慢性粒细胞白血病断裂点簇集区－abl融合基因的检测

应用改良的一步法ＲＮＡ提取方法分离慢性粒细胞白血病（慢粒）患者外周血或骨髓标本总ＲＮＡ，以慢粒急性红白血病变细胞株为阳性对照，急件早幼粒细胞性白血病细胞株为阴性对照，建立逆转录／套式聚合酶链反应（ＲＴ，套式ＰＣＲ）检测断裂点簇集区一ａｂｌ融合基因。第一次ＰＣＲ的灵敏度为１：１０￣４水平，第二次ＰＣＲ后灵敏度提高至１：１０￣５水平。特异性扩增产物经用地高辛素标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交得到证实。     

bcr/abl融合基因和慢性粒细胞白血病

bcr/abl融合基因酪氨酸激酶活性异常在慢性粒细胞白血病发病分子机制中起重要作用,其表达物bcr/abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病分型的重要依据,检测此基因对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗和病情观察具有重要临床意义.     

RT—PCR一步法检测慢性粒细胞白血病bcr／abl融合基因

应用ＲＴ－ＰＣＲ一步法检测了４２例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者的ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，均显示ｂｃｒ／ａｂｌ基因阳性，其中２１例为１６８ｂｐ扩增带，１８例为９３ｂｐ扩增带，３例同时具有１６８ｂｐ和９３ｂｐ二条扩增带。ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因检测，对ＣＭＬ的诊断、治疗及预后判断均有重要意义。ＲＴ－ＰＣＲ一步法特异性好，敏感性高，简单快速，可节省试剂，值得推广应用。     

bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断及残留病灶监测中的应用

目的探讨bcr/abl融合基因检测在诊断慢性粒细胞性白血病(CML)和监测CML残留病灶中的意义。方法采用巢式逆转录PCR(RT-PCR)检测337例CML患者bcr/abl融合基因的表达,并对所有患者进行残留病灶的动态监测,共检测632人次。其中移植(包括外周血干细胞移植、骨髓移植和脐血移植)患者26例;服用格列卫的患者22例;其它治疗方案患者289例。结果在337例CML初诊患者中bcr/abl基因表达阳性者325例,阳性率为96.4%;其中b3a2型转录本占58.5%(190/325),b2a2型转录本占41.2%(134/325),b3a3型转录本占0.3%(1/325)。未发现b2a3型转录本。移植患者bcr/abl融合基因转阴率为88.5%(23/26),时间在30~201 d之间,中位数为55 d;服用格列卫患者融合基因总转阴率59.1%(13/22),转阴时间在用药后90~365d之间,中位数为210 d;其它治疗组患者转阴12例,转阴率为4.1%(12/289)。结论bcr/abl融合基因的检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效及预后判断具有重要意义。     

慢性粒细胞性白血病bcr/abl基因检测的临床意义

目的探讨慢性粒细胞性白血病(CML)bcr/abl基因检测的临床意义。方法采用荧光定量PCR(FQPCR)检测112例CML患者bcr/abl融合基因的表达。结果对照组bcr/abl基因表达均为阴性。112例CML患者bcr/abl基因表达阳性率为88.39%(99/112),表达值范围(3.2～7.8)×107copies/L;67例CML患者费城染色体(Ph染色体)分析结果中,51例为Ph(+)/bcr(+),5例为Ph(-)/bcr(+),9例Ph(+)/bcr(-),2例Ph(-)/bcr(-);17例CML患者α干扰素(INFα)治疗前bcr/abl基因表达均值为(2.60±0.9)×107copies/L,INFα治疗后为(1.82±0.57)×107copies/L,两者具有显著性差异(P<0.05)。结论bcr/abl基因表达水平的定量检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效判断及预后具有重要意义。     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。     

