负载肿瘤抗原的树突状细胞疫苗诱导CTL的抗肿瘤效应

目的:探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外杀瘤作用及对荷瘤小鼠的治疗作用.方法:体外培养的小鼠骨髓树突状细胞用小鼠结肠腺癌细胞株CT26细胞抗原冲击致敏制备负载肿瘤抗原的DC疫苗;负载肿瘤抗原的DC疫苗激活同源T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),采用乳酸脱氢酶(LDH) 4 h释放法检测CTL在体外对CT26细胞的杀伤活性;建立CT26荷瘤小鼠模型,应用CTL治疗荷瘤小鼠,观察肿瘤大小和小鼠存活期.结果:负载CT26肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导T细胞增殖分化为肿瘤特异CTL,该CTL对CT26细胞有高效而强烈的杀伤作用,杀伤率为(83.95±11.25)%,而对B16细胞、3LL Lewis 细胞无明显杀伤作用,杀伤率分别为(12.75±5.36)%和(11.38±4.57)%.应用CTL治疗荷瘤小鼠能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠存活期.结论:负载肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导高效而特异的CTL杀瘤活性并能治疗荷瘤小鼠.提示负载肿瘤抗原的DC疫苗诱导的CTL可能在肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用.     

树突状细胞疫苗联合CpG-ODN对膀胱肿瘤细胞的免疫学效应研究

目的 探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)疫苗联合含未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)序列的寡脱氧核糖核苷酸(CpG-ODN)对膀胱肿瘤细胞的免疫学效应.方法 用小鼠BTT739细胞反复冻融抗原致敏培养第7天的DC,48h后分别加入CpG-ODN及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导DC成熟,制备负载肿瘤抗原的DC疫苗,灭活后用于刺激T淋巴细胞制备效应细胞(CTL),乳酸脱氢酶释放实验测定各组CTL对BTT739细胞的杀伤活性,ELISA法测定效应细胞培养上清液的干扰素-γ(IFN-γ)水平,同时检测了CTL对自体淋巴细胞的杀伤活性.结果负载肿瘤抗原的DC诱导的效应细胞分泌较高水平的IFN-γ,并对BTT739细胞具有较高的杀伤效应,CpG-ODN活化的DC疫苗诱导的效应细胞分泌IFN-γ水平及对肿瘤细胞的杀伤活性均高于TNF-α活化的DC疫苗诱导的效应细胞(P<0.01).DC疫苗对自体淋巴细胞无明显免疫杀伤活性.结论 CpG-ODN可增强负载肿瘤抗原的DC疫苗对膀胱肿瘤细胞的免疫杀伤效应,并且对自体淋巴细胞无免疫杀伤活性,为膀胱癌的免疫治疗提供了实验基础.     

热休克蛋白gp96肽复合物免疫治疗小鼠骨肉瘤的研究

目的研究热休克蛋白gp96（HSPgp96）肽复合物体内外特异性抗肿瘤作用。方法采用^51Cr释放法测定经HSPgp96肽复合物修饰的树突状细胞（DC）对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性的影响,同时在骨肉瘤动物模型上观察HSPgp96肽复合物与修饰后的DC对骨肉瘤的生长状况及体内免疫水平的影响。结果HSPgp96肽复合物修饰的DC可激活小鼠脾淋巴细胞,后者能对人成骨肉瘤细胞系MG-63细胞进行特异性杀伤;HSPgp96肽复合物及修饰后的DC使IL-10表达水平明显降低,IFN-γ水平明显上升（P〈0．01）,能有效抑制体内肿瘤的生长。结论HSPgp96肽复合物能很好地修饰体外诱导获取的DC,使DC具有很强的体内外抗肿瘤作用。     

Flk1胞外1-3区基因的克隆及核酸疫苗的构建

目的 :克隆并构建小鼠 Flk1胞外 1 - 3区核酸疫苗 ,并检验疫苗引起特异性免疫反应的能力。方法 :RT- PCR克隆 Flk1胞外 1 - 3区 ,构建核酸疫苗 pc DNA3.1 ( + ) -Flk1 Domain1 - 3,脂质体转染 COS7细胞 ,western- bolt检测表达 ;疫苗免疫小鼠 ;以小鼠血管内皮细胞为靶细胞 ,以免疫的小鼠脾细胞作为效应细胞 ,采用标准 4h51Cr释放法计算 CTL特异性杀伤率。结果 :扩增出 1 2 5 2 bp片段。疫苗 DNA自动测序证明所获基因片段序列阅读框架正确。Western- blot检测转染疫苗的 COS7细胞显示细胞中有分子质量为 44k Da的蛋白表达 ;疫苗组与对照组比较 ,CTL杀伤率差异有显著性。结论 :pc DNA3.1 ( + ) Flk1 -Domain1 - 3核酸疫苗可有效的引起针对 Flk1的免疫反应。     

