MG-132对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化与凋亡的影响

目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG-132对体外培养的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化和凋亡的影响及其机制。方法：体外培养HK-2细胞,随机分组：对照组,TGF-β1刺激组（5ug／L）,MG-132组（2．5μmol／L）,MG-132＋TGF-融组（MG-132 2.5μmol／L孵育30min后再加TGF-β1 5μg／L）。培养24h后收集细胞,RT-PCR法检测Smurf1、Smurf2和Smad7 mRNA的表达;Western免疫印迹检测Smurf1、Smurf2、Smad7和P-IκB-α和IκB-α蛋白表达;免疫组织化学检测胞浆中Fn和α-SMA的表达;Hoechst 33258染色免疫荧光检测细胞凋亡形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：TGF-β1刺激组HK-2 Smurf1、Smurf2 mRNA及蛋白表达水平较对照组高（P〈0．05）,但Smad7 mRNA及蛋白表达水平较对照组低（P〈0．05）,且胞浆中FN和α-SMA水平较对照组高（P〈0．05）。MG-132＋TGF-β1组与TGF-β1刺激组比较,Smurf1、Smurf2 mRNA表达降低（P〈0．05）,Smad7 mRNA略升高（P〉0．05）,而Srnad7蛋白明显升高（P〈0．05）,胞浆中Fn和α-SMA表达减少。MG-132组、MG-132＋TGF-β1组分别与对照组及TGF-β1组比较,P-IκB-α和IκB-α蛋白浓度升高,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：MG-132可抑制TGF-132诱导的HK-2 Smurf1、Smurf2的表达,促进Smad7表达,抑制其降解,减轻FN和α-SMA的表达,从而抑制HK-2转分化;另-方面,MG132可能通过抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞NF-κB活化促进HK-2细胞凋亡。     

Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化和胶原I合成的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）I合成的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞），分为强力霉素（Dox）诱导组和未加强力霉素的对照组。前者予Dox诱导24h后，给予高糖刺激；后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测磷酸化（p）-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Smad7的表达；Western印迹方法检测不同时间点Smad7、α-SMA、E-钙黏蛋白（cadherin）和Col I蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调Smad7表达的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2／3（16．1％），与未加Dox的对照组比较，Dox诱导组可显著抑制高糖刺激的NRK52E细胞TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位（30.3％比58．5％，P〈0．01）。上调表达Smad7可显著抑制高糖介导的NRK52E细胞α-SMA和Col I蛋白的表达；逆转高糖介导的NRK52E细胞E-cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的合成。     

红细胞生成素对高糖诱导下肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨红细胞生成素（EPO）对高糖诱导下的肾小管上皮细胞转分化的影响。 方法 体外培养人肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）,分为正常对照组、渗透浓度对照组、高糖组、高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组。RT-PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smads信号蛋白2（Smad2）及整合素连接激酶（ILK）的mRNA表达。细胞免疫荧光法检测细胞TGF-β1及α-SMA的蛋白表达。 结果 RT-PCR结果显示,相对于对照组,高糖组细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、ILK的mRNA表达均显著上调（P ＜ 0.01）。细胞免疫化学也显示,高糖组TGF-β1和α-SMA的蛋白表达较对照组显著上调（P ＜ 0.01）,而高糖＋EPO（5 U/ml）组和高糖＋EPO（10 U/ml）组上述指标的表达均显著低于高糖组（均P ＜ 0.01）。 结论 EPO能抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,可能与其抑制TGF-β1、Smad2及ILK表达有关。     

Lefty蛋白拮抗人肾小管上皮细胞凋亡的研究

目的 探讨Lefty蛋白对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡的影响。方法采用脂质体将人Lefty质粒转染入离体培养的HK-2细胞,使其稳定表达Lefty蛋白。对正常对照组（A组）和Lefty转染组（B组）细胞给予10ng／mlTGF-β1刺激后,采用Westernblot法检测各组细胞第6、12、24、48小时磷酸化Smad2／3（p-Smad2／3）表达水平,并同时采用流式细胞术检测各组细胞凋亡程度。结果TGF131刺激后,A组p-Smad2／3表达水平和细胞凋亡程度较刺激前升高（P〈0．05）,而B组上述指标均低于A组（P〈0.05）。结论Lefty蛋白可拮抗TGF-19J／Smad信号转导通路,减轻TGF-β1介导的人肾小管上皮细胞凋亡。     

