铁过载对成骨细胞铁稳态及生物活性的影响

目的了解铁过载对成骨细胞铁稳态及生物活性的影响。方法 34℃条件下体外培养人成骨细胞(hFOB1.19),以不同浓度(50、100、200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用RT-PCR检测成骨细胞铁调节基因膜转铁蛋白(FPN1)、转铁蛋白受体(TfR)和二价金属转运蛋白1(DMT1)表达的变化;用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察成骨细胞铁离子荧光强度;流式细胞仪检测成骨细胞活性氧(ROS)水平;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;Vonkossa染色法行钙结节染色。结果与对照组相比,FAC干预48h后FPN1mRNA的表达随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性上调,TfR、DMT1mRNA的表达呈剂量依赖性下调(P0.05);FAC干预48h后成骨细胞铁离子荧光强度剂量依赖性减弱,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05);48h后成骨细胞ROS水平随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性升高(P0.05);FAC干预10d后各组成骨细胞碱性磷酸酶活性均随FAC浓度增高而降低,差异有统计学意义(P0.05);与对照组相比,FAC干预17d后成骨细胞钙结节染色显示矿化面积和钙结节形成随FAC浓度增加而减少。结论铁过载对成骨细胞生物活性有明显抑制作用,其机制可能与细胞内铁离子浓度增加及活性氧水平升高有关。     

铁离子对人成骨细胞(hFOB1.19)生物活性影响

目的探讨铁离子对成骨细胞株(hFOB1.19)生物活性,包括碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity,APA)、细胞凋亡、钙结节、Ⅰ型胶原(type 1 collagen,COL 1)和骨钙素(osteocalcin,OC)的影响。方法成骨细胞(hFOB1.19)于5%CO234℃培养箱内培养,将不同浓度枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)50、100、200μmol/L和去铁胺(deferoxamine,DFO)5、10、20μmol/L分别加入细胞培养基中,MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;Von kossa染色法行钙结节染色;RT-PCR和Western blotting法分别检测COL1和骨钙素(bone gla protein,BGP)的基因及蛋白表达。结果 (1)48 h后增生活性:FAC组细胞增生活性随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P0.05),DFO组在5μmol/L浓度组时促进成骨细胞增生,在10、20μmol/L浓度组时抑制成骨细胞增生。(2)10 d时碱性磷酸酶活性:FAC组碱性磷酸酶活性随FAC干预浓度的增加而降低,DFO组碱性磷酸酶活性随DFO干预浓度的增加而升高(P0.05);(3)48 h时凋亡:FAC组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P0.05),DFO组在5、10μmol/L浓度时抑制细胞凋亡(P0.05),在20μmol/L则促进成骨细胞凋亡(P0.05);(4)21 d时钙结节染色:FAC组随铁离子干预浓度增加,成骨细胞矿化面积、钙结节形成数量均减少,DFO组在5、10μmol/L浓度时促进成骨细胞矿化功能,而20μmol/L浓度时对成骨细胞矿化有抑制效应;(5)3 d时基因及蛋白表达:FAC组COL1、BGP基因和蛋白的表达呈剂量依赖性下调(P0.05);DFO组COLⅠ、BGP基因的表达呈剂量依赖性上调(P0.05),DFO在5、10μmol/L浓度时促进COL1、BGP蛋白表达,在20μmol/L浓度时抑制COL1、BGP蛋白表达。结论不同浓度枸橼酸铁铵均抑制成骨细胞功能活性,提示高铁环境不利于成骨细胞的成骨功能。低铁环境对成骨细胞有双重效应,低剂量去铁胺对成骨细胞活性有促进作用,而高剂量去铁胺则对成骨细胞活性有抑制效应。     

高铁环境对成骨细胞生物活性的影响

目的探讨高铁环境对人成骨细胞(hFOB1.19)活性指标的影响。方法采用细胞贴壁法培养成骨细胞(hFOB1.19)后,将不同浓度枸橼酸铁铵(50、100、200μmol/L)加入细胞培养基,用MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况;Vonkossa染色法行钙结节染色;用RT-PCR和Western blotting分别检测Ⅰ型胶原(COL1)的基因及蛋白表达变化。结果用不同浓度枸橼酸铁铵干预成骨细胞后,与对照组相比,48 h与72 h组成骨细胞增生活性呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P0.05);48 h组成骨细胞凋亡率呈浓度依赖性升高,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);不同浓度枸橼酸铁铵干预10 d和14 d时各组成骨细胞碱性磷酸酶活性均随枸橼酸铁铵浓度增高而降低,差异有统计学意义(P0.05);与对照组相比,枸橼酸铁铵干预17 d后钙结节染色结果显示,矿化面积和钙结节形成随铁离子浓度增加而减少;枸橼酸铁铵干预3 d后呈剂量依赖性下调Ⅰ型胶原基因和蛋白的表达。结论高铁环境使成骨细胞成骨活性指标均受到抑制。     

