抗盐酸克伦特罗人源ScFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选盐酸克伦特罗(CLB)人源单链可变区(ScFv)抗体,为研究快速检测试剂(盒)提供基础依据.方法 采用噬菌体表面展示技术,以CLB作为抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选抗CLB的60个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与CLB结合活性较强的ScFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XLI-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;并对CLB ScFv的编码基因序列分析.结果 经过筛选60个克隆中有15株克隆ELISA的吸光度(A490nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定有7株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;DNA为750 bp;经BLAST分析,此片段属于新抗体基因序列,GenBank注册号为:EU681272.结论 本实验用噬菌体抗体库技术能够初步获得抗CLB的ScFv抗体,为下一步其特异性亲和力的研究创造了条件.     

抗氯菊酯人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选氯菊酯人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以氯菊酯作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗氯菊酯的100个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与氯菊酯结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定Sfi Ⅰ/Not Ⅰ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠杆菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选100个克隆中有18株克隆ELISA的吸光度（A值）-490 nm波长（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有5株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符;为下一步其特异性亲和力的研究创造了条件.     

乙肝病毒核心抗原人源单链可变区抗体的筛选

目的　筛选、鉴定乙型肝炎病毒 (HBV)核心抗原 (HBcAg)蛋白的人源单链可变区抗体 (ScFv)的编码基因 ,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗HBV的基因治疗研究奠定基础。方法　采用噬菌体表面展示技术 ,以HBcAg蛋白为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的HBcAg人源单链可变区抗体阳性克隆 ,并对其进行免疫检测及序列测定。结果　筛选得到的ScFv片段编码基因为 771nt,编码的产物由 2 5 7个氨基酸残基组成 ,具有典型的轻链和重链可变区结构特点以及与HBcAg结合的特异性。结论　利用噬菌体抗体库技术成功地获得了HBcAg人源单链可变区抗体的编码基因 ,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

抗脂多糖单链噬菌体抗体在大肠埃希菌中的表达及筛选

目的研究小鼠鼠源性的抗脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)单链可变区片段(single-chain fragment variable, ScFv),即在大肠埃希菌TG1中的表达,并筛选出对LPS具有较高亲和力的ScFv. 方法将预先构建好的有效库容量为4.75×106的噬菌体抗体库接种至SOBAG培养基上,隔夜培养后扩容至约1×1010;严格控制lac启动子的表达,仅当加入M13KO7辅助噬菌体后才使ScFv以附着型的形式表达,然后利用LPS淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1;最后随机挑选出190个菌落在96孔培养板分别培养单个含特异性ScFv的TG1菌落,经间接ELISA检测抗LPS的ScFv. 结果淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,190个菌落经间接ELISA检测有两个阳性克隆.结论成功地使鼠抗LPS ScFv在大肠埃希菌中表达,并从中筛选出了两株抗LPS ScFv.     

人源抗恶性疟原虫单链抗体库的制备及鉴定

目的通过噬菌体展示技术构建人源抗恶性疟原虫单链抗体库(ScFv),从中筛选出高亲和力的抗体基因片段,为进一步单链抗体表达打下基础。方法收集患者新鲜外周血,进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,提取总RNA经RT-PCR扩增出人源抗体重链和轻链抗体库,采用用重叠延伸拼接法将VH与VL以Linker相连组装成单链抗体基因(ScFv),将ScFv基因片段连接至载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG 1感受态细胞,构建的鼠源性抗恶性疟原虫天然噬菌体抗体库。结果从20个噬菌体克隆中筛选到15个具有弓形虫可溶性抗原结合活性的阳性克隆。结论从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗恶性疟原虫单链抗体的策略是可行的。     

用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建全人源噬菌体单链抗体库

目的构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，为筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定基础。方法采用体外致敏与EB病毒（EBV）转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞（PBMC），提取总RNA，用RT—PCR技术扩增人抗体重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因，用编码（Gly4Ser）3的互补序列连接成单链抗体ScFv基因（VH-linker—VL），并克隆到噬菌粒载体FUSE5，转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库。结果成功地构建了全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，库容量为6．5×10^7，约100％的噬菌体基因中有ScFv基因的插入。结论联合应用体外致敏和EBV转化及噬菌体呈现技术构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库是可行的，这为进一步筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定了基础。     

人源抗HIV-1V3环噬菌体抗体筛选与鉴定

目的 以人类免疫缺陷病毒(HIV-1)gp120 V3环的合成环肽为抗原,从人的噬菌体抗体组合文库中筛选出与抗HIV-1 V3肽有结合活性的人源噬菌体抗体(Fab段).方法 用噬菌体抗体库技术筛选人源抗HIV-1V3环噬菌体抗体,ELISA测定其活性,竞争抑制实验证实了该噬菌体抗体的特异性.结果 序列分析表明.重链基因为IgG1亚类,可变区属VHI亚群.与胚系基因DP-88同源性最高,D区为D3-3、J区为JH5;轻链为k亚型.可变区属VL IV亚群,D区为DPK22,J链为Jk4胚系.结论 成功筛选了人源抗HIV-1 V3环噬菌体抗体.其具有很好的生物学活性和特异性.     

全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定

目的从全人源抗鼻咽癌噬菌体抗体库中筛选特异性单链抗体（ScFv）,并对其特异性进行鉴定。方法通过噬菌体表面展示技术把ScFv表达在噬菌体表面,以鼻咽癌细胞作为抗原,用抗原递减法,通过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体,及ELISA筛选,获得特异阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序。结果通过对抗体库进行三轮正负淘洗和富集后,随机挑选4212个克隆进行ELISA,发现3个克隆对CNE2呈强阳性反应,而与人正常细胞系HUVEC等呈弱阳性反应或不反应。对克隆HNSA033进一步进行免疫细胞化学验证,结果与ELISA反应一致;免疫组织化学鉴定表明克隆HNSA033与鼻咽癌组织和鼻咽组织阳性率的差别有统计学意义。结论通过淘选富集、ELISA和免疫化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆,为鼻咽癌发病机制的研究和临床诊断以及治疗奠定了基础。     

人源化抗CD3单链抗体的构建、序列分析和表达研究

目的构建和表达抗CD3单链抗体,并对其构象进行模拟分析.方法应用重叠延伸拼接法连接抗CD3抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,构建抗CD3单链抗体基因(ScFv),并将其克隆于原核表达载体中表达.结果拼接后的抗CD3ScFv基因全长732bp,构象模拟分析表明其三维结构稳定,兼容性分数S＞0,表达的目的蛋白约26.5kD.结论抗CD3ScFv基因的成功构建,为进一步研究抗CD3/抗乙肝病毒的双特异性抗体奠定了基础.     

A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定

目的　从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2 15 1中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础。方法　经过连续三轮固相“亲和-洗脱-富集”筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS PAGE和Western blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物。采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析。结果　从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3。其A4 50 分别达到0 . 4 6 9、0 . 5 82和0 . 5 0 7。A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4 0 .96倍,ELISA结果仍为阳性。结论　利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体。