞仪显示软骨细胞有8．5％左右的亚二倍体细胞，正常关节软骨在2．4％左右的亚二倍体细胞。^3H-TdR掺入测定显示细胞增殖能力较正常关节软骨明显增强。结论 培养3周的组织工程软骨细胞凋亡与细胞增殖均较正常软骨增强。     

Relationship between osteocyte apoptosis and orbital bone development in rabbits

Orbitalboneactsasanimportantcomponentoforbit ,whichnotonlyprotectstheorbitalcontentsfrominjurybutalsomaintainscountenancenormal.Nowadaysthemechanismoforbitaldevel opmentisuncertain .Cellapoptosisisaselectionprocessofphysiologicalcellde letion .Itsexecutio…     

bcl-2和p53在丹皮酚诱导人结直肠癌HT-29细胞凋亡中的作用及其机制

目的 探讨bcl-2和p53在丹皮酚（paeonol，Pae）诱导入结直肠癌HT-29细胞凋亡过程中的作用及可能的作用机制。方法 应用透射电镜技术和原位末端标记（TUNEL）法观察不同浓度的Pae对HT-29细胞凋亡的诱导作用，应用免疫细胞化学技术检测用药前、后凋亡相关基因bcl-2及p53表达的变化，并与对照组比较。结果 透射电镜观察到Pae作用后HT-29细胞出现典型的细胞凋亡形态；Pae在15．63mg／L、62．50mg／L、250．00mg／L3种浓度下作用48h均可诱导HT-29细胞凋亡，TUNEL法显示各组凋亡指数（AI）间差别有显著性意义（P〈0．05）；免疫细胞化学染色显示Pae作用后HT-29细胞bcl-2及p53蛋白表达显著降低。结论 Pae能抑制HT-29细胞增殖并诱导其凋亡，其作用可能与下调bcl-2及p53蛋白的表达有关。     

单侧髁突切除对非手术侧髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的研究兔单侧髁突切除对非手术侧髁突软骨细胞增殖和凋亡活性的影响.方法 24只5～6月龄的日本大耳白兔被随机分为两组：空白对照组和手术组.手术组通过手术切除右侧髁突建立动物模型,分别于术后2月、4月的时间处死动物,取其左侧（非手术侧）颞颌关节,采用免疫组化染色和TUNEL染色,分别观察非手术侧髁突软骨中增殖细胞核抗原（PCNA）及凋亡细胞的表达和分布.结果免疫组化和TUNEL染色显示与同时间段空白对照组相比,无论是手术组（单侧髁突切除）术后2月,还是手术组术后4月,非手术侧髁突软骨PCNA阳性细胞表达量均降低;而TUNEL染色阳性细胞数增高（P〈0.05）;与手术组术后2月相比,手术组术后4月PCNA阳性细胞表达量降低;而TUNEL染色阳性细胞数增高（P〈0.05）.结论单侧髁突切除可导致非手术侧髁突软骨细胞增殖能力下降,凋亡细胞数量增加.     

PPARγ激动剂对肝癌细胞HepG2增殖的影响及其机制探讨

目的 观察过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮体外抑制人肝癌细胞HepG2生长并探讨其作用机制.方法 MTT检测不同浓度罗格列酮(10、30、50、100 μmol/L)对HepG2细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,免疫细胞化学半定量检测PPARγ、PTEN、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达,TUNEL和透射电镜观察HepG2细胞凋亡的形态学改变.结果 PPARγ经其配体罗格列酮激活后,可明显抑制HepG2细胞的生长并呈剂量和时间依赖关系;HepG2细胞周期出现G0/G1期停滞;PTEN、Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达水平下降,Caspase-3被激活.TUNEL和透射电镜均可在罗格列酮组观察到凋亡细胞.结论 PPARγ激动剂罗格列酮可抑制肝癌细胞HepG2的生长,其主要作用机制之一是促进细胞凋亡,这可能与调节Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达有关.     

实验性骨关节病中软骨细胞的凋亡

应用兔膝关节伸直位石膏管型固定造成的实验性骨关节病模型,对其关节软骨细胞进行形态学及原位ＤＮＡ 断裂标记研究。结果显示：制动１ 周时即出现软骨表层细胞凋亡,２ 周后凋亡呈增加趋势,６周时出现全层软骨细胞大量凋亡,而正常及实验对照组很少出现凋亡细胞。提示制动可引起软骨细胞凋亡;软骨细胞凋亡可能是关节软骨出现退变的重要机制之一。     

人肺腺癌细胞系GLC-82中p21WAF1和p53基因的过表达

目的 探讨p21^WAF1和p53基因过表达对人肺腺癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法 用带有p21cDNA的真核表达载体pCEP和带有p53的腺病毒表达载体pAdCMV,分别通过基因转染和腺病毒感染,使其在人肺腺癌细胞系(GLC—82)中过表达;通过流式细胞仪、透射电镜和原位末端分析(TUNEL)观察细胞的生长和凋亡情况。结果 p21过表达的细胞系G1期细胞增加,细胞生长抑制,克隆形成率下降,电镜下未见特征性凋亡小体,原位细胞凋亡分析未见凋亡信号;p53腺病毒感染的肿瘤细胞增殖明显抑制并出现死亡,原值细胞凋亡检测到凋亡信号。结论 P21和p53基因的过表达能够抑制人肺腺癌细胞的生长,其中p53能够诱发细胞凋亡,因此这两种基因在肿瘤基因治疗上有着广泛的应用前景。     