转化生长因子-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达的影响

研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3、7mRNA表达的影响。方法：用RT-PCR法分别检测TGF-β1不同浓度(0，5，50，500pmol／1：Smad3 mRNA 24h，smad7 mRNA 90min)和TGF-β1(500pmol／1)作用不同时间(Smad3 mRNA：1，2，4，24，48h；Smad7 mRNA：0．5，1，1，5，2，4，24h)对Smad3、7mRNA表达的影响。结果：Smad3 mRNA水平随TGF-β1浓度的增加而呈浓度依赖性下降；5pmol／lTGF-β1就能使Smad7 mRNA水平明显地升高，并随TGF-β1浓度加大而略有改变；随作用时间延长，Smad3mRNA水平逐渐下降，在作用48h后下降到最低，呈时间依赖性。而Smad7 mRNA水平在细胞受到TGF-β1刺激后l20min即达到最高值。结论：TGF-β1能使KFB细胞Smad3 mRNA发生配体依赖性的下调，而使Smad7 mRNA表达迅速增加。     

Smad核转录共抑因子在人近端小管上皮细胞转分化中的表达及作用

目的：观察Smad核转录共抑因子（SnoN）在TGF-β1致人近端小管上皮细胞转分化过程中的表达,探讨SnoN蛋白对TGF-β1所致的小管上皮细胞转分化的作用。方法：体外培养的人近端小管上皮细胞（HK-2）,随机分为正常对照组、TGF-β1（5ng/ml）组和TGF-β1（5ng/ml）＋MG-132（5μmol/ml）组。Western-blot检测细胞中SnoN蛋白水平的改变和Smad2/3磷酸化水平的改变;半定量RT-PCR方法观察细胞中SnoN mRNA表达的改变。免疫荧光检测间充质细胞标记物α-SMA的表达。结果：Western-blot的结果显示：（1）TGF-β1作用于细胞,SnoN蛋白表达迅速减少,10min为对照组的38%,并呈时间依赖进行性减少,60min较0min降低89%（P〈0.01）,24h有所恢复但仍较0min明显降低（P〈0.01）;TGF-β1＋MG-132组中SnoN蛋白表达与对照组差异无统计学意义,与TGF-β1组相比,SnoN蛋白水平明显上调。（2）半定量RT-PCR显示：TGF-β1作用于细胞后,与SnoN蛋白表达不同,SnoN mRNA迅速升高,60min其表达增高近1倍（与0min比较,P〈0.01）;TGF-β1＋MG-132组中SnoNmRNA的表达与TGF-β1组差异无统计学意义。（3）TGF-β1诱导细胞10min即可引发Smad2/3磷酸化（与0min比较,P〈0.01）,随着作用时间的延长,细胞中磷酸化的Smad2/3蛋白表达水平逐渐升高,TGF-β1＋MG-132组中,Smad2/3磷酸化蛋白的表达减少80%（P〈0.01）。（4）TGF-β1作用于细胞24h后免疫荧光检测到重新表达的α-SMA,TGF-β1＋MG-132组α-SMA的表达被抑制。结论：TGF-β1可诱导SnoNmRNA表达上调,但SnoN蛋白的表达遭遇泛素系统的降解显著减少,SnoN蛋白水平的下调可能是TGF-β1导致小管上皮细胞纤维化作用的必要条件。     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

高糖刺激下大鼠肾脏系膜细胞Smad7的表达及姜黄素对其表达的影响

目的：观察高糖刺激下大鼠肾脏系膜细胞（MC）smad7的表达及姜黄素对Smad7表达的影响。方法：MC分6组，对照组给予正常培养液，4组给予含30mmol／L葡萄糖的培养液，分别于6、12、24、48h后收集细胞，另1组给予含30mmol／L葡萄糖和33．33μmol／L姜黄素的培养液共孵育6h后收集细胞。分别用逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）和Western杂交分析法检测各组系膜细胞Smad7 mRNA和蛋白的表达情况。结果：正常MC有丰富的Smad7 mRNA表达，高糖刺激后表达明显增加，于6h达到高峰，Smad7蛋白的变化趋势与mRNA相同。MC加姜黄素共孵育后，Smad7 mRNA表达增加，高糖刺激6h组加或不加姜黄素，其吸光度相对值分别为1．113±0．124、2．235±0．356，Smad7蛋白吸光度值分别为12556±1335、24336±1866。结论：高糖刺激下，系膜细胞Smad7mRNA和蛋白表达呈时间依赖性，姜黄素可诱导高糖刺激下的系膜细胞Smad7表达，从而抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）目的基因的转录。     