铁离子对人成骨细胞RANKL/OPG基因及蛋白表达的影响

目的研究人成骨细胞(hFOB1.19)在不同铁离子状态下RANKL/OPG基因及蛋白的表达。方法成骨细胞株(hFOB1.19)在DMEM/F-12培养基培养传代至第3代后,用不同终浓度枸橼酸铁铵(50、100、200μmol/L)加入细胞培养基中干预24h,用RT-PCR方法和免疫印迹法(WesternBlot)检测干预后成骨细胞的RANKL、OPGmRNA和蛋白表达并计算RANKL/OPG比率。结果RT-PCR检测结果显示,对照组、50、100、200μmol/L组RANKL/OPGmRNA表达比分别为0.56±0.13、0.58±0.01、0.69±0.01、1.84±0.92;Westernblot结果显示,对照组、50、100、200μmol/L组RANKL/OPG蛋白表达比分别为0.82±0.66、0.82±0.64、1.09±0.11、1.25±0.14。统计学分析显示,在mRNA和蛋白水平,100和200μmol/L浓度的枸橼酸铁铵干预后RANKL/OPG比值明显高于对照组(P0.05),50μmol/L枸橼酸铁干预后与对照组差异无统计学意义。结论不同浓度枸橼酸铁铵可以影响人成骨细胞RANKL/OPG基因及蛋白的表达,进而可能影响骨形成和骨吸收。     

高铁环境下成骨细胞增殖和凋亡与氧化应激的关系

目的了解高铁环境对人成骨细胞(hFOB1.19)增殖和凋亡的影响,观察其与氧化应激的关系。方法 34℃条件下体外培养hFOB1.19,以不同浓度(50、100、200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预48h后,用MTT法检测成骨细胞增殖活性;用流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况;分别用丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒检测成骨细胞MDA含量及SOD、GSH-PX活性。结果用不同浓度FAC干预成骨细胞48h后,FAC50、100和200μmol/L干预组细胞增殖活性分别为(0.63±0.02)、(0.55±0.03)和(0.46±0.04),均显著低于对照组(0.69±0.04),呈剂量依赖性;FAC50、100和200μmol/L干预组细胞凋亡率分别为(6.98±0.84)%、(11.82±0.66)%和(15.78±0.95)%,均显著高于对照组[(3.71±0.43)%],呈剂量依赖性升高,差异有统计学意义(P<0.05);成骨细胞脂质过氧化物MDA水平呈剂量依赖性升高,成骨细胞抗氧化物酶SOD及GSH-PX活性呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论高铁环境可抑制成骨细胞增殖,促进成骨凋亡,其作用机制与氧化应激有一定相关性。     

高铁环境对斑马鱼骨形成的影响

目的观察高铁环境对斑马鱼骨形成的影响,探讨铁过载对骨代谢影响的机制。方法以受精后第2天斑马鱼幼鱼为模型,用不同浓度枸橼酸铁铵(FAC)(0、25、50、100、200μg/mL)干预斑马鱼,受精第6天进行茜素红染色并统计骨矿化面积。在200μg/mL FAC干预6 d基础上,停止添加FAC,加入100μmol/L去铁胺(DFO),第10天行茜素红染色,统计斑马鱼椎体个数,并用实时定量PCR方法检测骨钙素(BGP)基因表达变化。结果不同浓度FAC处理后,斑马鱼骨矿化面积成剂量依赖性降低,100及200μg/mL FAC组与对照组相比差异有统计学意义(P0.05);100μmol/L DFO加入200μg/mL FAC干预组后,斑马鱼椎体个数较未加入DFO组增加,但仍低于对照组(P0.05);加入100μmol/L DFO组骨钙素(BGP)表达量较未加入DFO组上调,差异有统计学意义(P0.05),但仍低于正常对照组(P0.05)。结论高铁环境抑制斑马鱼骨形成。     

铁蓄积及去铁胺干预对雄性小鼠骨量变化的影响

目的了解铁蓄积雄性小鼠骨量变化及降铁剂去铁胺(deferoxamine,DFO)干预后骨量改变。方法在体实验,选取18只6~8周C57雄性小鼠分为对照组(Ctrl组)、铁蓄积组(FAC组)、DFO干预组(FAC+DFO组),铁蓄积组使用枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)干预8周(每周0.1 g/kg),DFO干预组在制作铁蓄积组的第4周FAC注射后1h腹腔注射DFO每周0.2 g/kg。8周后各组均检测:血清铁蛋白(ferritin,FER)、股骨远端骨小梁三维形态重建和空间结构参数。体外实验:使用MC3T3细胞,分为对照组(Ctrl组)、铁蓄积组(FAC组)、DFO干预组(FAC+DFO组);FAC组加FAC干预48 h,DFO组在FAC干预24 h时加入DFO;48 h后收集3组细胞,检测指标:细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达。结果 micro-CT检测提示Ctrl组BMD(104.68±8.56)mg/m~3,BV/TV(19.92±1.92)%,Tb.Th(0.098±0.008)mm,Tb.Sp(0.172±0.133)mm,ALP活性值0.71±0.06;FAC组BMD(50.41±10.27)mg/m~3,BV/TV(10.18±1.76)%,Tb.Th(0.057±0.012)mm,Tb.Sp(0.322±0.214)mm,ALP活性值0.33±0.04;FAC+DFO组BMD(92.72±9.62)mg/m~3,BV/TV(17.84±1.54)%,Tb.Th(0.085±0.010)mm,Tb.Sp(0.186±0.195)mm,ALP活性值0.59±0.03。FAC组相比于Ctrl组骨密度、骨小梁空间结构参数显著下降,成骨细胞ALP活性受抑制,BMP2表达与Ctrl组比较降低,差异有统计学意义(P0.05);DFO干预后骨密度恢复,骨小梁空间结构参数恢复正常,ALP和BMP2表达恢复正常,与FAC组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论雄性小鼠铁蓄积后骨量显著下降,DFO干预可以缓解铁蓄积相关的骨量减低,其机制可能与DFO阻断铁蓄积对BMP2的抑制有关。     