肿瘤疫苗对小鼠肝癌作用的研究

目的 :通过动物实验评价肿瘤疫苗对肝癌的防治作用 ,为临床应用提供实验依据。方法 :用小鼠肝癌细胞系MM45T .Li经过化学修饰制成肿瘤疫苗免疫小鼠 ,然后再用该细胞系接种于小鼠腋下。分别观察免疫鼠及未免疫小鼠的肿瘤生长情况 ,进行病理学检查 ;并用3H -TdR释放法检测小鼠脾细胞对MM45T .Li细胞的杀伤能力差异。结果 :①经肿瘤疫苗免疫的小鼠的肿瘤生长速度明显低于未免疫小鼠 ;②病理学检查发现免疫鼠肿瘤组织内大量淋巴细胞浸润 ,未免疫鼠内罕见淋巴细胞浸润 ;③3H -TdR释放实验显示免疫鼠脾细胞对MM45T .Li细胞的杀伤能力明显高于未免疫鼠。结论 :按我们现行方法制备的肿瘤疫苗能激活小鼠抗肝癌的免疫反应 ,抑制肝癌的生长 ,但完全保护作用尚不明确     

IFN-γ基因修饰对G422胶质母细胞瘤细胞致瘤性及荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的：观察鼠干扰素－γ（mIFN－γ)基因修饰的小鼠G422胶质母细胞瘤细胞的致瘤性及免疫功能变化。方法：通过重组腺病毒以mIFN－γ基因转染G422胶质母细胞瘤细胞,观察肿瘤的生长和荷瘤小鼠的存活期,采用4h^51Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的NK、LAK、CTL的杀伤活性,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果：mIFN－γ基因修饰的G422小鼠胶质母细胞瘤体内致瘤生长明显抑制（P＜0．01）,对荷瘤小鼠生存时间长于对照组（P＜0．01）。mIFN－γ组小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性显增强,肿瘤组织有灶性坏死,炎细胞浸润。结论：mIFN－γ基因对胶质细胞瘤有一定治疗作用,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。     

协同刺激信号α-CD28单抗增强肿瘤特异性CTL体内外的杀瘤活性

目的采用α-CD28单抗增强α-CD3单抗刺激的肿瘤特异性T细胞的杀瘤活性。方法采用2种方案培养FBL-3免疫的小鼠脾细胞。(1)使用α-CD3单抗48h后,加入α-CD3单抗和20U/mlrIL-2(α-CD3+IL-2组);(2)α-CD3单抗和α-CD28单抗同时使用48h后,加入α-CD3单抗、α-CD28单抗和20U/mlrIL-2(α-CD3+α-CD28+IL-2组)。3H-TdR掺入法检测两组效应细胞的增殖水平。标准4h-51Cr释放法检测两组效应细胞的杀伤活性。在培养第12天,每只荷瘤小鼠过继转输1×107CTL,观察小鼠的存活期。结果α-CD3+IL-2组、α-CD3+α-CD28+IL-2组细胞的3H-TdR掺入量分别为8.36×104、1.31×105,后者明显高于前者。在培养12d时,效靶比为12.5∶1时,α-CD3+IL-2组细胞对FBL-3的特异性杀伤活性为35.6%,α-CD3+α-CD28+IL-2组细胞对FBL-3的特异性杀伤活性为49.5%。分别过继转输两组效应细胞治疗荷瘤小鼠,荷瘤小鼠的平均存活期分别为16.7和20.8d。结论协同刺激信号α-CD28单抗增强肿瘤特异性CTL体内外的杀瘤活性。     

艾氏腹水瘤细胞热休克蛋白70的抗瘤效应

目的观察从艾氏腹水瘤细胞胞浆中提纯的热休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)的抑瘤作用，并探讨其机制。方法用亲和层析提纯艾氏腹水瘤细胞的HSP70，应用体内免疫法检测HSP70的抑瘤作用，用^3H-TdR释放法检测特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性。结果与对照组相比免疫组小鼠平均肿瘤重量明显减轻、体积明显缩小，特异性CTL的杀伤活性显著增强。结论HSP70可诱导机体产生特异性杀伤活性．抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。     

基于α-病毒复制酶的基因疫苗对人黑色素瘤的免疫作用

目的研究基于α-病毒复制酶的人黑色素瘤基因疫苗免疫学作用.方法建立及鉴定人/鼠嵌合模型(trimera),将基于α-病毒复制酶的mage-3基因疫苗免疫动物,检测动物体内特异抗体滴度;用标准4 h51Cr释放实验检测动物体内特异CTL活性.结果FACS分析显示,trimera小鼠腹腔细胞中人白细胞占总细胞的88.84%,脾脏细胞中人白细胞的比例占57%,同国外文献报道一致.基于α-病毒复制酶的重组基因疫苗mage-3/pSMART2a对trimera小鼠免疫后,小鼠腹腔细胞的CTL在效靶比为100:l时杀伤率达到70%左右,此时的对照组mage-3/pCI-neo组最大杀伤率为40%左右.ELISA结果显示,重组基因疫苗mage-3/pSMART2a组产生的mage-3抗原特异性抗体效价达到1:512,mage-3/pCI-neo组为1:256.结论成功建立了人/鼠嵌合模型,并在动物体内激发出针对人黑色素瘤基因疫苗的初次免疫应答.     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。