G肽对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞转化生长因子β1活化的影响

目的观察根据血小板反应蛋白1（TSP1）分子WSHW序列人工合成的六肽（GGWSHW，G肽）对由血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1过度活化的抑制作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系（HK-2），以未处理HK-2细胞为正常对照，以AⅡ刺激HK-2细胞（AngⅡ组），选择合成TSP1和TGF-β1最佳刺激浓度和时间。刺激前加入10μmol／LG肽进行干预（G肽组），并以AngⅡ受体阻断剂洛沙坦（losartan）为抑制对照（ losartan组）。分别用RT-PCR和Western印迹检测TSP1和TGF-β1以及细胞外基质纤连蛋白（FN）和纤溶酶原活化物抑制剂-1（PAI-1）mRNA转录和蛋白表达。共聚焦显微镜和流式细胞仪观察TSP1和TGF-β1的表达以及两者共表达。ELISA法检测培养细胞上清液中活性TGF-β1、总TGF-β1、FN和PAI-1的分泌含量。Western印迹检测TGF-β1信号转导蛋白Smad2及磷酸化Smad2（p-Smad2）表达水平。结果AngⅡ以时间和剂量依赖方式促进HK-2细胞合成TSP1和TGF-β1（优化后分别为6h的1μmol／L，12h的0．1μmol／L）。与正常对照组比较，AngⅡ组TSP1与TGF-β1阳性共表达的细胞数上调5．4倍；总TGF-β1和活性TGF-β1水平分别增加1．8和2．0倍；p-Smad2蛋白水平明显上调；FN和PAI-1 mRNA转录水平分别上调3和1．5倍，且细胞上清液中两者含量分别增加2和1．9倍。G肽对TSP1和TGF-β1 mRNA转录和蛋白表达水平均无显著性影响，且对总TGF-β1分泌无明显抑制作用，但可显著抑制活性TGF-β1的水平。此外与losartan组比较，G肽组p-Smad2蛋白表达减少28．9％。FN和PAI-1 mRNA转录水平分别下调34．5％和26％，且细胞上清液中两者含量分别减少11％和8．9％。结论TSP1肽抑制物体外能通过有效竞争抑制TSP1致HK-2细胞的TGF-β1活化作用，并可相应下调FN和PAI-1的合成分泌。     

虫草素通过下调TGF-β抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化

目的：探讨虫草素对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株）,分为正常对照组（葡萄糖5.5 mmol/L,NG组）、高糖组（葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖＋虫草素组（葡萄糖30 mmol/L＋虫草素10μg/ml,HG＋C组）。分别于刺激12 h,24 h,48 h后收集细胞。应用定量RT-PCR测定NRK52E TGF-β,E-cadherin,α-SMA mRNA的表达;Western印迹方法检测TGF-β、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果：高糖刺激后NRK52E细胞的TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组（P〈0.01）,而虫草素组TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达显著低于高糖组（P〈0.05）;高糖诱导的NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平明显降低（P〈0.01）;而虫草素组NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平显著高于高糖组（P〈0.05）。结论：虫草素可以明显抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是通过下调TGF-β实现。     

黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及其机制探讨

目的：探讨黄芪对人肾小管上皮细胞细胞外基质分泌的影响及甚可能机制。方法：将体外培养的人肾小管上皮（HK-2）细胞株转板至细胞融合并同步后,分为空白对照组、转化生长因子-β（TGF-β1）刺激组（5ng／ml）、TGF-β1加黄芪100μg／ml组、TGF-β1加黄芪1mg／ml组。作用24h后半定量逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）检测纤维连接蛋白（FN）及纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）mRNA;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清液中FN的含量;westernblot检测PAI-1的表达。结果：（1）HK-2细胞表达少量FN和PAI-1;（2）HK-2细胞在5ng／ml TGF-β1．刺激下分泌FN、PAI—1mRNA及FN、PAI-1蛋白表达明显增加,与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）;（3）HK-2细胞在TGF-β1和不同浓度的黄芪作用后,可使FN、PAI-1mRNA及蛋白表达减少,与TGF-β1组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,尤以黄芪1mg／mi组为甚。结论：TGF—β1可促进HK-2细胞分泌FN和PAI—1,黄芪可部分拮抗TGF-β1的上述效应。这可能是黄芪预防或改善肾小管间质病变的作用机制之一。     