Ph染色体bcr/abl融合基因在诊断慢性粒细胞白血病中的意义

目的 慢性髓系白血痛(CML)的细胞遗传学特征是具有Ph染色体,即t(9;22)(q34;q11),其结果在分子水平上形成bcr/abl融合基因探讨慢性髓性白血病Ph染色体及bcr/abl融舍基因检测对CML早期诊断、分型诊断及指导治疗的临床意义.方法 用直接法或24h短期培养法常规G显带后分析,观察有无Ph染色体,PCR方法检测bcr/abl融合基因,结合形态学特征对51例CML进行分型诊断.结果 51例患者中Ph+/bcr/abl+或Ph-/bcr/abl+共48例诊断为典型慢性粒细胞白血病(CGL)占94%,其中1例为妊娠合并慢拉白血病;Ph-/bcr/abl-3例占6%,其中2例为非典型慢性粒细胞白血病(a-CML),1例为慢性粒单棱细胞白血病(CMML).结论 Ph染色体及ber/abl融合基因检测将CML患者进一步区分为三型:典型(Ph+/ bcr/abl+或Ph-/bcr/abl+)慢性粒细胞白血病(CGL)、非典型(Ph-/bcr/abl-)慢性粒细胞白血痛(a-CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML).对慢性髓系白血病的明确诊断、早期有效治疗具有重要的临床意义.     

自身淬灭荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA

目的利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法，为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病（MRD）的监测提供有效手段。方法用逆转录PCR方法（RT—PCR）扩增K562细胞的bcr／abl融合基因，A-T克隆法构建定量标准模板；设计自身淬灭荧光引物（探针），建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法（FQ—RT—PCR），并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测；然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr／abl mRNA。结果建立的FQ—RT—PCR方法可检测10copies／μl的bcr／abl重组质粒，并能从10^5个正常细胞中检出1个白血病细胞，该方法的批内、批间变异系数（CV）分别为2．1％、6．1％，线性检测范围为10^2-10^9copies／μl。25例CML患者bcr／abl融合基因mRNA表达量中位数为4．50×10^4[（0．45—89．00）×10^4]copies／μg RNA，其中11例慢性期初诊患者bcr／abl mRNA表达量中位数为5．45×10^4[（2．95—19．30）×10^4]copies／μg RNA，6例急变期患者bcr／abl mRNA表达量中位数为13．00×10^4[（4．10～89．00）×10^4]copies／μg RNA，8例慢性期治疗后复查患者bcr／abl mRNA表达量中位数为2．35×10^4[（0．45—5．12）×10^4]copies／μg RNA，CML急变期患者bcr／abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义（q=3．41，P〈0．05）。PCR产物经电泳分析，其中21例CML患者为b3a2型，4例CML患者为b2a2型；3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，1例有bcr／abl mRNA表达，为b2a2型。结论所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于标准统一。可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测。     

慢性髓性白血病bcr／abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

慢性髓系白血病不同bcr/abl融合基因转录子与临床关系的研究

目的研究慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因转录子类型与临床的关系.方法采用RT-PCR技术检测537例临床怀疑CML的患者新鲜骨髓标本三种bcr/abl(M、m及μ型)融合基因的表达.结果 479例CML患者 M-bcr/abl阳性,其中慢性期(CP)370例,加速/急变期(AP/BC)109例,CP期和AP/BC期患者表达b2a2型融合基因转录子的百分率分别为32.4%(370例中120例)及36.7%(109例中40例)(P>0.05),急淋变及急髓变患者b2a2型百分率分别为52.6%(19例中10例)及33.3%(90例中30例) (P>0.05);b3a2型患者初诊时外周血血小板数明显高于b2a2型患者[(485.9±333.8)×109/L] vs [(380.5±321.9)ⅹ109/L](P<0.05);66.0%CP及64.4%AP/BC患者同时表达M-bcr/abl及m-bcr/abl;1例单纯m-bcr/abl(+)患者表现为急性髓系白血病(AML);2例μ-bcr/abl(+)患者均具有典型CML表现.结论典型CML患者几乎均为M-bcr/abl融合基因阳性,大部分患者同时伴有m-bcr/abl表达,个别CML患者可以为μ型;除了急性淋巴细胞白血病(ALL)外,单纯m-bcr/abl(+)也可见于AML或CML急粒变的患者; b3a2型患者初诊时更易有血小板数增高表现.     

bcr/abl融合基因在白血病中的表达及临床意义

bcr/abl融合基因酪氨酸激酶活性异常在慢性粒细胞白血病发病分子机制中起重要作用,其表达物bcr/abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病分型的重要依据,检测此基因对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗和病情观察具有重要临床意义.bcr/abl融合基因阳性也可能存在于其他类型的疾病中,有关这方面的问题是目前血液学研究的热点之一.     