短刺法结合电针对兔膝骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究短刺法结合电针对膝骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响。方法 将40只新西兰兔随机分成2组,正常组（A组）10只、造模组30只。造模组动物采用Hulth-Telhag法复制实验兔左膝骨关节炎模型,6周后X线评价造模情况。将造模组再随机分为模型组(B组,n=10）、短刺组(C组,n=10）和普通刺法组(D组,n=10）,第6周开始对C组和D组进行针刺后电针治疗,5 d为一个疗程,共治疗4个疗程（A、B组不行治疗）。治疗结束后X线检测造模情况,HE染色检测软骨组织病理变化情况,TUNEL检测软骨细胞凋亡情况, Western blot检测软骨细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、增殖细胞核抗原（PCNA）、Bcl-2、Bax蛋白表达情况,RT-PCR技术检测软骨细胞Caspase-3、PCNA的mRNA表达。结果 HE染色结果显示:与B组相比,A组、C组与D组软骨细胞排列较整齐,关节表面光滑。 Western blot结果显示:与B组相比,C组与D组中Bcl-2、PCNA表达升高,Caspase-3与Bax表达下降;与D组相比,C组中Bcl-2、PCNA表达升高,Caspase-3与Bax表达均下降。 RT-PCR结果显示:与B组相比,C组与D组中PCNA mRNA表达升高,Caspase-3 mRNA表达下降;与D组相比,C组中PCNA mRNA表达均升高,Caspase-3 mRNA表达下降。结论 短刺法结合电针可以减少软骨细胞凋亡,促进软骨细胞增殖,效果优于普通刺法结合电针。     

酒石酸锑钾在诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡中的影响

目的:本研究旨在明确酒石酸锑钾(PAT)在体外对人肝癌BEL7402细胞凋亡的影响及抑癌机制。方法:用PAT以不同浓度、不同时间作用于人肝癌BEL7402细胞,以诱导其凋亡。用MTT比色法观察其细胞毒性,荧光显微镜、透射电镜、TUNEL染色法及流式细胞术(FCM)等方法来检测凋亡,观察其形态学和生化方面的变化。结果:PAT以剂量依赖和时间依赖的方式抑制BEL7402细胞的生长。5～40μmol·L-1的PAT处理48h后,形态学上,肝癌细胞表现为细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形式等凋亡特征的形态学改变。DNA末端原位标记染色法、流式细胞仪均能检测到凋亡细胞。结论:PAT在体外诱导肝癌BEL7402细胞凋亡,能作为一种凋亡诱导剂用于肝癌的治疗。     

松质骨骨基质明胶复合软骨细胞构建组织工程软骨

目的 观察软骨细胞在同种异体松质骨骨基质明胶(BMG)上的生长、增殖和分化,探讨用松质骨BMG与软骨细胞体外构建组织工程软骨的效果.方法 分离1月龄兔关节软骨细胞,扩增后种植在松质骨BMG上体外构建组织工程软骨.于1、2、4、6周取材进行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学及透射电镜观察.结果 软骨细胞在BMG上生长良好,分泌蛋白聚糖和胶原.随培养时间延长,细胞增殖,松质骨BMG空隙内细胞数量增多,软骨陷窝形成,基质分泌增强.培养6周时软骨细胞在BMG表面及孔隙内形成软骨样组织,免疫组织化学染色显示细胞周围基质富含Ⅱ型胶原,分布均匀:透射电镜显示软骨细胞超微结构正常,细胞周围有大量基质产生.结论 同种异体松质骨BMG可以促进软骨细胞的生长增殖,维持软骨细胞的分化表型;在体外成功构建了组织工程软骨,它是一种较好的软骨组织工程支架材料.

Abstract：

Objective To evaluate the use of cancellous bone matrix gelatin (BMG) combined with chondrocytes in constructing tissue-engineered cartilage by observing the growth, proliferation and differentiation of chondrocytes on allogeneic cancellous BMG. Methods The articular chondrocytes isolated from a 1-month-old rabbit were multiplied to a monolayer and seeded onto cancellous BMG to construct tissue-engineered cartilage in vitro during a period of 6 weeks. Samples were taken from the construct after 1, 2,4, and 6 weeks of culture and evaluated by histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). Results The chondrocytes excreted matrix proteoglycan and collagen on cancellous BMG. With the prolongation of the culture time, the cells proliferated in the construct and the cells in the lacunae increased. Numerous chondrocytes were present the central region of the cancellous BMG and surrounded by extracellular matrix. By 6 weeks of culture, the BMG was covered with 15-20 layers of chondrocytes and cartilaginous tissue occurred in the pores throughout the cancellous BMG. Immunohistochemical staining showed rich and evenly distributed type Ⅱ collagen around the chondrocytes, and TEM revealed an ultrastructure of the chondrocyte similar to that of native chondroctyes, with abundant extracellular matrix produced around the cells. Conclusion Tissue-engineered cartilage can be constructed in vitro using allogeneic cancellous BMG combined with chondrocytes. Allogeneic cancellous BMG serves as a good scaffold material for tissue-engineered cartilage to promote the growth and proliferation of the seeded chondrocytes and allows maintenance of the differentiation phenotype of the cells.