终末期糖基化终产物通过转化生长因子依赖和非依赖途径介导NRK52E细胞转分化和胶原Ⅰ的合成

目的探讨终末期糖基化终产物（AGEs）介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）Ⅰ合成的分子机制。方法体外培养正常大鼠近端肾小管上皮细胞系（NRK52E），应用自制的AGE-牛血清白蛋白（BSA）刺激NRK52E细胞。免疫细胞化学方法检测不同时间磷酸化（P）Smad2／3核转位情况。ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β1的水平。RT-PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙黏着糖蛋白（cadherin）和ColⅠmRNA表达。Western印迹检测α-SMA、E-cadherin和ColⅠ蛋白的表达。同时观察TGF-β1中和抗体对AGE-BSA上述效应的阻断作用。结果基础状态下，NRK52E细胞存在低水平p-Smad2／3核表达（16％）。与BSA对照组比较，AGE—BSA以时间依赖方式上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，其高峰出现在30min（68％比30.5％，P〈0．01）和24h（76％比31．3％，P〈0．01）。AGE—BSA显著上调α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达；下调E-cadherin mRNA和蛋白的表达；并能促进NRK52E细胞合成和分泌TGF-β1。TGF-β1中和抗体能明显抑制AGE—BSA介导的24hp-Smad2／3核转位（25．2％，P〈0．01），但不能阻抑30min活化高峰；能明显抑制AGE-BSA介导的α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达．以及显著地上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。结论AGEs通过TGF-β依赖和非依赖途径诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进其向肌成纤维母细胞转分化和ColⅠ的合成。     

EPO对马兜铃酸刺激的肾小管上皮细胞TGF-β1、Ang-Ⅱ mRNA表达的影响

目的探讨促红细胞生成素（E]PO）对马兜铃酸（AA）刺激的肾小管上皮细胞转化生长因子β1（TGF-β1）、血管紧张素-Ⅱ（Ang-Ⅱ）mRNA表达的影响。方法以10、20μg／ml AA刺激LLC-PK1细胞株,同时加入不同浓度的EPO（5、10U／m1）,另设对照组和EPO组（10U／m1）。各组细胞培养24h后,RT-PCR检测细胞TGF-β1、Ang-ⅡmRNA的表达情况。结果与对照组比较,经AA刺激后,TGF-β1、Ang-Ⅱ mRNA表达明显上调,EPO可明显下调TGF-β1 mRNA的表达并抑制Ang-Ⅱ mRNA的过高表达。结论EPO可以抑制AA所刺激的肾小管上皮细胞TGF-β1和AngⅡ mRNA的过高表达。     

马兜铃酸促进肾小管上皮细胞转分化的发生及温阳活血方干预作用研究

目的：探讨马兜铃酸（aristolochic acid,AA）在大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化中的可能作用,及温阳活血方拮抗转分化机制。方法：（1）MTT法检测不同浓度温阳活血方含药血清对NRK-52E细胞增殖的影响。（2）免疫细胞化学法检测不同浓度AA（0、5、10、20、40μg/ml）对NRK-52E细胞表达α-平滑肌肌动蛋白的影响。（3）ELISA法检测AA刺激下Col-Ⅰ的表达及温阳活血方对其调控作用。（4）Real-Time PCR法检测温阳活血方对TGF-β1mRNA、ET-1mRNA、VEGF mRNA等肾间质纤维化相关因子的调控作用。结果：（1）AA5μg/ml、AA10μg/ml、AA20μg/ml、AA40μg/ml均可刺激NRK-52E表达α-平滑肌肌动蛋白,AA10μg/ml浓度下α-平滑肌肌动蛋白表达较强。（2）AA刺激NRK-52E细胞12h、24h、48h后,Col-Ⅰ的表达水平随着时间的延长而增强。（3）马兜铃酸刺激NRK-52E细胞24h后,TGF-β1mRNA表达上调（P〈0.05）,VEGF mRNA表达显著下调（P〈0.01）,ET-1mRNA的表达显著上调（P〈0.01）,Col-Ⅰ表达水平显著高于正常对照组（P〈0.01）,温阳活血方干预下,TGF-β1mRNA表达下调（P〈0.05）,VEGF mRNA表达显著上调（P〈0.01）,ET-1mRNA有下调趋势,Col-Ⅰ表达水平显著下调。结论：（1）马兜铃酸可促进肾小管上皮细胞转分化的发生。（2）温阳活血方具有拮抗肾小管上皮细胞转分化作用。     