bcr—abl融合基因及其检测

bcr-abl融合基因位于染色体t(9;22)(q34;q11),由位于9号染色体上的细胞原癌基因abl部分序列从其正常位置易位至22号染色体的BCR区而形成。在绝大多数病例中,断裂点集中在5.8 kb的M-BCR区,主要形成b2a2和b3a2二种形式的转录物及蛋白质,二者差异仅为75个碱基及25个氨基酸。bcr-abl融合基因及其表达的检测对CML有重要的诊断与预后价值。用Southern印迹杂交、间期或中期染色体原位杂交等方法检测DNA,发现Ph阴性或变异型Ph病人存在bcr-abl融合基因,检测到许多新的融合类型,并确认异基因BMT后白血病的复发是源于自身MRL。用优化的RT-PCR,定量RT-PCR或RNA原位杂交检测RNA,可精确定位罕见或混合的接合型,还发现正常人中bcr-abl基因有低量表达且有随年龄增长而增加的趋势。用Western印迹或酶联免疫反应检测,发现BCR-ABL蛋白与C-ABL蛋白之比在外周血与骨髓中相似且与Ph染色体重排率有线性关系,还发现如果P190继P210之后出现,则CML的预后很差。     

一步法RT-PCR检测慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因

目的：建立一步法RT-PCR检测CML患者BCR—ABL融合基因的实验方法。方法：Trizol试剂提取细胞RNA,用特异引物一步法RT—PCR检测BCR—ABL融合基因．并作灵敏度试验。结果：本方法的灵敏度可达到10pg水平。对25例CML患者检测BCR-ABL融合基因,阳性率为100％．并可检测出BCR—ABL融合基因各种融合方式。结论：一步法RT—PCR检测BCR-ABL融合基因有很好的灵敏度和特异性,操作简便、快速,特别适用于临床检测。     

联合应用FISH和巢式RT-PCR技术检测慢性髓系白血病bcr/abl融合基因

目的 检测慢性髓系白血病(CML)bcr／abl融合基因，协助临床诊断。方法 联合应用荧光原位杂交(FISH)、Northem杂交和巢式RT—PCR技术。结果 在16例被检测的CML患中，有3例两种方法的结果不一致，经Northem杂交验证发现，RT—PCR较FISH更敏感，但存在假阳性；另外，FISH较容易检测到bcr／abl融合的少见类型，而巢式RT—PCR需要同时设计多对特殊引物，否则极易漏诊。结论 联合应用FISH和巢式RT—PCR技术检测CML bcr／abl融合基因可以优势互补，使结果更加准确、可靠，更适合于临床诊断、疗效判定以及对微量残留病的监测。     

筑巢式PCR检测22例慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因结果分析

目的：探讨bcl/abl融合基因在慢性粒细胞白血病（CGL）的诊断、治疗和预后判断的价值。方法：对22例CGL患者作筑巢式逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测bcr/abl融合基因。结果：22例CGL患者中21例bcr/abl融合基因阳性，阳性率为95．5％。结论：筑巢式KPCR是一种快速、敏感而准确的检测方法。     

m-bcr/abl融合基因型慢性粒细胞性白血病临床和实验室研究

目的研究2例表达m型（ela2）bcr／abl融合基因慢性期慢性粒细胞性白血病（CML-CP）患者的临床及实验室特征。方法患者骨髓细胞分别用R带技术进行染色体核型分析．流式细胞术进行免疫分型，RT-PCR进行bcr／abl融合基因检测，治疗采用羟基脲、阿糖胞苷或羟基脲、HA（高三尖杉酯硷，阿糖胞苷）及干扰素方案。结果2例患者染色体核型均为：46，XY，t（9,22）（q34；q11）；免疫分型：CD13、CD15、CD33阳性．其中例2同时表达CD10抗原（34．35％）：RT-PCR分析例1初诊时M型bcr／abl融合基因阳性（b3a21，治疗后M型bcr／abl转阴而m型bcr／abl（ela2）阳性，例2初诊时即为M型bcr／abl融合基因阴性而in型bcr/abl（ela21阳性：两例患者骨髓像及临床均表现为慢性期．但例2外周血白细胞计数增高不显著（15～47&#215;10^9／L），脾脏不肿大。结论 m-bcr／ablCML是罕见的CML分子亚型。具独特的临床和实验室特征，其发现对于临床诊断和生物学研究具有重要的意义。