Sirtuin 3下调在高铁负荷导致骨骼肌损伤中的作用

目的观察体外高铁细胞培养环境以及小鼠铁蓄积状态下骨骼肌Sirtuin 3(SIRT3)表达的变化, 探讨SIRT3下调在高铁负荷导致骨骼肌损伤中的作用。方法以梯度浓度的枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate, FAC)干预小鼠成肌细胞C2C12, 检测细胞增殖、凋亡, 观察细胞形态, 检测SIRT3 mRNA、蛋白以及活性水平;ICR小鼠随机分为对照组, FAC干预组以及FAC+去铁胺(deferoxamine, DFO)组。对照组予生理盐水干预;FAC组以FAC干预, 再以生理盐水干预;FAC+DFO组在FAC后再以DFO干预, 检测骨骼肌非血红素铁、SIRT3蛋白水平, 测定肌细胞原位凋亡, 观察骨骼肌形态。结果 C2C12细胞分化后在FAC的干预下, 细胞的增殖活性下降(P<0.05), 细胞凋亡率升高(P<0.05), SIRT3 mRNA、蛋白以及生物活性均下降(P<0.05), 细胞形态逐渐萎缩, 肌管长度、数目逐渐减少。在在体研究中, FAC组小鼠骨骼肌非血红素铁含量与对照组相比增加(P<0.05), FAC+DFO组与FAC组...     

去铁酮对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1生物学活性的影响

目的研究铁螯合剂去铁酮(deferiprone,DFP)体外对成骨细胞增生、分化以及细胞铁代谢的影响。方法体外培养小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1,在10 mmo L/Lβ-甘油磷酸和50μg/m L抗坏血酸的诱导下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(25、50、100μmol/L)DFP干预,用CCK-8法检测细胞的增生,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测细胞ALP活性,实时定量PCR检测细胞膜转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)mRNA的表达。结果 MC3T3-E1细胞增生结果显示,DMSO溶剂组、对照组(0μmol/L)和DFP 25、50、100μmol/L组A值分别为1.36±1.10、1.41±0.09、0.78±0.06、0.68±0.03、0.46±0.01;ALP活性检测结果显示,对照组(0μmol/L)和DFP 25、50、100μmol/L组ALP活性值分别为0.83±0.05、0.75±0.04、0.64±0.03、0.51±0.03;TfR mRNA表达检测结果显示,对照组(0μmol/L)和DFP 25、50、100μmol/L组表达比分别为1、1.16±0.05、1.32±0.06、2.30±0.11。MC3T3-E1细胞的增生、ALP活性随DFP干预浓度的增加呈剂量依赖性下降(P0.05),TfR mRNA的表达随DFP干预浓度的增加呈剂量依赖性上升(P0.05)。结论 DFP可能通过螯合成骨细胞内的铁离子抑制其增生、分化。     

铁对人肺腺癌A549细胞凋亡的体外影响

目的了解加铁、去铁对体外培养人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的影响,探讨铁代谢与肺癌发生发展的关系。方法体外培养人肺腺癌细胞株A549细胞,采用不同浓度的去铁胺(DFO)及三氯化铁(FeCl3)以及生理盐水作用A549细胞,通过观察细胞形态学变化、流式细胞术(FCM)检测、TUNEL三种方法检测细胞凋亡的变化。结果①不同浓度的FeCl3作用于A549细胞后,在同一时间点随浓度升高细胞凋亡率(APO%)呈下降趋势;②不同浓度FeC l3作用于A549细胞后,仅150μmol/L组48 h出现凋亡梯带,其余浓度均无凋亡梯带出现。③流式细胞仪(FCM)检测各组APO%分别为:10μmol/L FeCl3组6.7%,50μmol/L FeCl3组4.7%,100μmol/L FeCl3组2.5%,150μmol/L FeC l3组12.6%。④浓度为100μmol/L DFO作用于A549细胞,6、12、24、48h FCM检测APO%为:5.2%、17.5%、42.9%、56.8%。浓度为10、50、100、150μmol/L 24hAPO%分别为10.4%,26.2%,42.9%,48.3%。结论三氯化铁可抑制A549细胞凋亡,去铁胺可诱导A549细胞凋亡,铁螯合剂可成为一种有效的抗肿瘤药物。