甘草酸二胺对输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的治疗作用及机制

目的：探讨甘草酸二胺对肾间质纤维化的作用及其机制。方法：以Wistar大鼠单侧输尿管梗阻（UUO）为模型，在不同的时间点（7d、14d、28d）观察梗阻侧肾间质纤维化指数；致纤维化的转化生长因子β1（TGF-β1）的表达情况；肾皮质中与肾脏纤维化相关的Smurf2、Smad7信号蛋白等的mRNA及蛋白表达。结果：（1）随着梗阻时间的延长，肾间质纤维化程度逐渐加重，Smurf2基因和蛋白质明显上调，呈时间依赖性（P〈0．01）；Smad7蛋白呈时间依赖性下调（P〈0．01），Smad7基因在各个时间点无明显变化；TGF-β1基因在UUO后第7d达高峰，此后逐渐下降，但仍然高于假手术组（P〈0．01）。（2）甘草酸能改善UUO所致的肾间质纤维化程度（P〈0．01），下调肾脏组织TGF-β1基因的表达（尸〈0．01）；减少Smurf2基因和蛋白质的表达，同时上调TGF-β1信号传导中抑制性因子Smad7的表达（P〈0．01）。结论：甘草酸二胺能保护UUO所致的肾间质纤维化损伤。其可能的作用机制为减少Smurf2核酸和蛋白质的表达，增加抗纤维化作用的Smad7蛋白表达；减少TGF-β1表达，阻止TGF-β1信号传导，从而阻断肾间质的纤维化。     

Smad 2,3,6,7蛋白在实验性肾间质纤维化模型中的定位和表达变化

目的 研究Smads蛋白在实验性肾纤维化模型中的定位和表达变化。方法 36只Wistar大鼠随机分为正常大鼠组，假手术组和单侧输尿管梗阻组3组，分别于术后3d,7d,14d,21d处死大鼠。采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测TGF-β1mRNA表达水平，用免疫组织化学和Western杂交分别检测Smad2,Smad3,Smad6及Smad7蛋白的定位和表达。纤维化程度通过测定肾组织羟脯氨酸含量来判断。结果 与对照组相比，TGF-β1mRNA于第3天起表达即见进行性增高，并伴有肾组织羟脯氨酸含量的明显增高。Smad2,3蛋白主要在肾小管表达，肾小球偶见；Smad6，7蛋白主要在肾小球和肾小管上皮细胞内均有表达，输尿管梗阻后，Smad2,3蛋白表达逐渐增加，而Ｓmad6,7蛋白却逐渐减少。结论　ＴＧＦ－β1/Smad信号通路参与了肾间质纤维化进程，抗Smad蛋白表达下降可能是该模型TGF-β1致肾纤维化作用的主要原因。     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化和胶原Ⅰ合成的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和胶原(Col)Ⅰ合成的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK52E细胞),分为强力霉素(Dox)诱导组和未加强力霉素的对照组。前者予Dox诱导24 h后,给予高糖刺激;后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测磷酸化(p)-Smad2/3核转位情况;RT-PCR检测Smad7的表达;Western印迹方法检测不同时间点Smad7、α-SMA、E-钙黏蛋白(cadherin)和ColⅠ蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调Smad7表达的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2/3(16．1％),与未加Dox的对照组比较,Dox诱导组可显著抑制高糖刺激的NRK52E细胞TGF-β受体调控信号蛋白Smad2/3的活化和核转位(30．3％比58．5％, P<0．01)。上调表达Smad7可显著抑制高糖介导的NRK52E细胞α-SMA和ColⅠ蛋白的表达;逆转高糖介导的NRK52E细胞E-cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过TGF-β受体调控信号蛋白Smad2/3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的合成。     

晚期糖基化终末产物对人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子和纤维连接蛋白的影响

目的：观察AGE-BSA认对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株HK-2表达结缔组织生长因子（CTGF）和纤维连接蛋白（FN）的影响。方法：将HK-2细胞在体外与不同浓度的AGE—BSA和BSA共同培养。以酶联免疫法（ELISA）检测转化生长因子-β1（TGF-β1）的分泌，以逆转录-聚合酶联反应法（RT—PCR）测定CTGF mRNA和FN mRNA的表达。结果：100μg／ml的AGE—BSA刺激HK-2细胞24h，细胞上清中TGF-β1的浓度是对照组的2.37倍。AGE—BSA刺激HK-2细胞48h后，CTGF mRNA的表达开始出现显著升高（P〈0.01）。AGE—BSA能够剂量依赖性的上调HK-2细胞CTGF mRNA和FN mRNA的表达。BSA刺激组没有以上作用。结论：AGE—BSA可上调HK-2细胞CTGF和FN的表达，这可能在糖尿病肾病肾小管间质纤维化形成中起到一定作用。